Summary
Type de l'hypersensibilité retardée (DTH) est une réaction inflammatoire médiée par CCR7-effectrices T mémoire (TEM) des lymphocytes. Ici nous démontrons comment activer les cellules spécifiques de l'antigène TEM, induisent SRD adoptifs chez le rat Lewis et de surveiller la réponse inflammatoire.
Abstract
Type de l'hypersensibilité retardée (DTH) est une réaction inflammatoire médiée par CCR7-lymphocytes T effecteurs mémoire qui infiltrent le site de l'injection d'un antigène contre lequel le système immunitaire a été amorcée. La réaction inflammatoire est caractérisée par une rougeur et une enflure du site de stimulation antigénique. C'est un modèle pratique pour déterminer l'efficacité in vivo d'immunosuppresseurs. SRD cutanée peut être induite soit par transfert adoptif de lymphocytes T spécifiques d'antigènes ou par l'immunisation active avec un antigène, et les suivantes défi intradermique avec l'antigène pour induire la réaction inflammatoire dans une zone de peau donnés. Réponses DTH peuvent être induites à des antigènes différents, par exemple pour l'ovalbumine, la tuberculine, anatoxine tétanique, ou hémocyanine de patelle. Ces réactions peuvent aussi être induite contre les autoantigènes, par exemple pour la protéine de myéline de base (MBP) chez le rat avec l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale induite par le MBP, un modèle animal de sclérose en plaques (1). Ici nous démontrons comment induire une réaction adoptifs SRD chez le rat Lewis. Nous allons d'abord stimuler les cellules T spécifiques de l'ovalbumine, in vitro et injecter ces cellules activées par voie intrapéritonéale à des rats naïfs. Après avoir laissé les cellules in vivo pour s'équilibrer pendant 2 jours, nous mettra au défi les rats avec de l'ovalbumine dans le pavillon d'une oreille, tandis que l'autre oreille wil recevez saline. La réaction inflammatoire sera visible 3-72 heures plus tard et l'épaisseur de l'oreille va être mesurée comme une indication de la gravité de SRD.
Protocol
1. La stimulation des lymphocytes T spécifiques d'ovalbumine
Repos ovalbumine cellules T spécifiques sont stimulés avec de l'ovalbumine en présence des thymocytes irradiés de rats Lewis (30 Gy) comme des cellules présentatrices d'antigènes (APC), en milieu de stimulation (Préparer dans du DMEM + Pen / Strep / L-Glut + + NEAA RPMI Vitamines + + 2ME sérum de rat + ovalbumine, à la concentration finale noté dans la liste des matériaux.)
Préparation de sérum de rat
- Nous prenons sérum du rat nous sacrifier en tant que donateurs thymus.
- Les rats sont profondément anesthésiés par inhalation d'halothane et autant de sang que possible est dessiné par perfusion cardiaque (5-10 ml par rat) en utilisant 10 ml et les seringues 23 G 1 "aiguilles, après laquelle les rats sont immédiatement décapités pour assurer la mort.
- Le sang est autorisé à se coaguler pendant 10 min à 37 ° C suivi de 10 min sur la glace.
- Le caillot est retiré et le liquide restant filé.
- Le sérum est recueilli, stérilisée par filtration et conservés à -20 ° C.
Préparation des cellules présentatrices d'antigènes
- Prenez le thymus d'un rat décapité à l'aide d'instruments stériles et placez-le dans du PBS contenant de la pénicilline et la streptomycine (PBS-PS), sur la glace.
- Prenez le thymus pour une hotte de culture de tissus, de le nettoyer de caillots de sang et autres tissus contaminant et le couper en petits morceaux dans une passoire cellule (Fisher # 08-771-2) placé dans une boîte de Pétri de 10 cm contenant 10 ml de PBS- PS.
- Chaque pièce est pressé à travers le tamis de cellules en utilisant le dos d'un piston de la seringue stérile de 1 ml. Recueillir la suspension seule cellule dans un tube de 50 ml sur la glace.
- Rincer la crépine cellule avec plus de 20-40 ml de PBS-PS. Centrifuger la suspension à 1250g et resuspendre le culot dans du PBS-PS, 5 ml / thymus, sur la glace.
