ラット脊髄損傷後の急性および慢性の触覚官能検査

Summary

我々は、ラットの脊髄損傷の急性または慢性期には2つの触覚感覚のテスト方法について説明します。これらの検証の手順は、異痛症のような感覚の開発と保守を検出することができます。

Abstract

脊髄損傷（SCI）は、異痛症^1-8を引き起こす感覚系を損なう。異痛症の細胞および分子の原因を識別するために、ラットSCIモデルの高感度かつ有効な官能検査が必要になります。しかし、最近まで、単一のテストのアプローチは、標準化されたメソッドがラボ全体に実装されていないように、SCIに検証されていなかった。また、使用可能な試験方法は、急性実装することができませんでしたか、重度の運動障害が存在する場合には、SCI-誘発アロディニア³の開発の研究を防ぐことができます。ここでは、SCI ^4月5日後の触覚感覚閾値の変化を定量化·フォン·フレイヘア（VFH）モノフィラメントを使用して、2つの検証官能検査の方法を提示します。つのテストでは、慢性的に^5をテスト^して別のSCIの重大度にわたって高い感度と特異性を示して定評のあるアップダウンテストです。他のテストでは、SCI後の急性適用することができる新開発の背VFHテストですllodyniaは、モータの回復^4-5〜の前に、開発しています。それは曲がるまで後肢の皮膚に触れたとき、各VFHモノフィラメントは、キャリブレーション力を適用します。アップダウン方式では、上位または下位の力の交互VFHsは屈筋の撤退のしきい値を区切るために足底の皮膚分節L5で使用されます。連続的により高い軍は撤退が発生するまで撤退が終了するまで、下位の力VFHsが使用されて適用されます。触覚の閾値は、刺激の50％に撤退を引き出すために必要な力を反映しています。ラットは、審査官によってサポートされていながら、新しいテストでは、各VFHは足背L5皮膚分節に適用されます。 VFH刺激は与えられた力で少なくとも2 3のアプリケーションまで、力の昇順で発生した足の撤退を生成します。触覚感覚閾値は時間の撤退66％を引き出すための最低の力である。順化、テストおよびスコアリング手順が説明されています。再検査と典型的な臨床試験を必要とする異常な試験が定義されています。動物の使用ワットとしてオハイオ州立大学動物のケアおよび使用委員会によって承認されました。

Protocol

1。アップ/ダウン足底フォンフレイテスト

テストの目的は、はるかに力が刺激から足の撤退を引き出すために必要とされる方法を測定することにより、触覚感度を決定することです。 4.56および6.10の範囲の間に市販のキャリブレーション·フォン·フレイ毛のモノフィラメントは、足を刺激するために使用されます。視覚や固有感覚入力に基づいて応答が無効であるので、刺激や固有感覚の視覚化のような他の感覚入力は、触覚閾値対策を混乱させることができます。ラットは、穀物を食べている間に肌に触れるモノフィラメントの可視化を防ぐために、我々だけをテストします。この認知的不正解も、すべてのラットは快適さの類似したベースラインのレベルでテストされることを保証します。むしろ触覚の入力よりも自己受容に起因する応答を避けるために、我々は、モノフィラメントは、足を持ち上げたり、移動した試験が含まれていません。

