Akutt og kronisk Taktil Sensory Testing etter ryggmargsskade i Rats

Summary

Vi beskriver to taktile sensoriske testmetoder for akutt eller kronisk perioder med ryggmargsskade i rotter. Disse validerte prosedyrer kan oppdage utvikling og vedlikehold av allodyni-lignende opplevelser.

Abstract

Ryggmargsskade (SCI) svekker sansesystemer forårsaker allodyni ^1-8. Å identifisere cellulære og molekylære årsaker til allodyni, følsom og gyldig sensorisk testing i rotte SCI modeller er nødvendig. Men inntil nylig, hadde ingen enkelt test tilnærming blitt validert for SCI slik at standardiserte metoder ikke har blitt gjennomført på tvers av laboratorier. I tillegg kunne tilgjengelige testmetoder ikke iverksettes akutt eller når alvorlig motorisk svikt eksisterte, hindrer studier av utvikling av SCI-indusert allodyni ^tre. Her presenterer vi to validerte sensoriske testing metoder ved hjelp av von Frey hår (VFH) monofilamenter som kvantifisere endringer i taktile sansefysiologi etter SCI ^4-5. En test er den veletablerte Up-Down test som viser høy sensitivitet og spesifisitet på tvers av ulike SCI alvorlighetsgrader når testet kronisk ^fem. Den andre testen er en nyutviklet dorsal VFH test som kan brukes akutt etter SCI når enllodynia utvikler, før motor utvinning ^4-5. Hver VFH monofilament gjelder en kalibrert kraft når rørt til huden av hind labb før den bøyer. I opp-ned metoden, er vekslende VFHs av høyere eller lavere krefter brukes på plantar L5 dermatome å avgrense flexor tilbaketrekning terskler. Suksessivt høyere krefter brukes til uttak skjer da lavere force VFHs brukes til uttak opphører. Den taktile terskelen reflekterer styrken som kreves for å lokke fram uttak i 50% av stimuli. For den nye testen er hver VFH påføres dorsal L5 dermatome av labben mens rotta støttes av sensor. Den VFH stimulering skjer i stigende rekkefølge av makt til minst 2 av 3 applikasjoner på en gitt kraft produserer pote tilbaketrekning. Taktil sensorisk terskel er den laveste makt for å lokke fram tilbaketrekking 66% av tiden. Akklimatisering, testing og scoring prosedyrer blir beskrevet. Avvikende studier som krever en retest og typisk forsøk er definert. Animal bruk wsom er godkjent av Ohio State University Animal Care og bruk komité.

Protocol

1. Opp / Ned Plantar Von Frey Testing

Formålet med testen er å avgjøre taktil følsomhet ved å måle hvor mye kraft som kreves for å lokke fram labben tilbaketrekning fra stimulus. Kommersielt tilgjengelige kalibrerte Von Frey hår monofilamenter mellom utvalgene av 4.56 og 6.10 brukes til å stimulere labben. Andre sanseinntrykk som visualisering av stimulans eller propriosepsjon kan forvirre taktile terskel tiltak slik respons basert på visuell eller proprioseptiv innspill er ugyldige. For å hindre visualisering av monofilament berøre huden, tester vi bare mens rotta er å spise frokostblanding. Denne kognitive distracter, sikrer også at alle rotter er testet på tilsvarende baseline nivå av komfort. For å unngå reaksjoner på grunn av proprioseptiv snarere enn taktile input, har vi ikke inkluderer studier der monofilament løfter eller flytter labben.

