Summary
Fördröjd överkänslighet (DTH) är en inflammatorisk reaktion medierad av CCR7-effektor minne T (TEM) lymfocyter. Här visar vi hur du aktiverar antigenspecifika TEM celler inducerar adoptiv DTH i Lewis råttor och övervaka det inflammatoriska svaret.
Abstract
Fördröjd överkänslighet (DTH) är en inflammatorisk reaktion medierad av CCR7-effektor lymfocyter minne T som infiltrerar injektionsstället av ett antigen mot vilket immunförsvaret har primade. Den inflammatoriska reaktionen kännetecknas av rodnad och svullnad på platsen antigena utmaning. Det är en praktisk modell för att bestämma in vivo-effekten av immunosuppressiva medel. Kutan DTH kan induceras antingen genom adoptiv transfer av antigen-specifika T-lymfocyter eller genom aktiv immunisering med ett antigen, och efterföljande intradermalt utmaning med det antigen att framkalla den inflammatoriska reaktionen i ett visst hudområde. DTH svar kan förmås att olika antigener, t.ex. äggalbumin, tuberkulin, stelkramp, eller nyckelhål ostronpest hemocyanin. Sådana reaktioner kan också orsakas mot autoantigen, till exempel för att myelin grundläggande protein (MBP) hos råttor med experimentell autoimmun encefalomyelit inducerad med MBP, en djurmodell för multipel skleros (1). Här kan vi visa hur man framkalla en adoptiv DTH reaktion i Lewis råttor. Vi kommer först att stimulera äggalbumin-specifika T-celler in vitro och injicera dessa aktiverade celler intraperitonealt till naiva råttor. Efter att låta cellerna att jämvikt in vivo för 2 dagar, kommer vi att utmana råttor med äggalbumin i ytterörat av ett öra, medan det andra örat wil får saltlösning. Den inflammatoriska reaktionen kommer att vara synlig 3-72 timmar senare och örat tjocklek kommer att mätas som en indikation på DTH svårighetsgrad.
Protocol
1. Stimulering av äggalbumin-specifika T-lymfocyter
Vilande äggalbumin-specifika T-celler stimuleras med äggalbumin i närvaro av bestrålade Lewis råtta tymocyter (30 Gy) som antigen presenterande celler (APC), i stimulering Medium (Förbered i DMEM + Penna / Strep / L-glut + NEAA + RPMI Vitaminer + 2ME + Rat serum + äggalbumin, vid den slutliga koncentrationer noterades i materialet listan.)
Rat serum beredning
- Vi tar serum från råttorna vi offer som bräss givare.
- Råttor är djupt sövd av halotan inandning och så mycket blod som möjligt teckningar av hjärt perfusion (5-10 ml per råtta) med 10 ml sprutor och 23 G 1 "nålar, varefter råttorna omedelbart halshuggen för att säkerställa döden.
- Blodet får koagulera i 10 min vid 37 ° C följt av 10 min på is.
- Den proppen tas bort och den återstående vätskan spunnits.
- I serum samlas in, steril-filtreras och lagras vid -20 ° C.
Beredning av antigenpresenterande celler
- Ta bräss av en halshuggen råtta med hjälp av sterila instrument och placera den i PBS innehållande penicillin och streptomycin (PBS-PS), på is.
- Ta bräss till en vävnadsodling huva, rengöra den från blodproppar och annat smittsamt vävnad och skär den i små bitar i en cell sil (Fisher # 08-771-2) placeras i en 10 cm petriskål som innehåller 10 ml PBS- PS.
- Varje bit trycks genom cellen silen med baksidan av en steril 1 ml sprutkolven. Samla enda cellsuspension i ett 50 ml provrör på is.
- Skölj cellen silen med 20-40 fler ml PBS-PS. Centrifugera suspensionen på 1250g och suspendera pelleten i PBS-PS, 5 ml / bräss, på is.
- Bestråla denna suspension (30 Gy) i en gamma irradiator och omedelbart tvätta den två gånger med 50 ml PBS-PS.
Obs: Den bästa thymus givarna är unga vuxna råttor, 5-7 veckor gammal. Råttor upp till 10 veckor kan användas, men antalet celler minskar med tiden. Kön är inte viktigt men vissa människor säger att män är bättre bräss givare. Vi använder alltid tikar eftersom alla våra djur är inhysta i samma rum och vi vill inte hanar och honor i samma rum.
Stimulering
- Tvätta T-lymfocyter gång och räkna dem.
- Räkna antigen-presenterande celler.
- Blanda 3 x 10 6 äggalbumin-specifika T-celler med 150 x 10 6 APC i en 10 cm petriskål innehållande 10 ml av stimulering medium.
- Inkubera under 48 timmar vid 37 ° C.
2. Adoptiv transfer av äggalbumin-specifika T-lymfocyter
- Råttorna vi använder som mottagare är kvinnor 70-10 veckor gamla.
- Räkna T-lymfocyter, bör de vara stora och runda. Det antigen-presenterande celler kommer vara död.
- Centrifugera T-lymfocyter och återsuspendera dem på 10 x 10 6 celler / ml i PBS.
- Injicera 1 ml intraperitonealt med 3 ml sprutor och 23 G 1 "nålar.
3. Utmana med antigen i örat
- Två dagar efter adoptiv transfer, injicera 20 ìl av en 1 mg / ml äggalbumin lösning (= relevant antigen) i ena örat och koksaltlösning (eller irrelevanta antigen) i det andra örat. Filtrera inte antigenet lösning som du kan förlora aggregat som förstärker den inflammatoriska reaktionen.
Obs: råttorna ska bedövas för att undvika rörelser. Om du är högerhänt, håller örat mellan vänster tumme och pekfinger, pekfingret är inne i örat och råttan mot dig.
- Injicera lösningen i ytterörat av örat med hjälp av 27G ½ "nålar. Försök att injicera all råttor exakt på samma plats.
4. Mätning av DTH
- Örat börjar bli röda och svullna som ett tecken på inflammation. Mät tjockleken på varje öra med en fjäderbelastad mikrometer (till exempel modell PK-0505 från Mitutoyo).
- Ta 5-6 mätningar för varje öra vid varje tid-punkt och beräkna genomsnittet.
- Den maximala svullnaden skulle uppstå mellan 24 och 72 timmar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den antigen Utmaningen kan också utföras på andra platser, till exempel i huden på ryggen (2). Vi finner dock att utmanande. Med hjälp av ytterörat av örat, som visas i denna video, möjliggör den mest exakta mätningen av DTH-reaktionen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Vi tackar Dr Alexander Flugel (Martinsried, Tyskland) för att förse oss med GFP-märkta, äggalbumin-specifika T-cell linje i detta protokoll.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12430-062 | 500ml |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | 1 mM final, in Stimulation medium |
| Penicillin – Streptomycin – L-Glutamine | Cambrex/BioWhittaker | 17-718R | 100 u/ml - 100 μg/ml - 4 mM respectively, final, in Stimulation Medium |
| Non essential amino acids | Sigma-Aldrich | R7131 | NEAA, 1% final, in Stimulation Medium |
| RPMI vitamins | Sigma-Aldrich | R7256 | 1% final, in Stimulation medium |
| beta-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | 2ME, 50 μM final, in Stimulation Medium |
| Syngeneic rat serum | 1% final. See explanation in Protocol. | ||
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5503 | 10 μg/ml final, in Stimulation Medium. |
References
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. , 166-936 (2001).
- Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats. J Vis Exp. (5), (2007).