UP-DOWNアプローチのA.の順応の手続き

1. 現在の果物cereaラットは、食品の報酬を認識して求めるように、ホームケージ内リットル。ラットはgentlingやテストプロセスのどの時点でも奪われた食品である必要はありません。
2. ラットは、彼らがホームケージ内のフルーツの穀物を食べたら、テスト環境および手順に順応する準備ができました。順応は10分ごとに、より多くの少なくとも4つのセッションが必要になることがあります上に発生します。 10分のセッションは、ラットは、セッションの終了前に飽き飽きしにならないように使用されています。
3. フルーツの穀物の三枚を使ったテストチャンバー内でラットを配置します。追加の果物、穀物、それらが食べられるように一度に一から二を提供しています。ネズミが食べている間にラットがその足の下の動きに慣れになるように、第三セッションでは、ワイヤーの床の下に手の動きを生成します。第4セッションでは、約一足の足底表面10のプレゼンテーションの合計分に5.18モノフィラメントを適用します。ナイーブなラットは、このサブスレッシュホールドの刺激に応答しません。
4. 背の高いyは消費穀物の破片、排尿や排便、凍結、およびグルーミング行動の頻度。凍結挙動は2つの方法で発生します。）ラットは、通常、後ろの壁近くの地面に低うずくまったり、審査官から直面していると動かないままであること、b）ラットは檻の真ん中に覆いかぶさると、通常、その歯をしゃべっている。凍結の動作が長時間継続することができます。
5. テストの準備ができているgentledラットは10分間、ほぼ継続的に食べるようになる。それはケージに簡単に移動し、最後を消費した後に非常に迅速にフルーツの穀物を求めます。重要なのは、ラットは食べるのをやめるないか、足にワイヤーの床またはモノフィラメントのアプリケーションの下に手の動きに気を取られる。

UP-DOWNアプローチのB.試験手順

1. ラットは、私たち人間の聴覚の範囲を超えている苦痛の発声を生成します。彼らはこれらのVOCを聞くことができないようにテストされるのを待っているラットは、別の部屋に保管してくださいalizations。
2. アップダウン·フォン·フレイ毛のテストのために適切である脊髄損傷ラットは、手足で体重負荷を示さなければなりません。モノフィラメントのアプリケーションは、髪を曲げる前に足を移動するため、ラットをサポートすることができません手足を確実にテストすることはできません。
3. フルーツ穀物の2または3個使ったテストチャンバー内でラットを配置します。ラットは各VFHアプリケーションの中に食べなければなりません。
4. HLは、最初のテストを開始するかを決定するためにダイスを振る。偶数は右前足を表しており、奇数番号は左を表しています。
5. 5.18モノフィラメントでテストセッションを開始します。撤退の応答は、通常とSCIラットで4.56から6.10に発生することができ、5.18モノフィラメントは、範囲の中央に落ちる。
6. ラットは、crouchesがフリーズまたは食べない間にモノフィラメントを適用しないでください。テスターが待機している場合、時にはこれらの条件が解決されますとテストを再開することができます。ラットでは、これらの行動やアプリの合計時間が表示されている場合aratusは最初次の日からのテストと再テストを停止し、20分です。これは、その発生を増加させる可能性があるので、それがこれらの動作を表示している間に、ラットを削除しないでください。ラットがこれらの行動を強化回避するために、それを取り扱う前に、これらのパターンの勃発まで待ちます。
7. それ曲がり（ 図1Aを参照してください）まで、フットパッドの間に後足の足底の皮膚分節L5にモノフィラメントをタッチします。この滑らかな安定したアプリケーションは、約1秒かかり、皮膚からそれを削除する必要があります。皮膚の感度はこれらの分野で非常に低いので足のパッドの任意の部分に触れないようにしてください。この単一のタッチは一つの試験を構成します。
8. ラットはすぐにモノフィラメントから足を離したときに肯定応答が発生します。撤退は応答がモノフィラメントアプリケーションに関連付けられていることを確認するためにモノフィラメントが削除された時点で開始する必要があります。
9. MOの意識の他の証拠のために動物を見そのような発声などnofilamentタッチ、下方、後方またはテスト足を見て足、持続的な足の撤退を舐めたり、耳をひく。データシート上に注意してください。これらの動作は足の撤退で発生した場合、それは刺激の脊柱上の認識の証拠として機能します。
10. 肯定応答がある場合は、次に低いモノフィラメントを適用します。応答が（マイナス）が存在しない場合は、次の高いモノフィラメントまで移動します。 （適応を防ぐために）再テストする前に、ベースラインの焼成に戻ってくる感覚受容器の各モノフィラメントアプリケーションとの間で30秒を許可します。
11. あなたは10回になるまでの正または負の応答に基づいて後足に高いまたは低いモノフィラメントを適用することを続行します。その後、他の後足を繰り返します。 （たとえば、データシートを参照してください）​​。
12. 固有感覚入力を導入し、足を持ち上げることなくテストすることができる最高VFHは6.10です。足がmonof前に持ち上げるため6.45VFHと大きい方を使用すべきではありませんilamentに曲がる。 6.10での応答がない場合は、次回の公判は再度6.10を適用されます。
13. 次のいずれかが刺激アプリケーションや足の撤退中に発生した場合、応答は無効とされるべきであり、試験は再テストする必要があります。
    1. ラットでは、連続して食べていません。
    2. ラットは不可能撤退応答を誘発する加えられた力を知って作る、モノフィラメントの曲げする前に離れてVFH刺激から移動します。
    3. 足は、触覚刺激に加えて、自己受容を提供（VFHが曲がって前または後）VFHによって解除されます。
14. テストセッションは、通常、両方の後肢のために15分未満で完了することができます。