A. tilvenning PROSEDYRER FOR UP-down tilnærming

1. Present frukt Cereal i hjemmet buret så rottene gjenkjenne og søke maten belønning. Rotter trenger ikke å være mat fratatt på noe punkt i gentling eller testprosessen.
2. Rotter er klar til å bli akklimatisert til testing miljøet og prosedyrer når de spiser frukt kornblanding i hjemmet buret. Tilvenning skjer over minst 4 økter av 10 minutter hver, men mer kan være nødvendig. Ti minutters økter er brukt, slik at rottene ikke blir mett før slutten av økten.
3. Plasser rotte i prøvingsrommet med tre stykker av frukt kornblanding. Gi ekstra frukt kornblanding ett femtinitti gangen som de blir spist. På den tredje økten mens rotte spiser, produsere håndbevegelser under ledningen gulvet slik at rotta blir vant til bevegelse under labben sin. På den fjerde økten, bruke 5,18 monofilament til plantar overflaten av pote ca en gang i minuttet for totalt ti presentasjoner. En naiv rotte burde ikke reagere på dette sub terskelen stimulans.
4. Tally bitene av korn forbrukes, hyppighet av vannlating og avføring, frysing, og grooming atferd. Frysing skjer på to måter: a) rotte er huket lav til bakken vanligvis nær bakveggen eller vender bort fra eksaminator og forblir urørlig, b) rotte blir bøyd over i midten av buret og vanligvis chattere tennene . Frysing atferd kan fortsette i lange perioder av gangen.
5. En gentled rotte som er klar for testing vil spise nesten kontinuerlig i 10 minutter. Det vil bevege seg lett i buret og søke frukt kornblanding svært raskt etter forbruker den siste. Viktigere, vil rotte ikke slutte å spise eller bli distrahert av håndbevegelser under ledningen gulvet eller monofilament søknad til labben.

B. TEST PROSEDYRER FOR UP-down tilnærming

1. Rotter produsere distress vocalizations som er over vår menneskelige aural serien. Rotter som venter på å bli testet bør oppbevares i et eget rom slik at de ikke kan høre disse VOCalizations.
2. Rotter med ryggmargsskade som er aktuelle for opp-ned von Frey hår testing må demonstrere vektbæring med bena. Lemmer som ikke klarer å støtte rotte kan ikke pålitelig testet fordi anvendelsen av monofilamenter flytter labb før håret svingene.
3. Plasser en rotte i prøvingsrommet med 2 eller 3 biter av frukt kornblanding. Rotter skal spise i løpet av hver VFH søknad.
4. Rull en terning for å bestemme hvilke HL å begynne å teste først. Selv tallene representerer høyre labben og oddetall representerer venstre.
5. Begynn testing økt med 5,18 monofilament. Uttak kan forekomme 4,56 til 6,10 i normale og SCI rotter og 5.18 monofilament faller i midten av intervallet.
6. Ikke påfør en monofilament mens en rotte fryser, bøyer seg eller ikke spiser. Dersom tester venter, noen ganger disse forholdene vil løse og testing kan fortsette. Hvis rotta viser disse atferd og total tid i Apparatus er 20 minutter, stoppe testing og retest fra starten neste dag. Ikke fjern rotta mens den viser slik atferd, da dette kan øke forekomsten. Vent til rotte bryter ut av disse mønstrene før håndtering det å unngå å forsterke disse problemene.
7. Trykk på monofilament til L5 plantar dermatome av hind pote mellom foten pads inntil den bøyer (se figur 1A). Dette glatt jevn søknad bør ta ca ett sekund deretter fjerne det fra huden. Unngå å berøre noen del av foten pads som følsomheten i huden er mye lavere i disse områdene. Dette enkelt trykk utgjør en rettssak.
8. En positiv respons oppstår når rotta raskt løfter labben opp vekk fra monofilament. Tilbaketrekningen skal være initiert av den tiden monofilament er fjernet for å bekrefte at svaret er tilknyttet monofilament søknaden.
9. Se dyret for andre tegn på bevissthet om monofilament berøring som stemmebruk, ser nedover, bakover eller på testet labben, slikker labben, vedvarende pote tilbaketrekning eller rykninger ørene. Merk dem på databladet. Når disse atferd oppstår med labben uttak den tjener som bevis for supraspinal oppfatning av stimulans.
10. Hvis det er en positiv respons, gjelder det nest laveste monofilament. Hvis det er noen reaksjon (negativ), flytte opp til neste høyere monofilament. Tillat 30 sekunder mellom hver monofilament søknad for de sensoriske reseptorer for å komme tilbake til baseline avfyring før ny testing (for å hindre tilpasning).
11. Fortsett å bruke høyere eller lavere monofilamenter til hind labb basert på positive eller negative reaksjoner til du har 10 forsøk. Gjenta deretter på den andre hind labben. (Se eksempel datablad).
12. Den høyeste VFH som kan testes uten å innføre proprioseptiv innspill og løfte labben er 6,10. Den 6.45VFH og større bør ikke brukes fordi labben løfter før monofilament svinger. Hvis det er noen reaksjon på 6,10 så den neste rettssaken vil bruke 6,10 igjen.
13. Et svar skal tømmes og rettssaken må re-testes hvis ett av følgende skjer under stimulus søknad eller labben uttak:
    1. Rotta er ikke kontinuerlig spise.
    2. Rotta beveger seg bort fra VFH stimulans før bøying av monofilament, noe som gjør det umulig å vite kraften som utløser tilbaketrekningen respons.
    3. Den pote løftes av VFH (enten før eller etter VFH er bøyd) gir proprioseptiv i tillegg til taktil stimulering.
14. En testøkt vanligvis kan gjennomføres på mindre enn 15 minutter for begge bakbena.

