Aiguë et chronique Test tactile sensorielle après un traumatisme médullaire chez le rat

Summary

Nous décrivons deux méthodes de tests sensoriels tactiles pour des périodes aiguës ou chroniques de lésions de la moelle épinière chez le rat. Ces procédures validées peut détecter le développement et la maintenance de l'allodynie des sensations semblables.

Abstract

Lésions de la moelle épinière (SCI) altère les systèmes sensoriels causant l'allodynie ^1-8. Pour identifier les causes cellulaires et moléculaires de l'allodynie, sensibles et valide les tests sensoriels dans des modèles de rats SCI est nécessaire. Cependant, jusqu'à récemment, aucune méthode de test simple a été validé pour SCI afin que les méthodes normalisées n'ont pas été mises en œuvre dans les laboratoires. En outre, les méthodes d'essai disponibles n'a pas pu être mis en œuvre de façon aiguë ou dans les cas graves déficiences motrices existé, ce qui empêche les études du développement de la SCI-induite allodynie ^3. Ici, nous présentons deux méthodes validées à l'aide de tests sensoriels von Frey cheveux (VFH) monofilaments qui quantifient les changements dans tactiles seuils sensoriels après SCI ^4-5. Un test est le bien-établie Up-Down test qui démontre une sensibilité et une spécificité élevées dans des sévérités différentes SCI lors d'un essai chronique ^5. L'autre test est un test récemment mis au point VFH dorsale qui peut être appliquée aiguë après SCI quand unllodynia développe, avant la récupération motrice ^4-5. Chaque monofilament VFH applique une force calibrée lors d'un contact à la peau de la patte arrière jusqu'à ce qu'il plie. Dans la méthode de haut en bas, VFHs alternance des forces supérieures ou inférieures sont utilisées sur le dermatome L5 plantaire pour délimiter les limites de retrait fléchisseurs. Forces successivement plus élevés sont appliqués jusqu'au retrait se produit alors VFHs force inférieure sont utilisées jusqu'à ce prélèvement cesse. Le seuil tactile reflète la force nécessaire pour obtenir le retrait de 50% des stimuli. Pour ce nouveau test, chaque VFH est appliqué à la dermatome L5 dorsale de la patte tandis que le rat est pris en charge par l'examinateur. La stimulation se produit VFH dans l'ordre croissant de la force jusqu'à ce que au moins 2 des 3 applications à une force donnée produit retrait de la patte. Tactile seuil de sensibilité est la plus faible force de retrait pour provoquer 66% du temps. Procédures d'acclimatation, les essais et la notation sont décrits. Essais aberrants qui exigent un procès retest et typique sont définis. L'utilisation des animaux wtel qu'approuvé par l'Ohio State University et de protection des animaux Comité utilisation.

Protocol

1. Up / Down plantaire Von Frey Test

Le but du test est de déterminer la sensibilité tactile en mesurant la force beaucoup plus est nécessaire pour obtenir retrait de la patte de la relance. Disponibles dans le commerce calibrés monofilaments Von Frey cheveux entre les gammes de 4,56 et 6,10 sont utilisés pour stimuler la patte. Autre entrée sensorielle comme la visualisation du stimulus ou de la proprioception peut confondre des mesures de seuil tactiles afin réponses basées sur l'entrée visuelle ou proprioceptive ne sont pas valides. Pour éviter la visualisation du monofilament de toucher la peau, nous testons seulement tandis que le rat est de manger des céréales. Cette distraction cognitive, garantit également que tous les rats sont testés au niveau de référence similaires de confort. Pour éviter les réponses dues à proprioceptif plutôt que d'entrée tactile, nous n'incluons pas les essais où le monofilament soulève ou déplace la patte.