- Irradier cette suspension (30 Gy) dans un irradiateur gamma et immédiatement laver deux fois avec 50 ml de PBS-PS.
Remarque: Le meilleur des donateurs du thymus sont de jeunes rats adultes, des semaines 5-7 ans. Les rats jusqu'à 10 semaines peuvent être utilisés mais le nombre de cellules diminue avec le temps. Sexe n'est pas important, bien que certaines personnes disent que les hommes sont mieux donateurs thymus. Nous utilisons toujours les femmes parce que tous nos animaux sont logés dans la même chambre et nous ne voulons pas les mâles et les femelles dans la même pièce.
La stimulation
- Lavez les lymphocytes T une fois et les compter.
- Compter les cellules présentatrices d'antigène.
- Mélanger 3 x 10 6 ovalbumine cellules T spécifiques de 150 x 10 6 TTB dans un plat de 10 cm de Pétri contenant 10 ml de milieu de stimulation.
- Incuber pendant 48 heures à 37 ° C.
2. Le transfert adoptif de lymphocytes T spécifiques d'ovalbumine
- Les rats que nous utilisons en tant que bénéficiaires sont des femmes de 70 à 10 semaines.
- Comptez le nombre de lymphocytes T, ils doivent être grands et ronds. Les cellules présentatrices d'antigène sera mort.
- Centrifuger les lymphocytes T et les remettre en suspension à 10 x 10 6 cellules / ml dans le PBS.
- Injecter 1 ml par voie intrapéritonéale en utilisant 3 ml et les seringues 23 G 1 "aiguilles.
3. Défi avec l'antigène dans l'oreille
- Deux jours après le transfert adoptif, injecter 20 ul d'une solution à 1 mg / ml d'ovalbumine (antigène = lieu) dans une oreille et une solution saline (ou antigène non pertinent) dans l'autre oreille. Ne pas filtrer la solution d'antigène que vous risquez de perdre des agrégats qui améliorent la réaction inflammatoire.
Remarque: Les rats doivent être anesthésiés pour éviter les mouvements. Si vous êtes droitier, tenez l'oreille entre le pouce et l'index gauche, l'index étant à l'intérieur de l'oreille et le rat en face de vous.
- Injectez la solution dans le pavillon de l'oreille à l'aide 27G ½ "aiguilles. Essayez d'injecter tous les rats exactement au même endroit.
4. Mesure de la SRD
- Les oreilles vont commencer à tourner rouge et gonflent en tant que signe d'inflammation. Mesurer l'épaisseur de chaque oreille avec un micromètre à ressort (pour le modèle par exemple PK-0505 de Mitutoyo).
- Prendre 5-6 mesures pour chaque oreille à chaque point dans le temps et calculer la moyenne.
- Le gonflement maximal devrait se produire entre 24 et 72 heures.
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Discussion
La stimulation antigénique peut également être effectuée à d'autres sites, par exemple dans la peau du dos (2). Nous avons cependant trouvé que la contestation. Utilisation du pavillon de l'oreille, comme le montre cette vidéo, permet la mesure la plus précise de la réaction de DTH.
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Acknowledgments
Nous remercions le Dr Alexander Flügel (Martinsried, Allemagne) pour nous avoir fourni la GFP-étiquetée, l'ovalbumine spécifiques lignée cellulaire T utilisé dans ce protocole.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12430-062 | 500ml |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | 1 mM final, in Stimulation medium |
| Penicillin – Streptomycin – L-Glutamine | Cambrex/BioWhittaker | 17-718R | 100 u/ml - 100 μg/ml - 4 mM respectively, final, in Stimulation Medium |
| Non essential amino acids | Sigma-Aldrich | R7131 | NEAA, 1% final, in Stimulation Medium |
| RPMI vitamins | Sigma-Aldrich | R7256 | 1% final, in Stimulation medium |
| beta-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | 2ME, 50 μM final, in Stimulation Medium |
| Syngeneic rat serum | 1% final. See explanation in Protocol. | ||
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5503 | 10 μg/ml final, in Stimulation Medium. |
References
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. , 166-936 (2001).
- Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats. J Vis Exp. (5), (2007).
