Summary
סוג של רגישות יתר מאוחרת (DTH) היא תגובה דלקתית בתיווך CCR7-מפעיל זיכרון T (TEM) לימפוציטים. כאן אנו מדגימים כיצד להפעיל את אנטיגן ספציפי לערמונית תאים TEM, לגרום DTH המאמצת בחולדות לואיס לפקח על התגובה הדלקתית.
Abstract
סוג של רגישות יתר מאוחרת (DTH) היא תגובה דלקתית בתיווך CCR7-T לימפוציטים מפעיל זיכרון לחדור את האתר של הזרקה של אנטיגן נגד שבו המערכת החיסונית כבר דרוך. התגובה הדלקתית מאופיין אדמומיות ונפיחות של האתר של אתגר antigenic. זהו מודל נוח על מנת לקבוע את ביעילות vivo של מערכת החיסון. DTH עורית יכול להיגרם גם על ידי העברת המאמצת של אנטיגן ספציפי לערמונית לימפוציטים מסוג T או על ידי חיסון פעיל עם אנטיגן, והאתגר intradermal הבאים עם האנטיגן לעורר תגובה דלקתית באזור העור נתון. התגובות DTH יכול להיגרם אנטיגנים שונים, ovalbumin למשל, טוברקולין, טטנוס toxoid, או hemocyanin חור המנעול עלוקה. תגובות כאלה יכולות להיגרם גם נגד autoantigen, למשל חלבון המיאלין הבסיסי (MBP) בחולדות עם ניסיוני אוטואימוניות Encephalomyelitis המושרה עם MBP, מודל חיה עבור טרשת נפוצה (1). כאן אנו מדגימים כיצד לגרום תגובת DTH המאמצת של לואיס חולדות. אנחנו יהיה הראשון לעורר ovalbumin ספציפי בתאי T במבחנה להזריק intraperitoneally תאים אלה מופעלים על חולדות נאיבי. לאחר המאפשר לתאים לאזן in vivo עבור 2 ימים, נוכל לאתגר חולדות עם ovalbumin ב פינה של באוזן אחת, בעוד אחרים מקבלים wil האוזן מלוחים. התגובה הדלקתית יהיה גלוי 3-72 שעות לאחר מכן ועובי האוזן תימדד כאינדיקציה לחומרת DTH.
Protocol
1. גירוי של ovalbumin ספציפי לימפוציטים מסוג T.
מנוחה ovalbumin ספציפי בתאי T הם מגורה עם ovalbumin בנוכחות מוקרן thymocytes לואיס חולדה (30 Gy), כמו תאים הצגת אנטיגן (נגמ"שים), ב בינוני גירוי (הכינו DMEM + פן / סטרפטוקוקוס / L-שפע + + NEAA RPMI ויטמינים + + 2ME עכברוש סרום + Ovalbumin, בכל הריכוזים הסופי לציין ברשימת החומרים.)
עכברוש בסרום הכנה
- אנחנו לוקחים סרום של חולדות להקריב כפי שאנו תורמים התימוס.
- חולדות מורדמים עמוקות שאיפה halothane וכן דם רב ככל האפשר נמשך על ידי זלוף לב (50-10 מ"ל לכל חולדה) באמצעות מזרקים 10 מ"ל ו - 23 ג 1 "מחטים, שלאחריו חולדות הן ערופה מיד על מנת להבטיח מוות.
- הדם מותר קריש עבור 10 דקות בשעה 37 ° C ואחריו 10 דקות על הקרח.
- קריש הוא להסיר את הנוזל הנותר הסתובב.
- הסרום נאסף, סטרילי, מסונן ומאוחסן ב -20 ° C.
הכנת התאים המציגים אנטיגנים
- קח את התימוס של חולדה ערופה באמצעות מכשירים סטריליים ולמקם אותו PBS המכיל פניצילין וסטרפטומיצין (PBS-PS), על קרח.
- קח את התימוס כדי ברדס בתרבית רקמה, לנקות אותו מכל קרישי דם ורקמות אחרות לזהם לחתוך אותו לחתיכות קטנות לתוך מסננת תא (פישר # 08-771-2) להציב צלחת פטרי 10 ס"מ המכיל 10 מ"ל של PBS- PS.
- כל תכשיט הוא לחוץ דרך מסננת התא באמצעות האחורי של הבוכנה סטרילי 1 מ"ל במזרק. אסוף את ההשעיה תא בודד לתוך שפופרת 50 מ"ל על הקרח.
