在大鼠脊髓损伤后的急性和慢性触觉测试

Summary

我们描述了两个在大鼠脊髓损伤的急性或慢性期的触觉感官检验方法。这些验证程序，可以检测痛觉异常，像感觉的开发和维护。

Abstract

脊髓损伤（SCI）损害造成^1-8异常性疼痛的感觉系统。以确定细胞和分子的原因，痛觉异常敏感和有效的在大鼠脊髓损伤模型的感官检验是​​必要的。然而，直到最近，没有一个单一的测试方法已验证SCI，使标准化的方法尚未在实验室实施。此外，现有的测试方法不能实施，急性或严重的运动障碍存在时，防止脊髓损伤引起的痛觉异常³发展的研究。在这里，我们提出了两个有效的感官检验方法冯弗雷头发（VFH）单丝，量化脊髓损伤后^4-5触觉阈值的变化。一个测试，是行之有效的向上向下的测试表明，灵敏度高，特异性在不同脊髓损伤的严重程度进行测试时，长期^5。其他的测试是一个新开发的背的VFH测试，可应用于脊髓损伤后急性时llodynia的发展，电机恢复^4-5前。每个的VFH单丝适用于校准的力时，触及到的皮肤，直到它弯曲的爪。在上下的方法，更高或更低的势力交替VFHs使用足底L5皮划定屈撤回阈值。先后更高的势力施加撤军，直到出现较低的力量VFHs直到撤出不再使用。触觉阈值反映需要引起撤出50％的刺激力。对于新的测试，每个的VFH是爪子L5背皮，而老鼠是由考官支持。的的VFH刺激发生升序秩序的力量，直到至少2 3应用在一个给定的力量，产生缩爪。触觉阈值是最低的力量引起撤出66％的时间。驯化，测试和评分过程进行了描述。定义异常试验，认为需要复验和典型试验。动物USE W由美国俄亥俄州立大学动物照顾与使用委员会批准。

Protocol

1。向上/向下跖用von Frey测试

测试的目的是通过测量确定需要多大的力引起爪子撤回刺激触觉的敏感度。市售标准von Frey 4.56和6.10的范围之间的发单丝用于刺激爪子。可视化的刺激或本体感觉输入其他类似可以混淆触觉阈值的措施，所以基于视觉或本体输入的反应是无效的。为了防止接触皮肤的单丝的可视化，我们只测试而老鼠吃谷物。这种认知分心，也确保所有大鼠在相似的舒适基线水平测试。为了避免由于本体，而不是触觉输入的响应，我们不包括单丝升降机或移动爪子的试验。

A.向上向下的方法驯化程序

1. 当前水果cerea在家里笼l使大鼠的认识和寻找食物奖励。大鼠不需要是在被剥夺在gentling或测试过程中任何一点的食物。
2. 老鼠被驯化的测试环境和程序，一旦他们在家里笼吃水果谷物。驯化发生了至少4个会议，但更可能需要10分钟。使老鼠不成为酒足饭饱在会议结束前十分钟会议。
3. 大鼠在试验室将与三件水果谷物。提供额外的水果谷物作为他们吃的时间到两个。第三次会议上的老鼠吃时，生产线地板下的手部动作，使老鼠变得习惯于它的爪子下的运动。在第四次会议上，适用于5.18单丝足底表面的爪子，一次约一分钟共十场专题介绍。一个天真的老鼠不应该响应本次阈值刺激。
4. 高y的件消耗的谷物，排尿和排便，冻结，仪容行为的频率。冻结行为发生在两个方面：一）对大鼠低到靠近后墙的地面通常蹲在或面临从考官依然一动不动;二）对大鼠弓着背在笼中，通常是非者，它的牙齿。冻结行为可能会持续很长一段时间。
5. 是的一个gentled老鼠准备测试将连续吃了近10分钟。这将很容易地在笼子里，后消费的最后寻求水果谷物很快。重要的是，老鼠会不会停止进食或线下的地面或单丝应用的爪子的手部动作而分心。