Méthodes d'acclimatation A. POUR LA DÉMARCHE HAUT-BAS

1. Présent fruits cereal dans la cage afin rats reconnaître et chercher la récompense alimentaire. Les rats n'ont pas besoin d'être privés de nourriture à n'importe quel moment dans le processus de Gentling ou des tests.
2. Les rats sont prêts à être acclimatés à l'environnement de test et les procédures une fois qu'ils mangent des céréales de fruits dans la cage. Acclimatation se déroule sur au moins 4 séances de 10 minutes chacun, mais plus peuvent être nécessaires. Dix minutes par séance sont utilisés de telle sorte que les rats ne deviennent pas rassasiée avant la fin de la session.
3. Placez le rat dans la chambre d'essai avec trois morceaux de céréales fruits. Fournir des céréales de fruits supplémentaire de une à deux à un moment où ils sont consommés. Sur la troisième session tandis que le rat est de manger, de produire des mouvements de la main sous le plancher du fil de telle sorte que le rat s'habitue au mouvement en dessous de sa patte. Sur la quatrième session, appliquer le monofilament 5.18 à la surface plantaire de la patte d'environ une fois par minute pour un total de dix présentations. Un rat naïf ne doit pas répondre à ce stimulus seuil sous.
4. Grandy les morceaux de céréales consommées, la fréquence des mictions et la défécation, la congélation, et les comportements de toilettage. Le comportement de congélation se produit de deux façons: a) le rat est accroupi au ras du sol en général près de la paroi arrière ou opposé à l'examinateur et reste immobile; b) le rat est penché sur le milieu de la cage et bavarde habituellement ses dents . Comportements de congélation peut se poursuivre pendant de longues périodes de temps.
5. Un rat adouci qui est prêt pour les tests mangent presque sans interruption pendant 10 minutes. Il se déplace facilement dans la cage et de chercher des céréales de fruits très rapidement après avoir consommé la dernière. Surtout, le rat ne sera pas arrêter de manger ou d'être distrait par les mouvements des mains sous le plancher du fil monofilament ou l'application à la patte.

ESSAIS B. POUR L'APPROCHE UP-DOWN

1. Les rats produisent des vocalisations de détresse qui sont au-dessus de notre gamme sonore humaine. Les rats qui attendent d'être testés doivent être conservés dans une pièce séparée afin qu'ils ne peuvent pas entendre ces COVgénéralisations.
2. Les rats avec lésion de la moelle épinière qui sont appropriés pour des tests de haut en bas von Frey cheveux doivent démontrer de port de poids avec les membres. Membres qui sont incapables de soutenir le rat ne peut pas être fiable testé parce que l'application de monofilaments déplace la patte avant les virages cheveux.
3. Placez un rat dans la chambre d'essai avec 2 ou 3 morceaux de céréales fruits. Les rats doivent être manger pendant chaque application VFH.
4. Lancez un dé pour déterminer qui HL pour commencer à tester en premier. Même les chiffres représentent la patte droite et nombres impairs représentent la gauche.
5. Commencez la séance d'essais avec le monofilament 5.18. Réponses de retrait peut se produire de 4,56 à 6,10 chez les rats normaux et la SCI et le monofilament 5,18 tombe dans le milieu de la fourchette.
6. Ne pas appliquer un monofilament tandis qu'un rat se fige, se tapit ou ne pas manger. Si le testeur attend, parfois, ces conditions permettra de résoudre et les essais peuvent reprendre. Si le rat affiche ces comportements et la durée totale de l'applicationAratus est de 20 minutes, arrêter le test retest et depuis le début de la journée suivante. Ne retirez pas le rat alors qu'il est l'affichage de ces comportements car cela peut augmenter leur fréquence. Attendez jusqu'à ce que le rat éclate de ces modèles avant de le manipuler afin d'éviter le renforcement de ces comportements.
7. Appuyez sur le monofilament au dermatome L5 plantaire de la patte arrière entre les patins pied jusqu'à ce qu'il se plie (voir la figure 1A). Cette application en douceur constante devrait prendre environ une seconde, puis l'enlever de la peau. Évitez de toucher n'importe quelle partie des coussinets que la sensibilité de la peau est beaucoup plus faible dans ces domaines. Cette touche unique constitue un essai.
8. Une réponse positive se produit lorsque le rat soulève rapidement la patte jusqu'à loin de le monofilament. Le retrait doit être lancé au moment où le monofilament est retiré afin de confirmer que la réponse est associée à l'application monofilament.
9. Regarder l'animal pour une autre preuve de conscience de la mocontact nofilament tels que la vocalisation, regardant vers le bas, vers l'arrière ou à la patte testé, lécher la patte, retrait de la patte soutenue ou secousses musculaires des oreilles. Les noter sur une feuille de données. Lorsque ces comportements se produisent avec retrait de la patte il sert comme preuve de la perception du stimulus supraspinal.
10. S'il ya une réponse positive, appliquer le monofilament la plus basse suivante. S'il n'y a pas de réponse (négative), se déplacer jusqu'à la monofilament supérieur. Laisser 30 secondes entre chaque application monofilament pour les récepteurs sensoriels de revenir à feu de base avant un nouveau test (pour prévenir l'adaptation).
11. Poursuivre l'application de monofilaments supérieures ou inférieures à la patte arrière en fonction des réponses positives ou négatives jusqu'à ce que vous avez 10 essais. Ensuite, répétez sur l'autre patte arrière. (Voir la fiche technique par exemple).
12. La plus haute VFH qui peut être testée sans introduire d'entrée proprioceptive et en soulevant la patte est de 6,10. Le 6.45VFH et plus ne doit pas être utilisé parce que la patte se soulève avant le monofcoudes ilament. S'il n'y a pas de réponse à 6,10, puis la prochaine épreuve sera appliquer le nouveau 6,10.
13. Une réponse devrait être annulée et le procès doit être re-testé si l'un des événements suivants se produisent lors de l'application de relance ou de retrait de la patte:
    1. Le rat n'est pas continuellement manger.
    2. Le rat s'éloigne de la relance VFH avant le pliage du monofilament, ce qui rend impossible de connaître la force appliquée qui provoque la réponse de retrait.
    3. La patte est levée par le VFH (soit avant ou après la VFH est plié) fournissant proprioceptive, en plus de la stimulation tactile.
14. Une session de test peuvent généralement être achevé en moins de 15 minutes pour les deux membres postérieurs.

