Summary
ووصف الإجراء بسيطة مخصصة لأداء التجارب ميكروأري microRNA. وتشمل الخطوات عزل الحمض النووي الريبي ، والحمض النووي الريبي العلامات المرجعية ، التهجين العينات الى ميكروأرس ، ميكروأرس مسح وقياس الاشارات التهجين.
Abstract
microRNAs (miRNAs) هي عائلة كبيرة من النيوكليوتيدات 22 ~ (الإقليم الشمالي) لفترة طويلة جزيئات الحمض النووي الريبي التي يتم التعبير عنها على نطاق واسع في حقيقيات النوى 1. الجينوم المعقدة ترميز ما لا يقل عن مئات miRNAs ، التي تمنع في المقام الأول على التعبير عن عدد كبير من الجينات المستهدفة بعد transcriptionally 2 ، 3. miRNAs تحكم طائفة واسعة من العمليات البيولوجية 1. بالإضافة إلى ذلك ، ارتبط تغيير التعبير ميرنا مع الأمراض التي تصيب الإنسان مثل أمراض السرطان وmiRNAs قد تكون بمثابة المؤشرات الحيوية للأمراض والتشخيص 4 ، 5. من المهم ، لذلك ، لفهم التعبير وظائف miRNAs في ظل ظروف عديدة ومختلفة.
وقد استخدمت ثلاثة أساليب رئيسية للتعبير ميرنا ل : في الوقت الحقيقي PCR ، ميكروأري ، وتسلسل عميق. تقنية ميكروأري ميرنا وتتميز بأنها عالية الإنتاجية ، وعموما أقل تكلفة ، والأكثر من الخطوات التجريبية والتحليل يمكن كارالعبوات الناسفة في مختبر البيولوجيا الجزيئية في معظم الجامعات والمدارس والمستشفيات الطبية المرتبطة بها. هنا ، نحن تصف طريقة مخصصة لأداء التجارب ميكروأري ميرنا. ستتم طباعة مجموعة التحقيق ميرنا على الشرائح الزجاجية لإنتاج ميكروأرس ميرنا. يتم عزل الحمض النووي الريبي باستخدام أسلوب أو كاشف يحافظ على الأنواع الصغيرة RNA ، وصفت بعد ذلك مع صبغة مضان. كعنصر تحكم ، وصفت أيضا الحمض النووي [أليغنوكليوتيد] إشارة المقابلة إلى مجموعة فرعية من miRNAs مع صبغة مضان مختلفة. والحمض النووي المرجعية خدمة للتدليل على نوعية الشريحة والتهجين وستستخدم أيضا للتطبيع البيانات. تختلط RNA والحمض النووي والمهجنة إلى شريحة تحتوي على ميكروأري تحقيقات لمعظم miRNAs في قاعدة البيانات. بعد الغسيل ، ويتم تفحص الشريحة للحصول على الصور ، وكميا كثافة من البقع الفردية. وسيتم تجهيز هذه الإشارات الخام وتحليلها وكذلك البيانات تعبيرا عن miRNAs المقابلة. Microaيمكن جرد الشرائح rray ومجدد للحد من تكلفة ميكروأرس وتعزيز اتساق التجارب ميكروأري. نفس المبادئ وإجراءات قابلة للتطبيق على أنواع أخرى من التجارب ميكروأري مخصص.
Protocol
1. طباعة ميكروأرس ميرنا مخصص
- طباعة ميكروأري الشرائح باستخدام مرفق الخدمات الأساسية ميكروأري في جامعة أو شركة. جودة تصنيع ميكروأري هي واحدة من أهم العوامل الحاسمة لنجاح تجربة ميكروأري. حاول عدد قليل من الخدمات إذا كان ذلك ممكنا. من الناحية المثالية ، فإن المرء 5-10 طباعة الشرائح في وقت واحد ، وجميع الشرائح وسوف تبدو متطابقة مع البقع ، مفصولة تماما الفردية.
- للحصول على دعم ميكروأري ، ونحن استخدام الثغرات الشرائح المغلفة الثاني.
- تحقيقات عن ميرنا ، ونحن نستخدم NCODE متعددة الأنواع ميرنا ميكروأري دقق تعيين V2.
- حل جميع [أليغنوكليوتيد] في محكمة أمن الدولة في 10 × 3 ميكرومتر وطباعة quadruply لهم على الشرائح. إصلاح الشرائح بواسطة الأشعة فوق البنفسجية وفقا لتعليمات للشرائح الثاني GAAPS. تسمية الشريحة مع قلم الماس للاحتفال المنطقة وجنب مع التحقيقات المطبوعة. تخزين حتى 22 درجة مئوية.