B.向上向下的方法测试程序

1. 大鼠产生窘迫发声，是我们人类的听觉范围以上。大鼠等待测试应保持在一个单独的房间，使他们无法听到这些VOCalizations。
2. 大鼠脊髓损伤是适当上下冯弗雷头发测试必须展示出四肢负重。是无法支持的大鼠的四肢不能可靠的测试，因为单丝的应用，移动前的头发弯曲的爪子。
3. 在大鼠试验室将有2或3件水果谷物。大鼠必须吃期间每个VFH应用。
4. 滚动骰子，以确定这红莲开始测试第一。偶数代表权的爪子，奇数代表左侧。
5. 开始测试5.18单丝会议。在正常和SCI大鼠戒断反应，可能会出现从4.56至6.10和5.18单丝在属于该范围的中间。
6. 老鼠冻结，蹲或不吃饭，不适用单丝。如果测试仪等，这些条件有时会解决和测试就可以恢复。如果老鼠显示这些行为和应用程序的总时间aratus是20分钟，停止测试和复试从一开始的第二天。不要删除大鼠，而它显示这些行为，因为这可能会增加其发生。等待，直到老鼠打破了这些模式前处理，以避免加强这些行为。
7. 轻触单丝对L5之间，直到它弯曲（ 见图1A）脚垫后肢足底皮。这光滑的稳定应用应约一秒钟，然后从皮肤移除。避免接触的垫脚的任何部分，作为皮肤的敏感性是在这些领域的低得多。这种单一的触摸构成一项试验。
8. 发生时，老鼠很快举起爪子从单丝远离正面回应。单丝被删除时必须开始撤离，以确认单丝的应用响应。
9. 其他证据意识，莫看动物nofilament触摸，如发声，眼睛向下，向后，或在测试的爪子，舔爪子，的持续爪子撤出或抽动耳朵。注意在数据表上它们。当这些行为发生爪子撤出它充当刺激脊髓感知的证据。
10. 如果有一个积极的回应，适用于下一个最低的单丝。如果没有任何反应（负），移动到下一个更高的单丝。让每个单丝申请复检（以防止适应）回来之前基线射击的感受器之间的30秒。
11. 继续申请更高或更低的单丝后肢的基础上积极或消极的反应，直到你有10个试验。然后重复其他后肢。 （例如表）。
12. 的的VFH，可以在不引入本体输入和解除爪子测试最高为6.10。 6.45VFH和较大的不应该使用，因为爪子前monof的升降机ilament弯曲。如果有在6.10没有响应，那么接下来的审判将再次申请的6.10。
13. 一个响应，应作废和审判必须重新测试，如果下列之一发生在刺激应用程序或缩爪：
    1. 大鼠连续吃。
    2. 从VFH刺激老鼠移开之前的单丝弯曲，使其无法知道的力引起戒断反应。
    3. 爪子被解除VFH提供本体中除了触觉刺激（无论之前或之后的VFH是弯曲的）。
14. 测试会话通常为两后肢在不到15分钟就可以完成。

C.数据处理方法上下

1. 测试成功，将有10个连续试验，每个爪子。
2. 触觉阈值的值是最低的单丝产生爪子＆G撤出E，50％的介绍和3个或更多的介绍单丝（见示例表，阈值盘旋）。
3. 一个只有2总试验单丝未选中作为阈值，即使当一个审判是积极的，一个是否定的。多个演示文稿的刺激的反应模式，更好的指标，以武力。
4. 如果没有单丝产生的积极响应，至少50％的测试，大鼠给予6.45分。这意味着，老鼠没有检测到6.10测试的最高单丝超出随机机会。值6.45，因为它代表了未来的价值高于单丝测试的范围。
5. 转换成克力的左，右爪子的阈值。冯弗雷头发的供应商将提供克的力值。 。为来自双边受伤的数据，两个爪子的门槛克力可以平均产生一个单一的得分。

2。背冯弗雷测试

本试验的目的是确定在这样恶劣的马达控制，他们不能使用典型足底VFH方法测试大鼠的触觉灵敏度。它量化多少触摸力产生厌恶反应。为了避免本体刺激的反应，我们不包括的爪子在申请提出的VFH试验。此外，我们不包括试验中，VFH滑倒或整个足背表面刷。

