Summary
En enkel och snabb metod för att bestämma försockringen potential stort antal prover växtbiomassa beskrivs. Den automatiserade plattform för denna analys består i att anläggningen biomassa för analys i 96 brunnar och den efterföljande prestanda förbehandling, hydrolys och kvantifiering av den frigjorda socker.
Abstract
Polysackarider som utgör anläggningen lignocellulosa kan brytas ned för att producera en rad olika sockerarter som sedan kan användas i upprättandet av ett bioraffinaderi. Dessa råvaror skulle innebära en ny industriell plattform, som är både hållbar och koldioxidneutral, att ersätta det nuvarande beroendet av fossila bränslen. Den motspänstighet att dekonstruktion observerats i lignocellulosa är producerad av flera inneboende egenskaper växternas cellväggar. Kristallin cellulosa är inbäddad i matrisen polysackarider som xylans och arabinoxylaner, och hela strukturen är inkapslad av fenol polymer lignin, som är också svårt att smälta 1. I syfte att förbättra smältbarheten av vegetabiliskt material vi behöver för att upptäcka de viktigaste flaskhalsarna för försockring av cellväggarna och även skärmen mutant och populationer avel för att bedöma variationen i försockring 2. Dessa uppgifter kräver en hög genomströmning metod och här presenterar vi en analytisk plattform som kan utföra försockringen analys i ett 96-brunnar format. Denna plattform har utvecklats för att screening av lignocellulosa smältbarhet av stora populationer från olika växtarter. Vi har skalat ner reaktionen volymer för skonsam förbehandling, partiella enzymatisk hydrolys och socker beslutsamhet, så att ett stort antal som ska bedömas snabbt i ett automatiserat system.
Denna automatiserade plattform fungerar med milligram mängder biomassa, utföra bollen fräs under kontrollerade förhållanden för att minska växtmaterial till en standardiserad partikelstorlek på ett reproducerbart sätt. När proverna marken, delar ut den automatiska formateringen roboten specificerade och inspelade mängder av material till motsvarande brunnar på 96 djupa brunnar (Figur 1). Normalt dosera vi samma material i 4 brunnar har 4 replikat för analys. När plattorna är fyllda med växtmaterial i önskad layout, de är manuellt flyttas till en vätskehantering station (Figur 2). I denna station proverna utsätts för en mild förbehandling med antingen utspädd syra eller basiska och inkuberas vid temperaturer upp till 90 ° C. Förbehandling lösningen därefter bort och proverna sköljas med buffert för att returnera dem till ett lämpligt pH-värde för hydrolys. Proven inkuberas sedan med ett enzym blandning för en variabel tid vid 50 ° C. En alikvot tas från hydrolysatet och reducerande socker automatiskt bestäms av MBTH kolorimetriska metoden.
Protocol
1. Beredning av proverna
Vi arbetar normalt med härrör från antingen örtartade eller vedartade växter. Vid örtartade material vi odla växter till förfall, och efter frö utveckling vi samlar torra stammar gång åldrande är klar. Stjälkarna hackas i 4 mm segment och placeras i 2 ml injektionsflaskor med tre fräsning bollar. När det gäller vedartade material, proverna marken för att grovt sågspån med en kurs trä-fil och sedan placeras i en boll kvarn för vidare bearbetning.
Proverna placeras i ett rack i slip / formatering station (Figur 1). Denna station finfördelar sekventiellt, blandar, och väger varje prov. Antalet repetitioner som behövs per prov fastställs genom att testa det malda materialet i en serie av preliminära experiment där den inneboende variationen för en viss partikelstorlek bestäms. De 2 ml injektionsflaskor är genomborrad i botten och material distribueras av vibrationer i flaskan över den valda bra. Den vibrerande armen styrs av en återkoppling från den balans som möjliggör exakt dosering av pulvret. Roboten doserar 4 mg / bra i en vanlig analys och 4 repetitioner behövs i de flesta fall. Detta gör att 20 växtprover / platta som skall analyseras.
2. Förbehandling
När proverna är formaterade, är 96-brunnar hanteras av en automatiserad vätskehantering system (Figur 2). Här en mild förbehandling utförs på växtmaterial genom att tillsätta 350 mikroliter av syra eller alkaliska lösningar och värme plattan på en anpassad block. För att undvika avdunstning under analysen, är de 96 brunnar tätas med en silikon matt. Den temperatur och tid för förbehandling kan ändras beroende på det material som studeras. Den maximala temperaturen är dock 100 ° C. Ett alternativt förfarande för att testa hårdare förbehandlingar är att förbehandla de material off line och eliminera pretreatmet från processen.
3. Hydrolys
- Efter att materialet förbehandlas, avlägsnar roboten automatiskt förbehandling lösningen, och tvättar, alla brunnar, 5 gånger med 850 mikroliter 25 mM acetatbuffert. Den sköljningar utförs genom att lägga till buffert för förbehandling lösningen, och därefter tar bort 50% av den totala volymen efter att låta fasta ämnen i provet att lösa. Höjden på strävan är satt till hälften av den flytande massa för att undvika aspirering partiklar från botten av brunnen, det är försumbar förlust av partiklar med hjälp av denna metod. Efter dessa tvättar pH i brunnen är 4,5 och materialet är klar för enzymatisk hydrolys.
- Ett enzym blandning som innehåller en lösning av cellulaser och hemicellulases läggs till av roboten. I varje brunn är 850 mikroliter enzym blandning doseras och skivan är flyttade in i ett 50 ° C skaka inkubator. Standarden hydrolysen utförs inom 8 timmar, men den här gången kan anpassas till syftet med experimentet. Standarden enzym lastning används för gräs är 7 FPU / g av materialet.