C. TRAITEMENT DES DONNEES POUR LA DÉMARCHE HAUT-BAS

1. Un test réussi aura 10 essais séquentiels pour chaque patte.
2. La valeur du seuil tactile est le plus bas monofilament qui produit le retrait de la patte & ge; 50% des présentations et des 3 ou plus des présentations du monofilament ont accordée (voir la fiche technique, par exemple, les seuils sont encerclés).
3. Un monofilament avec seulement 2 essais au total n'est pas sélectionné comme le seuil, même si un essai est positif et un négatif. Présentations multiples de la relance sont de meilleurs indicateurs de la répartition des réponses à cette force.
4. S'il n'ya pas de monofilament qui produit des réponses positives sur au moins 50% des tests, le rat est donné un score de 6,45. Cela signifie que le rat n'a pas détecté le plus élevé vérifiable monofilament de 6,10 au-delà de hasard. Une valeur de 6,45 est donné parce qu'il représente la valeur immédiatement supérieure à la plage testable de monofilaments.
5. Convertissez la valeur seuil pour les pattes droite et gauche en vigueur gramme. Les valeurs de force grammes sera fourni par le fournisseur des poils de von Frey. . Pour les données de blessures bilatérales, la force de gramme de seuil pour les deux pattes peuvent être moyennées ensemble pour donnerun score unique.

2. Dorsale de Von Frey Test

Le but de ce test est de déterminer la sensibilité tactile chez le rat avec le contrôle moteur tels les pauvres qu'ils ne peuvent pas être testées en utilisant les méthodes typiques vfh plantaires. Il quantifie le degré de force tactile est nécessaire pour produire une réponse aversive. Pour éviter les réactions aux stimuli proprioceptifs, nous n'incluons pas les essais dans lesquels la patte est déplacé par le VFH lors de l'application. En outre, nous n'incluons pas les essais dans lesquels l'VFH glisse ou brossé sur la surface dorsale du pied.

Méthodes d'acclimatation pour dorsale A. ESSAIS Von Frey

1. Rats doux pour quatre séances de 10 minutes chacun avant les tests de base et de lésions de la moelle épinière.
2. Enroulez le rat dans une petite serviette de sorte que les membres postérieurs sont exposés comme le montre ci-dessous (figure 1B). Placez le rat au cours d'une table avec les pattes de derrière légèrement reposant sur la surface. Utilisez la mêmeserré, mais pas une pellicule étanche et maintenez pour chaque rat. Contreventement votre avant-bras sur le bord de la table peut réduire la variabilité entre les rats.
3. Un rat adouci qui est prêt pour les tests ne seront pas résister à la tenue à la serviette pendant plusieurs minutes consécutives, mais vous pourriez avoir à ré-enrouler le rat 1 ou 2 fois au cours de l'essai de deux pattes de derrière.