UP-DOWNアプローチのC.データ処理

1. テストの成功は、それぞれの足のための10の順次試験があります。
2. 触覚閾値の値は＆Gの足の撤退を実現できる最小のモノフィラメントです。E;プレゼンテーションやモノフィラメントの3以上のプレゼンテーションの50％が（たとえば、データシートを、しきい値が円で囲まれている参照）が与えられています。
3. わずか2合計の試験とモノフィラメントは、一つの試験が陽性で、1つが負であっても、しきい値として選択されていません。刺激の複数のプレゼンテーションは、その力への応答のパターンの良い指標である。
4. テストの少なくとも50％に陽性反応を生成するにはモノフィラメントがない場合は、ラットは6.45のスコアが与えられています。これはラットが偶然を超えて6.10の高い検証可能なモノフィラメントを検出しなかったことを意味します。それはモノフィラメントの検証可能な範囲よりも高い、次の値を表すため、6.45の値が与えられます。
5. グラムの力に左右の足のしきい値を変換します。グラム力の値は、フォン·フレイ毛のサプライヤーによって提供されます。 。二国間の傷害からのデータでは、2つの足のしきい値のグラム力を得るために一緒に平均化することができます単一のスコア。

2。背フォンフレイテスト

このテストの目的は、彼らは典型的な足底のVFHメソッドを使用してテストすることができないような貧しいモータ制御ラットにおける触覚感度を決定することです。それは、タッチ力が嫌悪応答を生成するために必要とされるどの程度定量化します。固有感覚刺激に対する反応を避けるために、我々は足がアプリケーション中にVFHによって移動された試験が含まれていません。さらに、我々は、VFHは、スリップや足の背側表面全体にブラッシングされている試験が含まれていません。

背VON FREYテストのためのAの順化の手続き

1. ベースラインテストと脊髄損傷の前に10分ごとの4セッションのためのジェントルラット。
2. 後半部は（ 図1B）以下に示すように公開されているので、大まかに小さなタオルでネズミをラップします。軽く表面に載って後足でテ​​ーブルの上にラットを置きます。同じものを使用ぴったりではなくタイトなラップをし、各ラットについて保持します。テーブルの端にあなたの前腕を支柱とラットの間でのばらつきを減らすことができます。
3. テストの準備ができているgentledラットでは、複数の連続した​​分のタオルで開催されて抵抗するわけではありませんが、両方の後肢のテスト中に再ラップラット1〜2回する必要があるかもしれません。

