Summary
Verzögerte Überempfindlichkeitsreaktionen (DTH) ist eine entzündliche Reaktion durch CCR7-Effektor-Memory-T (TEM)-Lymphozyten vermittelt. Hier zeigen wir, wie um Antigen-spezifische TEM-Zellen zu aktivieren, bewegen Adoptiveltern DTH in Lewis-Ratten und überwachen die entzündliche Reaktion.
Abstract
Verzögerte Überempfindlichkeitsreaktionen (DTH) ist eine entzündliche Reaktion durch CCR7-Effektor-Memory-T-Lymphozyten, dass der Injektionsstelle eines Antigens, gegen die das Immunsystem grundiert hat infiltrieren vermittelt. Die Entzündungsreaktion wird durch Rötung und Schwellung der Website von antigenen Herausforderung geprägt. Es ist eine bequeme Modell, um die in vivo Wirksamkeit von Immunsuppressiva zu bestimmen. Kutane DTH kann entweder durch adoptiven Transfer von Antigen-spezifischen T-Lymphozyten oder durch aktive Immunisierung mit einem Antigen, und die anschließende intradermal Herausforderung mit dem Antigen auf die entzündliche Reaktion in einem bestimmten Hautareal hervorrufen induziert werden. DTH-Reaktionen können auf verschiedene Antigene hervorgerufen werden, z. B. Ovalbumin, Tuberkulin-, Tetanus-Toxoid, oder Keyhole Limpet Hämocyanin. Solche Reaktionen können auch gegen Autoantigen induziert werden, zum Beispiel um basisches Protein (MBP) in Ratten, die mit experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis induziert mit MBP, einem Tiermodell für Multiple Sklerose (1) Myelin. Hier zeigen wir, wie ein Adoptiv-DTH-Reaktion in Lewis-Ratten zu induzieren. Wir werden zunächst zu stimulieren Ovalbumin-spezifischen T-Zellen in vitro und injizieren diese aktivierten Zellen intraperitoneal naive Ratten. Nachdem die Zellen in vivo für 2 Tage ins Gleichgewicht, werden wir die Ratten mit Ovalbumin in der Ohrmuschel eines Ohres Herausforderung, während das andere Ohr wil erhalten Kochsalzlösung. Die entzündliche Reaktion sichtbar sein wird 3-72 Stunden später und die Dicke der Ohren wird als Indiz für DTH Schwere gemessen werden.
Protocol
1. Die Stimulation der Ovalbumin-spezifischen T-Lymphozyten
Ruhe-Ovalbumin-spezifischen T-Zellen sind mit Ovalbumin in Gegenwart von bestrahlten Lewis Ratten-Thymozyten (30 Gy) als Antigen-präsentierende Zellen (APC), in Stimulation Medium (Prepare in DMEM + Pen / Strep / L-Glut + + NEAA RPMI Vitamine angeregt + + 2ME Rattenserum + Ovalbumin, die Endkonzentrationen bemerkt in der Stückliste.)
Rattenserum Vorbereitung
- Wir nehmen Serum von Ratten wir als Thymus Spender zu opfern.
- Ratten sind tief narkotisiert durch Halothan Einatmen und so viel Blut wie möglich durch kardiale Perfusion (5-10 ml pro Ratte) mit 10 ml Spritzen und 23 G 1 "Nadeln, nach denen die Ratten sofort enthauptet zu Tode sorgen gezogen.
- Das Blut wird zur Gerinnung für 10 min bei 37 ° C erlaubt durch 10 min auf Eis.
- Das Gerinnsel wird entfernt und die restliche Flüssigkeit gesponnen.
- Das Serum wird gesammelt, sterilfiltriert und bei -20 ° C gelagert
Vorbereitung der Antigen-präsentierenden Zellen
- Nehmen Sie die Thymus eines enthaupteten Ratte mit sterilen Instrumenten und legen Sie sie in PBS mit Penicillin und Streptomycin (PBS-PS), auf Eis.
- Nehmen Sie den Thymus zu einer Gewebekultur Kapuze, reinigen Sie es von Blutgerinnseln und anderen kontaminierenden Gewebes und schneiden Sie sie in kleine Stücke schneiden, in eine Zelle Sieb (Fisher # 08-771-2) in einer 10 cm Petrischale mit 10 ml platziert PBS- PS.
- Jedes Stück ist durch die Zelle Sieb mit der Rückseite einer sterilen 1 ml Spritzenkolben gedrückt. Sammeln Sie die einzelnen Zellsuspension in ein 50 ml Röhrchen auf Eis.
- Spülen Sie die Zelle Sieb mit 20-40 mehr ml PBS-PS. Die Suspension bei 1250g und das Pellet in PBS-PS, 5 ml / Thymus, auf Eis.
- Bestrahlen dieser Suspension (30 Gy) in einem Gamma-Strahler und sofort waschen Sie es zweimal mit 50 ml PBS-PS.