4. Upptäckt av reducerande socker
Fastställande av reducerande socker släpptes efter hydrolys utfördes med hjälp av en modifierad 3-metyl-2-benzothiazolinone hydrozone (MTBH) metod 3. MBTH valdes ut som den lämpligaste metoden för att det var lättast att automatisera och minst känsliga för störningar från föreningar som proteiner. Vi ändrade denna mycket känslig metod för användning på robot-plattformen så att den kunde exakt mäta socker vid de koncentrationer som finns i biomassan hydrolysat, med en slutlig volym på 250 mikroliter som är lämplig för en vanlig optisk 96 brunnar. Alla stegen nedan utförs automatiskt och tre oberoende bestämningar av reducerande socker genomfördes för varje försockring reaktion.
- 30 mikroliter av hydrolysat togs från den djupa brunnar och blandas med 45 mikroliter 25 mm Natriumacetat buffert i ett kjolar PCR-platta med 96 brunnar.
- 25 mikroliter av 1N NaOH och 50 l av en lösning innehållande 0,43 mg / ml MBTH och 0,14 mg / ml DTT lades till.
- Efter blandning var PCR-plattan värmas vid 60 ° C i 20 min i en termocykler eller liknande enhet som ger exakt samma mängd värme till alla 96 brunnar.
- Den resulterande reaktionen överfördes till en optisk tallrik.
- Tillsätt 100 l av oxiderande reagens (0,2% FeNH4 (SO4) 2, 0,2% Sulfamic syra och 0,1% HCl). Blanda väl och låt utvecklas i minst 1 h.
- Varje platta ska också innehålla standardformuleringar reaktioner 50 nmol, 100 nmol och 150 nmol glukos. Den optiska Plattorna avläses vid 620 nm.
5. Representativa resultat:
Exempel på olika typer av analyser presenteras i figur 3 och 4. Alla resultat erhölls genom att använda automatiserade plattformen. Figur 3 ärpresenterar den ökade reducerande sockerarter släpptes av 8 h inkubationer från marken poppel med ökande mängder av cellulolytic enzymer. Figur 4 visar effekterna av sura och alkaliska förbehandling på poppel prover. Den NaOH förbehandling är mer effektiv än den utspädda H2SO4 förbehandling för att underlätta frisläppandet av socker under hydrolys. Mängden socker mätt efter hydrolys minskar när förbehandling utförs med hjälp av NaOH koncentrationer högre än 1m.
Figur 1. Robotic station för slipning och 96 samt formatering av biomassa
Figur 2. Likvida hantering station för High Throughput försockring analys
Figur 3. Effekten av olika enzym belastningar på release av reducerande socker medel från poppel prover
Figur 4. Effekter av olika förbehandlingar på försockring av poppel prover. A. Socker släpptes efter pretreament med olika procentsatser av H2SO4 vid 90 ° C i 30 minuter. B. Socker släpptes efter NaOH förbehandlingar vid samma temperatur och tid än syra förbehandling .
Disclosures
Vi har ingenting att lämna ut.
Acknowledgments
Författarna vill tacka A Viksø-Nielsen (Novozymes) för gåvan av cellulolytic enzymer. Detta arbete har finansierats av FP7 FÖRNYADE och BBSRC projekt BB/G016178 och BB/G016194.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Grinding & weighing robot | Labman Automation | ||
| 2 ml micro tube with caps | Sarstedt Ltd | 72.694 | |
| 5 mm stainless steel beads | Qiagen | 69989 | |
| 1.2ml Abgene square well storage plates | Fisher Scientific | TUL-050-050C | |
| Whatman cap mat for 96 square well plates | Fisher Scientific | 7704-0104 | |
| Liquid hanling robot | Tecan Group Ltd. | Freedom Evo 200 | |
| Sulphuric acid | Fisher Scientific | S/9231/PB17 | |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | BPE359-500 | |
| Sodium acetate | Sigma-Aldrich | S8750-500G | |
| Acetic acid | Fisher Scientific | A/0420/PB17 | |
| Novozyme 188 | Novozyme | DCN00214 | |
| Celluclast 1.5L | Novozyme | CCN03122 | |
| 96 well PCR full skirt plates | Sarstedt Ltd | 72.1980.202 | |
| D-Glucose | Fisher Scientific | G/0450/53 | |
| 3-Methyl-2-benzothiazolinone hydrazone hydrochloride hydrate | Sigma-Aldrich | 129739-25G | |
| DL-dithiothreitol | Sigma-Aldrich | D9163-1G | |
| Corning microplate 96 well flat bottom | Fisher Scientific | TKT-521-050H | |
| Ammonium iron (III) sulfate dodecahydrate | Sigma-Aldrich | F1668-250G | |
| Sulfamic acid | Sigma-Aldrich | 242772-500G | |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | 12462-0026 |
References
- Carpita, N. C. Structure and Biogenesis of the Cell Walls of Grasses. Annu Rev Plant Physiol Plant Mol Biol. 47, 445-476 (1996).
- Gomez, L. D., Steele-King, C. G., McQueen-Mason, S. J. Sustainable liquid biofuels from biomass: the writing's on the walls. New Phytol. 178, 473-485 (2008).
- Anthon, G. E., Barrett, D. M. Determination of reducing sugars with 3-methyl-2-benzothiazolinonehydrazone. Anal Biochem. 305, 287-289 (2002).
- Gomez, L. D., Whitehead, C., Barakate, A., Halpin, C., McQueen-Mason, S. J. Automated saccharification assay for determination of digestibility in plant materials. Biotechnol Biofuels. 3, 23-23 (2010).