背VON FREYテスト用B.試験手順

1. 最初のテストを開始するかを後肢を決定するためにダイスを振る。偶数は右前足を表しており、奇数番号は左を表しています。
2. 大まかに露出した後半部を残してタオルでネズミをラップします。
3. 触覚刺激はラットは、少なくとも10秒間穏やかで静かであるした後にのみ適用されます。
4. 4.56 VFHから始まる（ 図1C）関節に約1cm近位第一および第二中足骨の間の背側表面に垂直にモノフィラメントを適用します。滑らかで、ステレオでモノフィラメントを適用する1秒間隔以上ADYは、方法それ曲がるし、それを削除するまで。この単一のタッチは一つの試験を構成します。
5. ラットはすぐに離れて刺激から足を動かしたときに肯定応答が発生します。後肢が屈曲される前に運動の方向は、多くの場合、後部または外部にある。撤退は応答がモノフィラメントアプリケーションに関連付けられていることを確認するためにモノフィラメントが削除された時点で開始する必要があります。
6. （適応を防ぐために）感覚 "ワインドアップ"を防ぐために、感覚受容体が再テストする前に、ベースラインの焼成に戻ってできるようにするために倍より多くのアプリケーションとの間に少なくとも30秒4.56モノフィラメントを適用します。
7. 刺激テストは、VFHスリップ場合に再適用し、優しく肌をかすめる、ブラッシングまたはスイープではなく、先の尖った接触のより多くの力の配信を行う必要があります。
8. 4.56モノフィラメント2（すなわち、1または0）未満の正の応答がある場合は、次の大きいVFHは3が適用される同じように回。
9. この方法では、4.56から5.88を介して徐々に大きくVFHsは、2つまたはより多くの肯定的な応答が発生するまで、または最大VFHに達するまで適用されます。
10. 足撤退のしきい値は3試験のうち少なくとも2つの肯定的な反応を誘発する最低VFHです。
11. 他の足で繰り返します。
12. テストセッションは通常後足の両方で15分で完了することができます。

3。代表的な結果

テストの成功は、ジョイント（ 図1C）から半ばに底領域（ 図1A）または第¹回と第²中足骨1センチメートルの間に背側表面に垂直に適用されたVFHに後足の即時、活発な撤退になります。これらの応答は、それぞれの後足のための触覚閾値を導出するために集計されます。足VFHしきい値が派生して、急性SCIの背VFHテストから触覚しきい値は、優れた忠実度を示した慢性的な時間でD（ 図2）。足や背のテストから派生した触覚閾値の低下が傾斜SCI（ 図3 ^3,5）に対して発生します。この過敏症は7日、SCI後、早くも現れ、実験^3-4,6の期間中維持されています。 SCIの重大度の範囲は、足の触覚感覚のしきい値には影響しませんが、しきい値の低下はより深刻なSCI（ 図3）が発生します。重要なのは、以下のレベルのアロディニアの開発は、病変震源における白質の60％以上の損失がある場合に発生したすべてまたはnone応答である。 （ 図4 ^3）。

触覚しきい値は、減衰と低VFH軍に人工的な応答を生成することができます。少なくとも二つの条件は、しきい値の減衰を生成することができます - 急速に刺激アプリケーションの間で十分な長待って突っついたり、刺した方法で皮膚にVFHを適用するかどうか。ことを確信する触覚閾値が本物であり、注意が類似した低速度のアプローチと刺激間間隔は少なくとも30秒でなければなりませんを使用して各VFHを適用するために注意する必要があります。また、摂食行動がしきい値減衰^5を減少させることが示されている。

図1足と背·フォン·フレイ毛（VFH）テスト用VFH刺激の場所を表す回路図と写真。 ）足VFH試験のために、フォン·フレイ毛は、低速で中間の指骨の後方に半ば足後足約1cm（ように後足の足底表面の図中の赤いボックスで示される）に垂直に適用されるべきであるそれは曲がるまで、一貫した速度。写真のように背VFHテクニックのためにBとC）、ラットは、大まかに手術のタオルに包まれています。 VFHは、第1および第2中足骨approximatelの間に足の背側表面に適用される関節近位Y 1センチメートル。

図2背·フォン·フレイ毛感覚しきい値は、標準的な足底VFHに関連しています。 （N-44、ピアソン係数= 0.503、P <0.01、R2 = 0.67）。破線は背VFHまたは底VFHテクニックのいずれかを使用して、アロディニア感覚のカットオフしきい値を示し、背VFHテストを使用したSCI 7日後アロディニアしきい値が底VFHメソッドによって決定される慢性の下レベルの異痛症を予測することを示しています。