2. إعداد نموذج
- أي وسيلةأو يمكن استخدامها لعزل الحمض النووي الريبي كاشف ، طالما أنه يحفظ الرناوات الصغيرة. ونحن عموما استخدام Trizol (Invitrogen) لاستخراج الحمض النووي الريبي مجموع ، مع كمية ونوعية مرضية الاستعدادات RNA ، كما يقاس بواسطة A 260nm 280nm وألف قراءات.
- الحمض النووي الريبي لوضع العلامات ، ومزيج ~ 25 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع مع 0.5 ميكروغرام من 5' - PCU - DY547 - 3 6 '× 1 في المخزن (HEPES 50 مم ، ودرجة الحموضة 7.8 و 20 ملي MgCl 2 و 10 ميكروغرام / مل BSA ، و 10 ٪ DMSO) التي تحتوي على 20 وحدة ~ T4 RNA يغاز 1 ، على أن تستكمل مع ~ DTT 10 مم و ~ 0،02-0،03 الحجم النهائي لل10 × العازلة RNA T4 1 يغاز لاعبي التنس المحترفين.
- يسمح وضع العلامات على المضي قدما على الجليد داخل الثلاجة لمدة 2-24 ساعات. يعجل RNA مع 0.3 M خلات الصوديوم و 3 مجلدات من الايثانول. لربط كفاءة وهطول الأمطار ، ويحل الجيش الملكي النيبالي على مجموع أكثر من 2 ملغم / لتر ، والحفاظ على وحدة التخزين في ربط مجموع ميكرولتر 20 ~.
- إذا كانت أقل RNA هو متاح ، وكمية من الحمض النووي الريبي المدخلات و5' - PCU - DY547 - 3 "يمكن أن تخفض </ لى>
- إذا كان الحمض النووي الريبي هو مخفف للغاية ، إضافة الناقل مثل الحمض الريبي النووي النقال الخميرة للمساعدة في هطول الأمطار.
- والجمع بين التسمية في 1 ميكروغرام من مجموع الحمض النووي [أليغنوكليوتيد] إشارة المقابلة إلى مجموعة فرعية من miRNAs الثدييات باستخدام Ulysis اليكسا فلور 647 وصفها كيت 6 الأحماض النووية باعتبارها مراقبة لعملية التهجين. تنقية الحمض النووي المسمى باستخدام عمود CentriSep وحفظها في الظلام على -20 درجة مئوية.
3. ميكروأري التهجين
- لاستخدام الشرائح للمرة الأولى ، قبل هجن الشرائح في حل المصفاة SSC × 3 ، 0.1 ٪ SDS ، 0.2 ٪ لجيش صرب البوسنة 30-60 دقيقة عند 37 درجة مئوية. يغرق في الماء عدة مرات ، ثم في الأيزوبروبانول. تجفيف الشرائح باستخدام جهاز للطرد المركزي مع محول الشريحة في 100 غرام لمدة 5 دقائق الى 22 درجة مئوية.
ملاحظة : نحن نستخدم غرف كورنينج التهجين ميكروأري وmSeries إيري العلمية من Lifterslips لأداء ميكروأري التهجين.
- شطف لىfterslips في الماء ، ثم في الإيثانول ، وذلك قبل التجفيف في الهواء. مكان شريحة داخل غرفة ميكروأري قاعدة التهجين ، وlifterslip على أعلى الشريحة. سيتم تغطية المنطقة lifterslip التحقيق مع شرائط بيضاء لها بالاتصال الشريحة.
- في الظلام ، وتدور باستمرار على عجل ، المسمى الحمض النووي الريبي. يغسل مرة واحدة مع الايثانول 70 ٪ ، والهواء الجاف وبيليه. ينبغي أن يكون بيليه المحمر.
- يعد حل التهجين التي تحتوي على 400 ملم نا 2 هبو 4 درجة الحموضة 7.0 ، 0.8 ٪ BSA ، و 5 ٪ SDS ، formamide 12 ٪ 6 مع 1/15-1/100 ميكرولتر من المنقى ، وصفت المرجعية الحمض النووي (2.4) لكل عينة الحمض النووي الريبي. كمية من الحمض النووي وأضاف المرجع يتوقف على مدى العديد من المسمى [أليغنوكليوتيد] مختلفة (2.4). إذا كان هناك أكثر من 100 ، ثم هناك حاجة أقل التخفيف.
- حل جيد مع بيليه RNA ميكرولتر 60 ~ من الحل التهجين.
- إضافة 20 ميكروليتر من الماء إلى كل من الآبار الرطوبة في قاعدة ميكروأري كورنينج غرفة التهجين.