ESSAIS B. pour dorsale ESSAIS Von Frey

1. Lancez un dé pour déterminer qui derrière branche de commencer à tester en premier. Même les chiffres représentent la patte droite et nombres impairs représentent la gauche.
2. Enroulez le rat dans la serviette en laissant l'arrière-train exposés.
3. Stimulus tactile est appliqué seulement après que le rat est calme et tranquille pour au moins 10 secondes.
4. En commençant par le VFH 4,56, appliquer le monofilament perpendiculairement à la surface dorsale entre le premier métatarsien et second environ 1 cm en amont de l'articulation (figure 1C). Appliquer le monofilament dans une surface lisse, steady manière sur une intervalle d'une seconde jusqu'à ce qu'il se plie puis l'enlever. Cette touche unique constitue un essai.
5. Une réponse positive se produit lorsque le rat se déplace rapidement la patte loin de la relance. La direction du mouvement est souvent postérieure ou externe avant le membre postérieur est fléchie. Le retrait doit être lancé au moment où le monofilament est retiré afin de confirmer que la réponse est associée à l'application monofilament.
6. Appliquer le monofilament 4,56 fois plus avec au moins 30 secondes entre les applications afin d'éviter sensorielle "liquidation" et de permettre aux récepteurs sensoriels de revenir aux valeurs de base de tir avant de nouveaux essais (pour empêcher l'adaptation).
7. Un test de stimulation doit être appliqué de nouveau si les bulletins de vfh et frôle la peau en douceur, ce qui rend la prestation plus de force d'un brossage ou un balayage plutôt que d'un contact pointu.
8. Si il ya moins de 2 (soit 1 ou 0) des réponses positives à la monofilament 4,56, l'VFH supérieure est appliquée 3fois de la même manière.
9. De cette façon, VFHs progressivement plus de 4,56 par 5,88 sont appliqués jusqu'à ce que deux ou plusieurs réponses positives se produisent ou jusqu'à ce que le plus grand VFH est atteint.
10. Le seuil de retrait de la patte est le plus bas VFH qui provoque au moins 2 réponses positives sur 3 essais.
11. Répéter l'opération sur l'autre patte.
12. Une session de test peuvent généralement être achevé en 15 minutes pour les deux pattes de derrière.

3. Les résultats représentatifs

Un test réussi se traduira par le retrait immédiat, rapide de la patte arrière à une VFH perpendiculairement appliquée à la région mi-plantaire (figure 1A) ou de la surface dorsale entre le 1 ^er et 2 ^ème métatarse 1 cm de l'articulation (figure 1C) . Ces réponses sont comptabilisés pour calculer seuil tactile pour chaque patte arrière. Seuils tactiles de dorsales essais vfh en SCI aiguë a montré une excellente fidélité avec plantaires seuils vfh tirerd à des moments chroniques (figure 2). La baisse des seuils tactiles à partir de tests plantaires ou dorsaux se produire pour graduée SCI (Figure 3 ^3,5). Cette hypersensibilité se manifeste dès 7 jours après la SCI et est maintenue pendant toute la durée de l'expérience ^3-4,6. Alors que toute une gamme de sévérités SCI n'affectent pas les seuils sensoriels tactiles de la patte, la baisse des seuils de se produire pour plus sévère SCI (Figure 3). Surtout, le développement de la ci-dessous au niveau allodynie est une réponse tout ou rien qui se produit quand il ya une perte de plus de 60% de la substance blanche à l'épicentre lésion. (Figure 4 ^3).

Seuils tactiles peuvent se désintégrer et de produire des réponses artificielles aux forces vfh faibles. Au moins deux conditions peut produire la carie seuil - rapidement l'application de la VFH à la peau d'une manière ou piquer piquant ou ne pas attendre assez longtemps entre les applications de relance. Pour être sûr queles seuils tactiles sont authentiques, des précautions doivent être prises pour appliquer chaque VFH en utilisant une approche similaire à faible vitesse et l'intervalle interstimulus doit être d'au moins 30 sec. Nous avons également montré que le comportement alimentaire réduit la carie ⁵ seuil.

Figure 1. Schéma et photographie montrant l'emplacement de la stimulation de la VFH plantaire et dorsale von Frey cheveux (VFH) tests. A) Pour les tests VFH plantaire, les cheveux de von Frey devrait être appliquée perpendiculairement à la patte arrière mi-plantaire d'environ 1 cm en arrière de la phalange moyenne (comme indiqué par la boîte rouge dans le diagramme de la surface plantaire de la patte arrière) à une vitesse lente vitesse constante jusqu'à ce qu'elle se plie. B et C) Pour la technique VFH dorsale, le rat est vaguement enveloppée dans une serviette chirurgicale comme le montre la photo. Le VFH est appliqué à la surface dorsale de la patte entre la première et la deuxième approximatel métatarsieny 1 cm en amont de l'articulation.

Figure 2. Dorsaux seuils von Frey cheveux sensorielles en corrélation avec VFH plantaire standard. (N-44; coefficient de Pearson = 0,503, p <0,01, r2 = 0,67). Les lignes pointillées indiquent le seuil de coupure de la sensation allodynique en utilisant soit la VFH dorsale ou les techniques vfh plantaires et indiquer que les seuils allodyniques à 7 jours après un traumatisme médullaire en utilisant le test VFH dorsale chronique prédire ci-dessous au niveau allodynie déterminée par des méthodes vfh plantaires.