C. Data Processing for opp-down tilnærming

1. En vellykket test vil ha 10 sekvensielle forsøk for hver pote.
2. Verdien av den taktile terskel er den laveste monofilament som produserer paw uttak på & ge; 50% av presentasjonene og 3 eller flere presentasjoner av monofilament har gis (se eksempel dataark er terskler innringet).
3. Et monofilament med bare to totalt studier er ikke valgt som terskelen, selv når en rettssak er positiv og en negativ. Flere presentasjoner av stimulus er bedre indikatorer på mønsteret av reaksjoner på at maktbruk.
4. Hvis det ikke er monofilament som produserer positive responser på minst 50% av testene, er rotte gitt en score på 6,45. Dette betyr at rotta ikke oppdage den høyeste testbar monofilamenter 6,10 utover tilfeldig sjanse. En verdi på 6,45 er gitt fordi den representerer den neste verdien høyere enn testbar utvalg av monofilamenter.
5. Konverter terskelverdi for høyre og venstre potene i gram kraft. De gram force verdiene vil bli gitt av leverandøren av von Frey hår. . For data fra bilaterale skader, kan terskelen gram kraft for de to labber midles sammen for å gien enkelt score.

2. Dorsal Von Frey Testing

Hensikten med denne testen er å avgjøre taktil følsomhet i rotter med så dårlig motorisk kontroll at de ikke kan testes ved hjelp av typiske plantar VFH metoder. Det tallfester hvor mye berøring kraft er nødvendig for å produsere en motvilje respons. For å unngå reaksjoner proprioseptive stimuli vi ikke inkluderer studier der labben blir flyttet av den VFH under påføring. I tillegg har vi ikke inkluderer studier der VFH slips eller børstet over framsiden av foten.

A. tilvenning PROSEDYRER FOR Dorsal VON Frey TESTING

1. Gentle rotter for fire økter på 10 minutter hver før baseline testing og ryggmargsskade.
2. Vikle opp rotte i et lite håndkle slik at bakparten er eksponert som vist nedenfor (figur 1B). Plasser rotte over et bord med bakbeina labber lett hviler på overflaten. Bruk sammegodt, men ikke stramt sjal og holder for hver rotte. Avstiving underarmen på kanten av bordet kan redusere variabilitet mellom rotter.
3. En gentled rotte som er klar for testing vil ikke motstå å bli holdt i håndkle i flere påfølgende minutter, men du må re-vikle rotte en eller 2 ganger under testingen av begge bakbeina poter.