- إضافة رانه مزيج من الحمض النووي الريبي DNA ، وصفت الإشارة إلى الشريحة. استخدام طرف الماصة رقيقة ، وتلمس برفق على حافة lifterslip ، والسماح للحل لدخول الفضاء بين lifterslip والشريحة من خلال الشفط.
- مكان الغرفة التهجين تغطي أكثر من قاعدة ، ثم ختم الغرفة مع مقاطع معدنية.
- وضع غرفة كاملة داخل كيس من البلاستيك الذي يأتي مع الكاسيت الغرفة من كورنينج.
- وضع كاسيت الغرفة (ق) داخل وعاء مع منشفة ورقية مرطبة ؛ تغطية الحاويات مع غلاف بلاستيكي ووضعه داخل 37 درجة مئوية الرطبة ، خلية ثقافة حاضنة لمدة 24 ساعة ~. هذه الاحتياطات (3.6 ، 3.9 ، 3.10) ضمان أن الحل التهجين لا تجف أثناء الحضانة.
4. بعد تجهيز التهجين
- تفكيك الأشرطة غرفة واحدة تلو الأخرى. يغرق شريحة وlifterslip في محكمة أمن الدولة في 22 × 2 درجة مئوية. سوف lifterslip سقوط بطبيعة الحال خارج الشريحة. وضعه في SSC × 0.8. غسلالشرائح في SSC × 0.8 مرتين ، ثم ثلاث مرات في محكمة أمن الدولة س 0.4 و 1-2 دقيقة في المجموع. تجفيف الشرائح باستخدام جهاز للطرد المركزي مع محول الشريحة. يغسل بالماء وlifterslips إنقاذ لإعادة استخدامها في وقت لاحق.
- مسح الشرائح مع أي جهاز ماسح ضوئي مناسبة ، على سبيل المثال ، إلمر بيركن ScanArray 5000 أو الجزيئي أجهزة الماسح الضوئي أكسون GenePix ميكروأري 4000B. تفحص في موجات قريبة إلى 547 نانومتر ونانومتر 647 للحصول على ملفات الصور ذات الصلة.
- استخدام برامج مثل BlueFuse لقياس كثافة بكسل في المدخلات ، وملفات الصور من 4.2). تفقد المواقع الفردية مع برنامج لاستبعاد بقع غير طبيعية على ميكروأرس لمزيد من الدراسة. هذه البقع عادة ما تكون غير طبيعية تنشأ من سوء الطباعة الشريحة أو الشرائح المناولة بعد التهجين.
- استخدام برامج مثل GeneSpring و Excel لتحليل البيانات وعرضها. الاعتبارات العامة لتطبيع البيانات ميكروأري تطبيق ، وهي خارج نطاق هذه الورقة.
- مرة واحدة ويتم الحصول على إشارات مرضية AFثالثا 4.3) ، الشريط الشرائح ميكروأري لإعادة استخدامها 7. شطف الشرائح في الماء ، ثم تزج في مرحلة ما قبل حرارة ، هيدروكسيد الصوديوم 1 مم و 0.1 x في محكمة أمن الدولة طبق تلطيخ عند 62 درجة مئوية لمدة 10-20 دقيقة. كرر الحضانة مرة واحدة. غسل جيم الشرائح عدة مرات في الماء لمدة تصل إلى 60 دقيقة مع اهتزاز لطيف في 22 درجة تجفيف الشرائح باستخدام جهاز للطرد المركزي ، وتخزين حتى 22 درجة مئوية.
- لاستخدام الشرائح مجدد ، فإنه ليس من الضروري قبل هجن إليها مرة أخرى. ببساطة تغسل في ماء تليها الأيزوبروبانول ، والجافة الشرائح الحق قبل التهجين.
5. ممثل النتائج :
لدينا إلى حد كبير مع الإجراءات المذكورة إلى المكانة العالمية في التعبير ميرنا الآلاف من العينات ، أي الرنا المعزولة من الزرد لعينة الإنسان في ظل ظروف عديدة ومختلفة. يوضح الشكل 1 صورة ممسوحة ضوئيا لميكروأري لإظهار إشارات التهجين دقيقة جدا وقوية على الشريحة. وبيرسون correlatiعلى معاملات بين التقنية يعيد التهجين ميكروأري ~ هي 0.99 7 ، مشيرا إلى استنساخ ممتازة.