A.背用von Frey测试驯化程序

1. 温柔四，每次10分钟的会议之前，基准测试和脊髓损伤大鼠。
2. 松散的小毛巾敷大鼠，使后躯暴露所示（ 图1B）。位置与大鼠后爪轻轻地搁在表面上超过表。使用相同的舒适但不紧包装和持有每只大鼠。你的前臂支撑在桌子的边缘，可能会减少之间大鼠变异。
3. 是的一个gentled老鼠准备好测试不会抗拒在毛巾举行连续数分钟，但你可能要重新包装大鼠1或2次测试过程中的两个后爪。

B.背用von Frey测试的测试程序

1. 滚动骰子来决定首先开始测试后肢。偶数代表权的爪子，奇数代表左侧。
2. 松散的包裹在毛巾离开后躯暴露大鼠。
3. 触觉刺激应用于只老鼠后是平静的，至少10秒钟的安静。
4. 4.56 VFH开始，适用于单丝垂直于背表面的第一和第二跖骨之间约1厘米的近端关节（ 图1C）。应用单丝平稳，STEADY方式，超过一秒钟的间隔，直到它弯曲，然后将其删除。这种单一的触摸构成一项试验。
5. 一个积极的反应发生时，老鼠迅速移动从刺激的爪子。经常运动的方向是后或外部，前后肢弯曲。单丝被删除时必须开始撤离，以确认单丝的应用响应。
6. 申请4.56单丝为了防止感官“发条”，并允许感受器回来基线复检前发射（以防止适应）与应用程序之间的至少30秒的两倍多。
7. 刺激试验应重新申请，如果的VFH单，轻轻擦过皮肤，使更多的刷牙或尖的接触，而不是扫描的力量投送。
8. 如果有超过2 4.56单丝（即0或1）更少的积极响应，下一个较大的VFH应用3次以同样的方式。
9. 这种方式在逐渐变大，4.56至5.88 VFHs直到出现两个或两个以上的积极响应，直到达到最大VFH。
10. 缩爪阈值是最低的VFH这引起了3个试验至少2个正面的回应。
11. 重复其他爪子。
12. 测试会话通常可以在15分钟后爪为完成。

3。代表结果

一个成功的测试将导致立即，快步撤离到一个垂直应用VFH后肢从联合（ 图1C）中期的足底地区（ 图1A）或背水面之间的^第一和^第二跖骨1厘米。这些反应是相吻合，获得每个后肢触觉门槛。触觉阈值从急性脊髓背VFH测试显示了良好的保真度与足底的VFH阈值派生D慢性倍（ 图2）。发生足底或背测试所得的触觉阈值下降梯度SCI（ 图3 ^3,5）。这种过敏反应表现为早7天，脊髓损伤后和实验期^3-4,6维持。而脊髓损伤的严重程度不影响触觉阈值的爪子，在阈值下降发生更严重的SCI（ 图3）。重要的是，以下的水平痛觉异常的发展，是一个全或无反应发生时，有超过60％的脑白质病变​​震中损失。 （ 图^3）。

触觉阈值衰减和生产人造低VFH部队。至少有两个条件，可以产生阈值衰减 - 迅速应用VFH的皮肤在戳或猛刺方式或不刺激的应用程序之间的等待足够长的时间。有信心是真正的触觉阈值时，必须采取适用于每个的VFH使用类似的低速方式和刺激间隔必须至少30秒。我们还表明，饮食行为，降低门槛衰变^5。

图1描绘的VFH刺激足底和背冯弗雷头发（VFH）测试位置示意图和照片。一）对于足底VFH测试，冯弗雷头发应适用于垂直中期足底后肢约1厘米后，在一个缓慢的中间指骨（红色框表示在图的后肢足底表面）速度一致，直到它弯曲。 B和C）背VFH技术，是松散的大鼠在手术巾包裹，如照片中所示。 VFH被应用到背表面的爪子之间的第一和第二跖骨approximatelY 1厘米，近端关节。

