Summary
Простой, быстрый метод определения осахаривания потенциал большого числа образцов растительной биомассы описывается. Автоматизированная платформа для данного анализа заключается в подготовке растительной биомассы для анализа в 96-луночных и последующего выполнения предварительной обработки, гидролиз и количественное определение сахара освобождены.
Abstract
Полисахариды, входящие в состав завода лигноцеллюлозных биомассы можно разбить, чтобы произвести ряд сахаров, которые впоследствии могут быть использованы в создании переработке биологических веществ. Это сырье будет представлять собой новую производственную площадку, которая одновременно устойчивым и нейтральным уровнем эмиссии углерода, приходящая на смену текущей зависимости от ископаемых видов топлива. Непокорностью к деконструкции наблюдается в лигноцеллюлозных материалов производится несколькими внутренними свойствами стен растительной клетки. Кристаллическая целлюлоза встроен в матрицу полисахариды, такие как xylans и arabinoxylans, и вся конструкция заключена по фенольных полимер лигнин, который также трудно переварить 1. С целью улучшения усвояемости растительных материалов, мы должны обнаружить основные препятствия для осахаривания клеточных стенок, а также экран мутанта и гнездящихся популяций для оценки изменчивости осахаривания 2. Эти задачи требуют высокой пропускной способности и подход здесь мы представляем аналитическую платформу, которая может выполнять осахаривания анализа в 96-луночный планшет формата. Эта платформа была разработана для скрининга лигноцеллюлозы усвояемость большой численностью населения от различных видов растений. Мы сократили объемы реакции для щадящей предварительной обработки, частичная ферментативного гидролиза и сахар решимости, чтобы позволить больших количествах, чтобы оценить быстро в автоматизированной системе.
Это автоматизированная платформа работает с миллиграмм количество биомассы, выполняя мяч фрезерные в контролируемых условиях для снижения растительных материалов для стандартизированного размера частиц в воспроизводимым образом. Как только образцы земли, автоматизированный робот, форматирование обходится определены и записаны количество материала в соответствующие лунки по 96 глубоких скважин пластины (рис. 1). Как правило, мы обойтись и тот же материал на 4 скважинах иметь 4 повторяет для анализа. После пластин заполнены растительного материала в нужный макет, они вручную переместить на жидком станции обработки (рис. 2). В этой станции образцы подвергаются предварительной обработке мягкой либо с разбавленной кислотой или щелочной и инкубировали при температуре до 90 ° C. Предварительная обработка решение последовательно удаляется и образцы промывали буфером для их возвращения в подходящий рН для гидролиза. Затем образцы инкубировали с ферментом смеси для переменной времени при температуре 50 ° C. Аликвоту берется из гидролизатов и редуцирующих сахаров, автоматически определяется MBTH колориметрическим методом.
Protocol
1. Подготовка образцов
Мы обычно работаем со стеблями, либо из травянистых или древесных растений. В случае травянистых материалов мы выращиваем растения до погашения, а после развития семян, которую мы собираем сухие стебли раз старения является полным. Стебли нарезанные на 4 сегмента мм и помещен в 2 мл флаконах с тремя шарами фрезерования. В случае древесных материалов, образцы измельчают до грубого опилки с файлом дрова и затем помещается в шаровой мельнице для дальнейшей обработки.
Образцы помещают в стойку внутри шлифования / форматирование станции (рис. 1). Эта станция последовательно измельчает, смешивает, а вес каждого образца. Количество повторений необходимо на один образец устанавливается испытание измельченного материала в серии предварительных экспериментов, где внутренняя изменчивость определенного размера частицы определяется. 2 мл флаконы пронизаны на дне и материалы выдаются на вибрацию флакона по выбранному хорошо. Вибрирующей руке находится под контролем обратной связи от баланса позволяет точное дозирование порошка. Робот распределяет 4 мг / лунку в стандартный анализ и 4 повторений необходимы в большинстве случаев. Это позволяет 20 образцы растений / пластины для анализа.
2. Предварительная обработка
Как только образцы отформатирован, 96-луночных обрабатывается автоматизированной системой обработки жидкости (рис. 2). Здесь мягкий предварительная обработка производится на растительных материалов путем добавления 350 мкл кислоты или щелочи и нагревания пластины на адаптированы блока. Чтобы избежать испарения при анализе 96-луночных уплотнены силиконовым матовым. Температуры и времени предварительной обработки может быть изменена в соответствии с материалами изучается. Максимальная температура, однако, составляет 100 ° C. Альтернативная процедура для тестирования жестких предварительной обработки является для предварительной обработки материалов в автономном режиме и устранения pretreatmet от процесса.
3. Гидролиз
- После предварительной обработке материалов, робот автоматически удаляет предварительной обработки решение, и моет, все колодцы, 5 раз с 850 мкл 25 мМ ацетатного буфера. Полоскания осуществляется путем добавления буфера для предварительной обработки решение, а затем удаление 50% от общего объема после учета твердых частиц в образце, чтобы обосноваться. Высота стремление устанавливается на половине массы жидкости, чтобы избежать аспирации твердых частиц от дна ямы, есть незначительная потеря твердых тел с помощью этого подхода. После этих моет рН в скважине составляет 4,5 и материал будет готов для ферментативного гидролиза.