Hinweis: Die beste Thymus Spender sind junge erwachsene Ratten, 5-7 Wochen alt. Ratten bis zu 10 Wochen kann verwendet werden, aber die Anzahl der Zellen mit der Zeit abnimmt. Geschlecht ist nicht wichtig, obwohl manche Leute sagen, dass Männer besser Thymus Geber. Wir verwenden immer Frauen, weil alle unsere Tiere im selben Raum untergebracht sind, und wir wollen nicht, dass Männer und Frauen im gleichen Raum.
Stimulation
- Waschen Sie den T-Lymphozyten einmal gezählt.
- Zählen Sie die Antigen-präsentierenden Zellen.
- Mix 3 x 10 6 Ovalbumin-spezifischen T-Zellen werden mit 150 x 10 6 APCs in einer 10 cm Petrischale mit 10 ml der Stimulation Medium.
- 48 Stunden lang bei 37 ° C.
2. Adoptiven Transfer der Ovalbumin-spezifischen T-Lymphozyten
- Die Ratten verwenden wir als Empfänger sind Frauen 7-10 Wochen alt.
- Zählen Sie die T-Lymphozyten, sollten sie groß und rund. Die Antigen-präsentierenden Zellen tot sein.
- Zentrifugieren Sie die T-Lymphozyten und resuspendieren sie bei 10 x 10 6 Zellen / ml in PBS.
- Inject 1 ml intraperitoneal mit 3 ml Spritzen und 23 G 1 "Nadeln.
3. Challenge mit Antigen in das Ohr
- Zwei Tage nach adoptiven Transfer, injizieren 20 pl einer 1 mg / ml Ovalbumin-Lösung (= relevante Antigen) in einem Ohr und Kochsalzlösung (oder irrelevant Antigen) in das andere Ohr. Nicht filtern die Antigen-Lösung, wie Sie Aggregate, die die Entzündungsreaktion verstärken kann verlieren.
Hinweis: Die Ratten sollten betäubt, um Bewegungen zu vermeiden. Wenn Sie Rechtshänder sind, halten das Ohr zwischen dem linken Daumen und Zeigefinger, mit dem Zeigefinger wird im Inneren des Ohres und der Ratte zu Ihnen zeigt.
- Injizieren Sie die Lösung in der Ohrmuschel mit 27G ½ "Nadeln. Versuchen Sie, alle Ratten genau injizieren an der gleichen Stelle.
4. Messung von DTH
- Das Ohr beginnt sich rot und schwillt als ein Zeichen der Entzündung. Messen Sie die Dicke jedes Ohr mit einem federbelasteten Mikrometer (zum Beispiel Modell PK-0505 von Mitutoyo).
- Nehmen Sie 5-6 Messungen für jedes Ohr zu jeder Zeit-Punkt und berechnen Sie den Mittelwert.
- Die maximale Schwellung sollte zwischen 24 und 72 Stunden auftreten.
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Discussion
Die antigene Herausforderung kann auch an anderen Standorten durchgeführt werden, zum Beispiel in der Haut des Rückens (2). Wir finden jedoch, dass eine Herausforderung. Mit der Ohrmuschel, wie in diesem Video gezeigt, ermöglicht die präzise Messung der DTH-Reaktion.
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Acknowledgments
Wir danken Dr. Alexander Flügel (Martinsried, Deutschland) für die Bereitstellung der GFP-markierten, Ovalbumin-spezifischen T-Zell-Linie in diesem Protokoll verwendet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | GIBCO, by Life Technologies | 12430-062 | 500ml |
| Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | S8636 | 1 mM final, in Stimulation medium |
| Penicillin – Streptomycin – L-Glutamine | Cambrex/BioWhittaker | 17-718R | 100 u/ml - 100 μg/ml - 4 mM respectively, final, in Stimulation Medium |
| Non essential amino acids | Sigma-Aldrich | R7131 | NEAA, 1% final, in Stimulation Medium |
| RPMI vitamins | Sigma-Aldrich | R7256 | 1% final, in Stimulation medium |
| beta-mercapt–thanol | Sigma-Aldrich | M6250 | 2ME, 50 μM final, in Stimulation Medium |
| Syngeneic rat serum | 1% final. See explanation in Protocol. | ||
| Ovalbumin | Sigma-Aldrich | A5503 | 10 μg/ml final, in Stimulation Medium. |
References
- Beeton, C., Barbaria, J., Devaux, J., Benoliel, A. -M., Gola, M., Sabatier, J. -M., Bernard, D., Crest, M., Beraud, E. Selective blocking of voltage-gated K+ channels treats experimental autoimmune encephalomyelitis and inhibits T-cell activation. J. Immunol. , 166-936 (2001).
- Beeton, C., Chandy, K. G. Induction and monitoring of active delayed type hypersensitivity (DTH)in rats. J Vis Exp. (5), (2007).