图2。背冯弗雷头发的感觉阈值与标准足底VFH。 （N-44，Pearson相关系数= 0.503，P <0.01，R2 = 0.67）。虚线表明痛觉超敏感的临界阈值，使用背的的VFH或足底VFH技术，并表明在脊髓损伤后7天使用背VFH测试，痛觉超敏阈值预测慢性以下级痛觉异常足底VFH方法确定的。

图3。早期背冯弗雷头发的感觉阈值预测痛觉超敏和非痛觉超敏的触觉灵敏度，跨在稍后时间点的伤害严重性。类似的感觉阈值之间发生后脊髓背VFH和28天后脊髓损伤足底VFH措施7天。发生了惊人的相似广泛的脊髓损伤，显着的异常性疼痛，指出在中度至重度脊髓损伤（P <.05 1.1毫米与其他各组位移）。

图4。接受椎板切除术（无脊髓损伤）的大鼠和SCI组脊髓损伤后后肢痛觉异常显示在6个星期的百分比。痛觉异常仅见于大鼠中度或重度SCI（俄勒冈州立大学ESCID设备0.9，1.1，1.25，1.3毫米线位移），而轻度脊髓损伤的大鼠（0.3，0.5，0.7毫米的脊髓位移）展出触觉刺激的正常反应。代表冠状脊髓部分髓鞘染色病变椎板震中（无恙控制），轻度（0.5毫米的位移），中度（1.1毫米的位移）和严重（1.3毫米的位移）脊髓挫伤包括显示轴索程度不遗余力，过敏与此相关。 （比例尺= 0.5毫米）。

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图5。冯弗雷上下发测试的样本数据表。头发的价值和结果（正或负），记录每个审判。指出测试脊髓意识的迹象。在测试结束时，在每发价值的反应相吻合。例如数据为选定的阈值盘旋。

Discussion

在这里代表的的VFH测试方法提出两个敏感和有效的使用在大鼠脊髓损伤模型的测试范例。重要的是，背VFH测试创建评估触觉敏锐中期胸椎脊髓损伤大鼠时无法站立，他们的后躯，后肢爪子恢复。此测试范例也可以用来当老鼠恢复的能力，以支持他们的体重和颈椎脊髓损伤后后肢。

两种范式表明，这里利用校准的VFH以确定每个后肢触觉阈值。其他方法确定撤出无论是正常无害的或通常有毒的刺激频率。我们先前已经表明，触觉阈值小的改进，可能代表的慢性神经性疼痛和触觉正常的存在之间的差异。因此，利用实验测试方法，推导出疼痛阈值5月发翻译cilitate潜在的治疗干预的诊所。

作为所有行为测试，这是必要的测试环境内混杂的数量，以尽量减少可能影响行为的测试结果^9。因此，重要的是，在每天的同一时间，在相同的温度和湿度控制的房间，每个测试会话发生。此外，自大鼠在超声波范围内畅所欲言沟通，重要的是保存在一个单独的房间，老鼠等进行测试，直到他们的测试开始。兰福德等 ¹⁰表现出显着的证据表明，天真的动物后遇到目睹1 cagemate接触有害刺激的痛苦。为了进一步消除触觉感官检验中的变异性，我们利用加糖的麦片，作为一个在足底VFH测试认知分心。在我们这样做，稳定的动物的反应。阈值是不太可能腐烂整个测试时，牵引比当一个人是不是^5。这种稳定可能是由于回火草率和灾难的行为，两个疼痛的威胁，激活大脑中的恐惧和情绪中心的预期状态。

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Semmes-Weinstein Monofilaments	Stoelting Co.	58011
Fish Breeder Box	Any Supplier		Hole drilled in side for cereal delivery
Elevated wire mesh (1/4" X 1/4" grid)	Hardware Store
Elastic to hold fish breeder box in place	Any Supplier
Sugared Cereal	Grocery Store
Surgical Huck Towel 16"x 23"	Medical Supply Store