B. testprosedyrer for Dorsal VON Frey TESTING

1. Rull en terning for å bestemme hvilke hind lemmer for å begynne å teste først. Selv tallene representerer høyre labben og oddetall representerer venstre.
2. Vikle opp rotte inn håndkleet forlater bakparten utsatt.
3. Taktil stimulans brukes kun etter at rotta er stille og rolig i minst 10 sekunder.
4. Starter med 4,56 VFH, bruke monofilament vinkelrett på framsiden i mellom første og andre metatarsal ca 1 cm proksimalt for leddet (figur 1C). Påfør monofilament i en jevn, Steady måte over en ett sekund intervall inntil den bøyer deretter fjerne den. Dette enkelt trykk utgjør en rettssak.
5. En positiv respons oppstår når rotta raskt flytter labben bort fra stimulus. Retning av bevegelse er ofte posterior eller ekstern før hind lem blir bøyd. Tilbaketrekningen skal være initiert av den tiden monofilament er fjernet for å bekrefte at svaret er tilknyttet monofilament søknaden.
6. Påfør 4,56 monofilament to ganger mer med minst 30 sekunder mellom programmer for å forebygge sensorisk "windup" og å la sensoriske reseptorer for å komme tilbake til baseline skyte før ny testing (for å hindre tilpasning).
7. En stimulus test bør på nytt dersom VFH slips og forsiktig beiter huden, slik at kraften levering mer en børsting eller et sveip snarere enn en spiss kontakt.
8. Hvis det er færre enn 2 (dvs 1 eller 0) positive respons på 4,56 monofilament, blir neste større VFH søkt 3ganger på samme måte.
9. På denne måten blir stadig større VFHs fra 4,56 via 5,88 påføres inntil to eller flere positive svar forekommer eller til den største VFH er nådd.
10. Den pote uttak terskel er den laveste VFH som utløser minst 2 positive responser ut av 3 forsøk.
11. Gjenta på den andre labben.
12. En testøkt vanligvis kan være ferdig i 15 minutter for begge bakbeina poter.

3. Representative Resultater

En vellykket test vil resultere i en umiddelbar, rask tilbaketrekking av hind labben til en vinkelrett anvendt VFH til midten av plantar regionen (figur 1A) eller dorsal overflaten mellom ^1. og ^2. metatarsal 1 cm fra felles (figur 1C) . Disse svarene er talt å utlede taktilt terskelen for hver hind labben. Taktile terskler fra dorsal VFH tester i akutt SCI viste utmerket troskap med plantar VFH terskler utleded ved kroniske tider (figur 2). Reduksjoner i taktile terskler avledet av plantar eller dorsal tester oppstå for gradert SCI (figur 3 ^3,5). Dette overfølsomhet manifesterer så tidlig som 7 dager etter SCI og opprettholdes så lenge forsøket ^3-4,6. Mens en rekke SCI alvorlighetsgrader ikke påvirker taktile sensoriske terskler i labben, nedgang i terskler oppstå på mer alvorlig SCI (figur 3). Viktigere, er utvikling av under-nivå allodyni en alt-eller ingen respons som oppstår når det er et tap på mer enn 60% av hvit substans ved lesjon episenteret. (Figur 4 ^3).

Taktile terskler kan forfalle og produsere kunstige svar til lave VFH krefter. Minst to forholdene kan produsere terskel forfall - raskt påføre VFH til huden i en poking eller jabbing måte eller ikke vente lenge nok mellom stimulans applikasjoner. For å være trygg på atDet taktile tersklene er ekte, må man sørge for å bruke hver VFH med en tilsvarende lav hastighet tilnærming og interstimulus intervallet må være minst 30 sek. Vi har også vist at spiseatferd reduserer terskelen forfall ^5.

Figur 1. Skjematisk og fotografi som avbilder plasseringen av VFH stimulering for plantar og dorsal von Frey hår (VFH) testing. A) For plantar VFH testing, bør von Frey hår brukes vinkelrett på midten plantar hindpaw ca 1 cm i bakkant midten phalange (som indikert ved den røde boksen i diagram av plantar overflaten av hindpaw) ved lav jevn hastighet inntil den bøyer. B og C) For dorsal VFH teknikken, er rotta løst pakket i en kirurgisk håndkle som vist på bildet. Den VFH påføres dorsal overflaten av labben i mellom første og andre metatarsal approximately 1 cm proksimalt for leddet.

Figur 2. Dorsal von Frey hår sensoriske terskler relateres til standard plantar VFH. (N-44; Pearson Koeffisient = 0,503, p <0,01, R2 = 0,67). Stiplede linjene viser cutoff terskelen for allodynic følelse ved hjelp av enten Dorsal VFH eller plantar VFH teknikker og vise at allodynic terskler på 7 dager etter SCI bruker Dorsal VFH testen forutsi kronisk under-nivå allodyni bestemmes av plantar VFH metoder.