- שוטפים את מסננת תא עם עוד 20-40 מ"ל של PBS-PS. צנטריפוגה את ההשעיה על 1250g ו resuspend גלולה PBS ב-PS, 5 מ"ל / התימוס, על הקרח.
- מקרינים זה השעיה (30 Gy) ב irradiator גמא מיד לשטוף אותו פעמיים עם 50 מ"ל PBS-PS.
הערה: תורמים התימוס הטובים ביותר הם חולדות מבוגרים צעירים, 5-7 שבועות הישן. החולדות עד 10 שבועות, ניתן להשתמש אך את מספר התאים יורדת עם הזמן. מין לא חשוב אם כי כמה אנשים אומרים כי הזכרים הם תורמים התימוס טוב יותר. אנחנו תמיד להשתמש נקבות כי כל בעלי החיים שלנו הם שוכנו בחדר אחד ואנחנו לא רוצים זכרים ונקבות באותו חדר.
גירוי
- שטפו את לימפוציטים מסוג T אחת לספור אותם.
- הרוזן אנטיגן הצגת תאים.
- מערבבים 3 x 10 6 ovalbumin ספציפי בתאי T עם 150 x 10 6 נגמ"שים בתוך צלחת פטרי 10 ס"מ המכיל 10 מ"ל של גירוי בינוני.
- דגירה של 48 שעות ב 37 ° C.
2. העברת המאמצת של ovalbumin ספציפי לימפוציטים מסוג T.
- חולדות נשתמש כמקבל הן נקבות 7-10 שבועות.
- ספירת לימפוציטים מסוג T, הם צריכים להיות גדולים ועגולים. הצגת אנטיגן תאים יהיה מת.
- צנטריפוגה לימפוציטים מסוג T ו resuspend אותם 10 x 10 6 תאים / מ"ל PBS.
- הזרק 1 intraperitoneally מ"ל באמצעות 3 מזרקים מ"ל ו 23 G 1 "מחטים.
3. האתגר עם אנטיגן באוזן
- יומיים לאחר העברת המאמצת, להזריק 20 μl של 1 מ"ג / מ"ל ovalbumin פתרון (= אנטיגן רלוונטי) באוזן אחת מלוחים (או אנטיגן רלוונטי) באוזן אחרים. האם לא לסנן את הפתרון אנטיגן כפי שאתה עלול לאבד אגרגטים המשפרים את התגובה הדלקתית.
הערה: חולדות צריכות להיות בהרדמה כדי למנוע תנועות. אם אתם ימניים, החזיקו את האוזן בין אגודל שמאל האצבע, האצבע המורה להיות בתוך האוזן ואת עכברוש פונה אליך.
- להזריק את הפתרון פינה של האוזן באמצעות 27G "מחטים ½. נסו להזריק כל החולדות בדיוק באותו מקום.
4. מדידה של DTH
- האוזן יתחיל ומאדים להתנפח כסימן של דלקת. מדוד את עובי של כל אוזן עם מיקרומטר קפיץ (עבור מודל לדוגמא PK-0505 מ Mitutoyo).
- קח 5-6 מדידות עבור כל אוזן בנקודת זמן כל לחשב את הממוצע.
- נפיחות המקסימלי אמור להתרחש בין 24 ל 72 שעות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
האתגר antigenic יכול גם להתבצע באתרים אחרים, למשל בעור של הגב (2). עם זאת אנו מוצאים כי מאתגר. באמצעות אפרכסת האוזן, כפי שמוצג בסרטון זה, מאפשר מדידה מדויקת ביותר של תגובת DTH.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
אנו מודים לד"ר אלכסנדר Flugel (Martinsried, גרמניה) למתן לנו את ה-GFP שכותרתו קו, T ovalbumin ספציפי תא בשימוש בפרוטוקול זה.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12430-062 | 500ml |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | 1 mM final, in Stimulation medium |
| Penicillin – Streptomycin – L-Glutamine | Cambrex/BioWhittaker | 17-718R | 100 u/ml - 100 μg/ml - 4 mM respectively, final, in Stimulation Medium |
| Non essential amino acids | Sigma-Aldrich | R7131 | NEAA, 1% final, in Stimulation Medium |
| RPMI vitamins | Sigma-Aldrich | R7256 | 1% final, in Stimulation medium |
| beta-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | 2ME, 50 μM final, in Stimulation Medium |
| Syngeneic rat serum | 1% final. See explanation in Protocol. | ||
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5503 | 10 μg/ml final, in Stimulation Medium. |
References
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. , 166-936 (2001).
- Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats. J Vis Exp. (5), (2007).