Figure 3. Les premières dorsales seuils von Frey cheveux sensorielles prédire allodynique et non-allodynique sensibilité tactile dans des sévérités de blessures à timepoints plus tard. Comparables seuils sensoriels ont eu lieu entre 7 jours après vfh dorsale SCI et 28 jours post-mesures SCI vfh plantaires. Similitude remarquable s'est produite pour une large éventail de SCI, avec allodynie significative noté dans modérée à sévère SCI (p <0,05 vs 1,1 mm de déplacement tous les autres groupes).

Figure 4. Pourcentage de rats recevant une laminectomie (pas de SCI) et des groupes SCI montrant patte arrière allodynie moins 6 semaines après la SCI. Allodynie a été seulement observée chez les rats avec modérés ou graves SCI (OSU ESCID dispositif de 0,9, 1,1, 1,25, 1,3 déplacements de la moelle mm) tandis que les rats ayant une forme légère SCI (0,3, 0,5, 0,7 mm déplacements de la moelle épinière) exposés des réactions normales à la stimulation tactile. Représentant coupes coronales de la moelle épinière colorées pour la myéline à l'épicentre de la lésion pour laminectomie (contrôle indemne), légère (0,5 mm de déplacement), modérées (1,1 mm de déplacement) et sévère (1,3 mm de déplacement) contusions de la moelle épinière sont inclus pour montrer le degré de axonale ménager qui est associé à cette hypersensibilité. (Barre d'échelle = 0,5 mm).

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Figure 5. Une fiche de données d'échantillon pour les tests de haut en bas von Frey cheveux. La valeur des cheveux et le résultat (positif ou négatif) sont enregistrées pour chaque essai. Indications de sensibilisation supraspinal des tests sont notés. A la fin du test, les réponses à chaque valeur de cheveux sont comptés. La valeur du seuil sélectionné pour les données d'exemple est encerclé.

Discussion

Les méthodes d'essai vfh présentés ici représentent deux paradigmes de test qui sont sensibles et valable pour une utilisation dans des modèles de rats SCI. Il est important, le test dorsale VFH a été créé pour l'évaluation de la reprise de la sensation tactile des pattes postérieures aiguë après la mi-thoracique SCI lorsque les rats sont incapables de se tenir sur leurs membres postérieurs. Ce paradigme de test peut également être utilisé lorsque les rats à retrouver la capacité pour supporter leur poids et pour les membres postérieurs après col de l'utérus SCI.

Les deux paradigmes démontré ici utiliser VFH calibré pour déterminer le seuil tactile de chaque patte arrière. D'autres méthodes de déterminer la fréquence du retrait soit à un stimulus normalement inoffensif ou normalement nocif. Nous avons précédemment montré que de petites améliorations dans les seuils tactiles peuvent représenter la différence entre la présence de la douleur neuropathique chronique et normale sensation tactile. Ainsi en utilisant des méthodes d'essai expérimentales qui tirent la douleur seuils peut faciliter traduction de potentiels d'interventions thérapeutiques à la clinique.

Comme avec tous les tests de comportement, il est impératif de réduire au minimum le nombre de facteurs de confusion au sein de l'environnement de test qui peuvent influer sur le résultat du test comportemental ^9. Ainsi, il est important que chaque session de test a lieu à la même heure du jour, dans la même température et humidité ambiante contrôlée. En outre, puisque les rats communiquer vocalement dans un domaine des ultrasons, il est important que les rats qui attendent d'être testés sont conservés dans une pièce séparée jusqu'à ce que leur début des essais. Langford et al ¹⁰ ont montré des preuves spectaculaires que les animaux naïfs éprouver de la douleur après avoir assisté à une compagnon de cage exposés à une stimulation nociceptive. Afin de mieux éliminer la variabilité dans les méthodes sensorielles tactiles, nous utilisons des céréales sucrées comme un élément de distraction cognitive au cours des essais VFH plantaire. Ce faisant, nous stabilisons les réponses de l'animal. Le seuil est moins susceptible de se désintégrer tout au longtester si un élément de distraction est fourni que quand on n'est pas ^5. Cette stabilisation est probablement due à la trempe des comportements hypervigilant et catastrophisme, les deux états d'anticipation où la menace de la douleur activent la peur et les centres émotionnels du cerveau.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Semmes-Weinstein Monofilaments	Stoelting Co.	58011
Fish Breeder Box	Any Supplier		Hole drilled in side for cereal delivery
Elevated wire mesh (1/4" X 1/4" grid)	Hardware Store
Elastic to hold fish breeder box in place	Any Supplier
Sugared Cereal	Grocery Store
Surgical Huck Towel 16"x 23"	Medical Supply Store