Summary
Замедленного типа гиперчувствительности (DTH) является воспалительная реакция опосредована CCR7-эффекторных памяти T (ПЭМ) лимфоцитов. Здесь мы показываем, как активировать антиген-специфические клетки ТЕМ, вызывают приемные DTH у крыс Льюиса и контролировать воспалительную реакцию.
Abstract
Замедленного типа гиперчувствительности (DTH) является воспалительная реакция опосредована CCR7-эффекторные Т-лимфоциты памяти, что проникнуть в месте введения антигена, против которого иммунная система была загрунтовать. Воспалительная реакция характеризуется покраснением и отеком сайт антигенный вызов. Это удобная модель для определения в естественных условиях эффективность иммунодепрессанты. Кожные DTH могут быть вызваны либо приемных передачи антиген-специфические Т-лимфоциты или активной иммунизации с антигеном, и последующие внутрикожные проблема с антигеном, чтобы вызвать воспалительную реакцию в данной области кожи. DTH реакции могут быть вызваны на различные антигены, например, яичный альбумин, туберкулин, столбняка, или замочную скважину блюдечко гемоцианин. Такая реакция может быть вызвана против аутоантиген, например к основному белку миелина (ОБМ) у крыс с экспериментальным аутоиммунный энцефаломиелит индуцированной с MBP, животной модели рассеянного склероза (1). Здесь показано, как вызвать приемных DTH реакцию Льюиса крыс. Сначала стимулировать овальбумином специфические клетки Т в пробирке и вводят эти клетки активированы внутрибрюшинно наивному крыс. После учета клетки, чтобы уравновесить в естественных условиях в течение 2 дней, мы будем вызов крыс с овальбумина в ушной раковины на одно ухо, а другой Виль ухо получить физиологический раствор. Воспалительная реакция будет виден 3-72 часов позже, и ухо толщина будет оцениваться как указание DTH тяжести.
Protocol
1. Стимуляция овальбумином конкретные Т-лимфоцитов
Отдых овальбумина-специфических Т клетки стимулируются овальбумином в присутствии облученных крыс тимоцитов Льюис (30 Гр), как антиген представляющих клеток (БТР), в Стимуляция среднего (Подготовка в DMEM + Pen / Strep / L-Glut + + NEAA RPMI Витамины + + 2ME Крыса сыворотки + Овальбумин, в конечной концентрации отмечены в списке материалов.)
Крыса сыворотки подготовки
- Мы принимаем сыворотки крыс мы жертвуем, как вилочковая железа доноров.
- Крысы глубоко под наркозом на галотан вдоха и так много крови возможно рисуется сердечной перфузии (5-10 мл на крысу) с помощью 10 мл шприцев и 23 G 1 "иглы, после чего крысы немедленно обезглавленный для обеспечения смерти.
- Кровь разрешено сгустка в течение 10 мин при 37 ° С, затем 10 мин на льду.
- Сгусток удаляется, а оставшаяся жидкость нити.
- Сыворотки собирается, стерильно фильтруют и хранят при температуре -20 ° C.
Подготовка антиген представляющих клеток
- Возьмите тимуса крысы обезглавленное использованием стерильных инструментов и поместить его в PBS содержащие пенициллин и стрептомицин (PBS-PS), на льду.
- Возьмите тимуса на капот культуры ткани, очистите его от сгустков крови и других загрязняющих ткани и нарезать его на мелкие кусочки в ячейку фильтра (Fisher # 08-771-2), помещенных в 10 см, чашки Петри, содержащие 10 мл PBS- PS.
- Каждая часть продавливается через ячейки сетчатого фильтра использованием задней стерильный 1 поршень шприца мл. Сбор суспензии отдельных клеток в 50 мл пробирку на льду.
- Промойте ячейки фильтра с 20-40 более мл PBS-PS. Центрифуга подвеска 1250G и ресуспендируют осадок в PBS-ПС, 5 мл / вилочковой железы, на льду.
- Радиация этой суспензии (30 Гр) в гамма излучателем и сразу же промыть его в два раза по 50 мл PBS-PS.
Примечание: лучшее тимуса доноры молодых взрослых крыс, 5-7 недель. Крысы до 10 недель могут быть использованы, но количество клеток уменьшается со временем. Гендерный не важно, хотя некоторые люди говорят, что мужчины лучше тимуса доноров. Мы всегда используем женщин, потому что все наши животные размещаются в одной комнате, и мы не хотим, мужчин и женщин в одной комнате.
Стимуляция
- Вымойте Т-лимфоцитов раз и сосчитать их.
- Граф антиген-представляющих клеток.
- Смешайте 3 х 10 6 овальбумина-специфических Т клеток с 150 х 10 6 БТР в 10 см, чашки Петри, содержащие 10 мл стимуляции среды.
- Инкубируйте в течение 48 часов при температуре 37 ° C.
2. Приемные передачи овальбумином конкретные Т-лимфоцитов
- Крыс мы используем в качестве получателей женщин 7-10 недель.
- Граф Т-лимфоцитов, они должны быть большие, круглые. Антиген-представляющих клеток будет мертв.
- Центрифуга Т-лимфоцитов и их ресуспендируют в 10 х 10 6 клеток / мл в PBS.
- Inject 1 мл внутрибрюшинно с помощью 3 мл шприцев и 23 G 1 "иглы.
3. Вызов с антигеном в ухе
- Через два дня после приемных передачи, вводят 20 мкл 1 мг / мл овальбумина решение (= соответствующих антигенов), в одно ухо и физиологического раствора (или не имеют отношения антиген) в другое ухо. Не фильтровать антигену решение, как вы можете потерять агрегатов, которые усиливают воспалительные реакции.
Примечание: крысы должны быть под наркозом, чтобы избежать движения. Если вы правша, держать ухо между большим пальцем левой руки и указательный палец, указательный палец, находясь внутри уха и крысы к себе.
- Inject решение в ушной раковины из уха использованием 27G ½ "иглы. Попробуйте придать всех крыс ровно в том же месте.
4. Измерение DTH
- Ухо начнет становится красным и набухать, как признаком воспаления. Измерьте толщину каждого уха с пружинным микрометра (например, модель PK-0505 от Mitutoyo).
- Возьмите 5-6 измерений для каждого уха в каждой временной точке и вычислить среднее.
- Максимальное набухание должно произойти между 24 и 72 часов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Антигенный вызов может также выполняться на других объектах, например, в кожу спины (2). Мы, однако, что сложно. Использование ушной раковины из уха, как показано в этом видео, позволяет наиболее точное измерение DTH реакцию.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Мы благодарим д-р Александр Flügel (Martinsried, Германия) за предоставление нам GFP-маркированы, яичный альбумин-специфических Т клеточной линии, используемые в настоящем протоколе.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12430-062 | 500ml |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | 1 mM final, in Stimulation medium |
| Penicillin – Streptomycin – L-Glutamine | Cambrex/BioWhittaker | 17-718R | 100 u/ml - 100 μg/ml - 4 mM respectively, final, in Stimulation Medium |
| Non essential amino acids | Sigma-Aldrich | R7131 | NEAA, 1% final, in Stimulation Medium |
| RPMI vitamins | Sigma-Aldrich | R7256 | 1% final, in Stimulation medium |
| beta-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | 2ME, 50 μM final, in Stimulation Medium |
| Syngeneic rat serum | 1% final. See explanation in Protocol. | ||
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5503 | 10 μg/ml final, in Stimulation Medium. |
References
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. , 166-936 (2001).
- Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats. J Vis Exp. (5), (2007).