図3早期背·フォン·フレイ毛感覚しきい値は、後の時点で傷害の重大度を越えてアロディニアと非アロディニア触覚感度を予測する。同等の感覚しきい値は、7日間の間にポストSCI背VFH、28日後SCI足VFH対策をしました。著しい類似性がために発生した重要な異痛症とSCIの広い範囲が、中等度から重度のSCI（他のすべてのグループ対P <.05 1.1ミリメートル変位）で述べた。

4椎弓切除術を投与したラットの割合（無SCI）とSCIグループはSCI後6週目に後足アロディニアを示す図 。軽度のSCIラット（0.3、0.5、0.7ミリメートル脊髄の変位）は触覚刺激への通常の応答を示した。アロディニアは、中等度または重度のSCI（OSU ESCIDデバイス0.9、1.1、1.25、1.3ミリメートルコード変位）とラットで見られた代表的なコロナの脊髄節では、椎弓切除術のために病変震源（無傷の制御）でミエリンを染色し、軽度（0.5 mmの変位）、中等度（1.1 mmの変位）と重度（1.3ミリメートル変位）脊髄挫傷は、軸索の程度を示すために含まれていますこの過敏症に関連付けられているスペア。 （スケールバー= 0.5 mm）である。

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図5。アップダウンたvon Frey毛のテスト用のサンプルデータシートを参照してください。髪の値と結果が（正または負の）それぞれの試験のために記録されています。テストの脊柱上の意識の指示が記載されています。テストの終わりには、それぞれの髪の値で応答が集計されます。例データの選択されたしきい値は、丸で囲まれています。

Discussion

VFH試験方法は、機密およびラットSCIモデルで使用するために有効な2つのテストのパラダイムを表してここに発表した。重要なのは、背VFH試験はラットは、その後半部に立つことができないときに急性半ば胸部SCI後の後肢の触覚の回復の評価のために作成されました。ラットは自分の体重をサポートし、子宮頸部SCI後の後肢のためにする能力を取り戻すときに、このテストのパラダイムを使用することもできます。

2つのパラダイムは、ここでそれぞれの後足の触覚閾値を決定するためにキャリブレーションVFHを利用して実証した。他の方法は、通常は無害または正常に有害な刺激のいずれにも撤退の周波数を決定します。我々は以前触覚閾値の小さな改良は、慢性神経因性疼痛と正常な触感の存在の違いを表すことができることが示されている。したがって、痛みのしきい値05、FAを導出する実験的な試験方法を活用潜在的な治療介入の診療所への変換をcilitate。

すべての行動試験と同様に、行動試験⁹の結果に影響を与える可能性があり、テスト環境内の交絡因子の数を最小限に抑えることが不可欠です。したがって、各テストセッションが同じ温度と湿度が制御された部屋で、一日の同じ時間に発生することが重要である。ラットは、超音波の範囲内で声に出して伝えるので、さらに、それは彼らのテストが開始するまでテストされるのを待っているラットは別の部屋に保管されていることが重要である。ラングフォードら ^10は、ナイーブな動物が有害な刺激にさらされるcagemateを目の当たりにした後に痛みが発生することを劇的な証拠を示した。さらに触覚官能検査のばらつきをなくすために、我々は足底VFHテスト中に認知不正解の選択肢として、砂糖、穀物を利用しています。そうすることで、我々は動物の応答を安定させる。しきい値は、全体に崩壊する可能性が低くなり不正解の選択肢は、1つが⁵でない場合より提供されていたときにテストします。この安定化は、おそらくhypervigilantとcatastrophizing行動、痛みの脅威は、脳内の恐怖と感情的なセンターを活性化する2先行状態の焼戻しによるものです。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Semmes-Weinstein Monofilaments	Stoelting Co.	58011
Fish Breeder Box	Any Supplier		Hole drilled in side for cereal delivery
Elevated wire mesh (1/4" X 1/4" grid)	Hardware Store
Elastic to hold fish breeder box in place	Any Supplier
Sugared Cereal	Grocery Store
Surgical Huck Towel 16"x 23"	Medical Supply Store