Figur 3. Tidlige dorsal von Frey hår sansefysiologi forutsi allodynic og ikke-allodynic taktil følsomhet over skadetallene alvorlighetsgrader ved senere tidspunkter. Sammenlignbare sansefysiologi skjedde mellom 7 dager etter SCI Dorsal VFH og 28 dager post SCI plantar VFH tiltak. Slående likhet skjedde for en bredt spekter av SCI, med betydelig allodyni bemerket i moderat til alvorlig SCI (p <0.05 1,1 mm forskyvning mot alle andre grupper).

Figur 4. Prosentandel av rotter som fikk laminektomi (ingen SCI) og SCI grupper viser hindpaw allodyni ved 6 uker etter SCI. Allodyni ble bare sett i rotter med moderate eller alvorlige Sci (OSU ESCID enhet 0.9, 1.1, 1.25, 1.3 mm ledningen forskyvninger) mens rotter med mild SCI (0,3, 0,5, 0,7 mm ryggmarg forskyvninger) utstilte normale reaksjoner på taktil stimulering. Representative koronale ryggmarg seksjoner farges for myelin på lesjonens episenteret for laminektomi (friske kontroll), mild (0,5 mm forskyvning), er moderate (1,1 mm forskyvning) og alvorlig (1,3 mm forskyvning) ryggmarg contusions inkludert for å vise graden av aksonal sparsom som er tilknyttet denne overfølsomhet. (Skala bar = 0,5 mm).

k ">

Figur 5. Et eksempel datablad for opp-ned von Frey hår testing. Håret verdi og resultat (positiv eller negativ) blir registrert for hvert forsøk. Indikasjoner på supraspinal bevissthet testingen er notert. På slutten av testen, er svarene på hvert hår verdi stemte. Den valgte grenseverdi for eksempel data sirkel.

Discussion

De VFH testmetoder presenteres her representerer to testing paradigmer som er følsomme og gyldig for bruk i rotte SCI modeller. Viktigere var dorsal VFH testen skapt for vurdering av gjenvinning av taktile følelse av bakbeina potene akutt etter mid-thorax SCI når rotter ikke klarer å stå på sine bakben. Denne testingen paradigmet kan også brukes når rottene igjen evnen til å støtte sin vekt og for de baklemmene etter cervical SCI.

De to paradigmer demonstreres her utnytte kalibrert VFH å bestemme taktile terskelen for hver hind labben. Andre metoder bestemme frekvensen av uttak til enten en normalt ufarlige eller normalt skadelige stimuli. Vi har tidligere vist at små forbedringer i taktile terskler kan representere forskjellen mellom tilstedeværelsen av kronisk nevropatisk smerte og normal taktil følelse. Derfor benytter eksperimentelle testmetoder som henter smerteterskel kan facilitate oversettelse av potensielle terapeutiske intervensjoner til klinikken.

Som med all atferdsmessige testing, er det viktig å minimere antall confounders innen testing miljøet som kan påvirke utfallet av atferdsmessige testen ^ni. Derfor er det viktig at hver testøkt skjer på samme tid på dagen, i samme temperatur og luftfuktighet kontrollert rom. I tillegg, siden rottene kommunisere vocally i en ultrasonisk rekkevidde, er det viktig at rottene venter på å bli testet er holdt i et eget rom til sin testing starter. Langford et al ¹⁰ viste dramatisk bevis på at naive dyr opplever smerte etter vitne til en cagemate utsatt for skadelige stimulering. For ytterligere å eliminere variasjoner i taktilt sensorisk testing, bruker vi sukret frokostblanding som en kognitiv distraktøranalyse under plantar VFH testing. Dermed stabilisere vi svarene av dyret. Terskelen er mindre sannsynlig å forfalle gjennomtesting når en distraktøranalyse gis enn når man ikke er ^fem. Dette stabilisering er sannsynlig på grunn av temperering av hypervigilant og catastrophizing atferd, to antatt stater hvor trusselen om smerte aktiverer frykt og emosjonelle sentre i hjernen.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Semmes-Weinstein Monofilaments	Stoelting Co.	58011
Fish Breeder Box	Any Supplier		Hole drilled in side for cereal delivery
Elevated wire mesh (1/4" X 1/4" grid)	Hardware Store
Elastic to hold fish breeder box in place	Any Supplier
Sugared Cereal	Grocery Store
Surgical Huck Towel 16"x 23"	Medical Supply Store