- Фермент смеси, содержащей решение целлюлазы и hemicellulases добавляется робота. В каждую лунку, 850 мкл фермента смесь разливают и пластина перемещается в 50 ° C пожимая инкубатора. Стандартный гидролиза проводят в течение 8 часов, но на этот раз может быть адаптирована к цели эксперимента. Стандартные загрузки фермент используется для трав составляет 7 FPU / г материала.
4. Определение редуцирующих сахаров
Определение редуцирующих сахаров освобожден после гидролиза проводили с использованием модифицированной 3-метил-2-benzothiazolinone hydrozone (MTBH) метод 3. MBTH был выбран как наиболее подходящий метод, потому что это был самый легкий для автоматизации и наименее чувствительны к помехам от соединения, такие как белки. Мы изменили это очень чувствительный метод для использования на платформе робота, чтобы он мог точно количественно сахара в концентрациях присутствует в биомассе гидролизатов, в конечном объеме 250 мкл, которая пригодна для стандартных оптических 96 ячейках. Все действия выполняются автоматически и три независимых определения редуцирующих сахаров проводились для каждой осахаривания реакции.
- 30 мкл гидролизата было взято из глубокого колодца пластины и смешивают с 45 мкл 25 мМ буферного раствора ацетата натрия в обогнул ПЦР 96-луночного планшета.
- 25 мкл 1 н NaOH и 50 мкл раствора, содержащего 0,43 мг / мл MBTH и 0,14 мг / мл DTT были добавлены.
- После смешивания пластины ПЦР нагревали при 60 ° С в течение 20 мин в амплификаторе или аналогичного устройства, которое обеспечивает именно такое же количество тепла, чтобы все 96 лунок.
- Полученную реакционную был переведен в оптическом пластины.
- Добавить 100 мкл окислительного реагента (0,2% FeNH4 (SO4) 2, 0,2% сульфаминовой кислоты и 0,1% HCl). Хорошо перемешать и оставить развиваться, по крайней мере, 1 ч.
- Каждая пластина должна также содержать стандартных реакций из 50 нмоль, 100 и 150 нмоль нмоль глюкозы. Оптические пластины читаются при 620 нм.
5. Представитель Результаты:
Примеры различных видов анализа представлены на рисунке 3 и 4. Все результаты были получены с помощью автоматизированной платформы. Рисунок 3 повторнопредставляет увеличения редуцирующих сахаров выпущен на 8 ч инкубации с земли тополя с увеличением количества целлюлолитических ферментов. На рисунке 4 представлена последствий кислых и щелочных предварительной обработки на тополь образцов. Предварительная обработка NaOH является более эффективным, что разбавленный H2SO4 предварительной обработки для облегчения выпуска сахара в процессе гидролиза. Количество сахара измеряется после гидролиза уменьшается при предварительной обработке осуществляется с помощью NaOH концентрациях выше 1М.
Рисунок 1. Роботизированная станция для шлифования и 96 также форматирование биомассы
Рисунок 2. Жидкие станции обработки для анализа Высокая пропускная осахаривания
Рисунок 3. Влияние различных нагрузках фермента об освобождении снижения сахара эквивалентов от тополя образцы
Рисунок 4. Влияние различных предварительной обработки на осахаривания тополя образцов. А. Сахаров освобожден после pretreament с различными процент H2SO4 при 90 ° С в течение 30 минут. Б. Сахаров освобожден после предварительной обработки NaOH при той же температуре и времени, чем кислоты предварительной обработки .
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Viksø-Нильсен (Novozymes) за дар целлюлолитических ферментов. Эта работа финансировалась FP7 ОБНОВЛЕНИЕ и СИББН проектов BB/G016178 и BB/G016194.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grinding & weighing robot | Labman Automation | ||
| 2 ml micro tube with caps | Sarstedt Ltd | 72.694 | |
| 5 mm stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| 1.2ml Abgene square well storage plates | Fisher Scientific | TUL-050-050C | |
| Whatman cap mat for 96 square well plates | Fisher Scientific | 7704-0104 | |
| Liquid hanling robot | Tecan Group Ltd. | Freedom Evo 200 | |
| Sulphuric acid | Fisher Scientific | S/9231/PB17 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | BPE359-500 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750-500G | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A/0420/PB17 | |
| Novozyme 188 | Novozyme | DCN00214 | |
| Celluclast 1.5L | Novozyme | CCN03122 | |
| 96 well PCR full skirt plates | Sarstedt Ltd | 72.1980.202 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | G/0450/53 | |
| 3-Methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | 129739-25G | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9163-1G | |
| Corning microplate 96 well flat bottom | Fisher Scientific | TKT-521-050H | |
| Ammonium iron (III) sulfate dodecahydrate | Sigma-Aldrich | F1668-250G | |
| Sulfamic acid | Sigma-Aldrich | 242772-500G | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | 12462-0026 |
References
- Carpita, N. C. Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).
- Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls. New Phytol. 178, 473-485 (2008).
- Anthon, G. E., Barrett, D. M. Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone. Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).
- Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials. Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).