الشكل 1 صورة مركب شريحة ميرنا ميكروأري فحصها بعد التهجين. أدى ظهور بقع حمراء من التهجين بواسطة الحمض النووي المرجعية ، البقع الخضراء من عينة الحمض النووي الريبي DY547 المسمى ، في حين أن البقع الصفراء التي كانت من التهجين الحمض النووي الريبي على حد سواء وعلى نفس التحقيقات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
فعلى الرغم من التطورات الأخيرة في تقنيات التسلسل عميق ، ميكروأري يظل خيارا صالحا لتحليل إنتاجية عالية من الحمض النووي والحمض النووي الريبي. مقارنة تسلسل عميق ، والتجارب ميكروأري أرخص ، ومختبر البيولوجيا الجزيئية نموذجية يمكن تنفيذ معظم التجارب وتحليل البيانات في المنزل ، والتي تتيح المرونة وتوفير الوقت. في المستقبل ، ومن المرجح ميكروأرس مناسبة تماما لاستجواب مكثف مجموعات من الجينات ، على سبيل المثال ، يمكن استخدام جميع أو مجموعة فرعية من عوامل النسخ في الجينوم أو miRNAs ، ونفس المبادئ والإجراءات المعروضة هنا في التجارب المخصصة لدراسة ميكروأري إلى جانب عائلات الجينات miRNAs. بطبيعة الحال ، يشكل عائقا رئيسيا حول ميكروأرس هو تسلسل تلك المعلومات يجب أن تكون متوفرة مسبقا. هذه ليست مشكلة بالنسبة لمعظم الأسر جين البروتين في الكائنات النموذج ، على الرغم من أن عدد الجينات ميرنا هناك لا تزال غير واضحة. وقد تم تصميم مجموعة المسبار كنا به استنادا miRBase 8 9 ، 10 ، فمن الواضح أن تتم تغطية بالفعل miRNAs الأكثر وفرة والأكثر أهمية بيولوجيا الثدييات بواسطة هذه المجموعة التحقيق.
لا توجد تحديات التقنية الرئيسية لإجراء تجارب [ميكروأري مخصص. بناء على خبرتنا ، ومفاتيح لنجاح تجربة ميكروأري هي : 1) للحصول على طباعة الشرائح جيدا ، 2) لإعداد RNA من نوعية جيدة وبكميات كافية ، و 3) صحيح أن تغسل الشرائح بعد التهجين. Trizol كاشف غلة عادة كميات كافية من الحمض النووي الريبي سليمة للدراسات اللاحقة. ومع ذلك ، والتعبير ميرنا يختلف بين الأنسجة المختلفة وخطوط الخلية. في معظم الظروف ، يجب 20-25 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع تعطي إشارات قوية بما فيه الكفاية عندما ميكروأري المسمى من خلال طريقة الربط. مطلوب لعينات الحمض النووي الريبي أقل ميرنا الغنية مثل مناطق الدماغ والخلايا العصبية. إلا إذا 1-5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي مجموع أو أقل متوفرا ، طريقة وضع العلامات الأخرىيمكن أن تستخدم ثانية ، على سبيل المثال ، وضع العلامات من الحمض النووي الريبي مجموعات Invitrogen ، وأنها متوافقة مع منصة مخصصة ميكروأري الموصوفة هنا. للحصول على أفضل المقارنات ، ينبغي تسمية واحدة دائما واحدة على الأقل نسخ من السيطرة على جميع ونماذج تجريبية في وقت واحد وهجن لهم نفس الدفعة طباعة الشرائح في تجربة واحدة. وهذا التصميم البحوث التقليل من إشارات إلى مساهمة ميكروأري التفاضلية الناتجة عن التغيرات في وضع العلامات وتجهيز العينة ونوعية الشريحة. الحمض النووي المرجعية (باللون الأحمر قناة) بمثابة السيطرة على نوعية الشريحة ، التهجين ، والغسيل. وسوف تعطي اشارات ناجحة التهجين نظيفة وقوية في الحمراء. إذا إشارات الحمض النووي الريبي اشارات جيدة ولكن لم تكن كذلك ، ثم ينبغي للمرء أن تبادل لاطلاق النار من المتاعب الخطوات RNA من العزلة ووضع العلامات. على سبيل المثال ، هل لديهم نسبة الحمض النووي الريبي و260nm / 280nm ألف بين 1.9 و 2.1؟ هو المحمر بيليه في 3.3؟
معظم الاستثماراتقد يكون لميكروأرس للطباعة والمسح الضوئي الشريحة. تم تجهيز غالبا طابعة وماسح ضوئي ميكروأري من قبل مرفق الأساسية في العديد من الجامعات وكليات الطب. سوف ميكروأرس الطباعة في معظم الشرائح وإعادة استخدام وlifterslips خفض كبير في التكاليف. إعادة استخدام الشرائح لديه ميزة إضافية لتحسين الاتساق من التجارب ميكروأري 7. لقد كنا استخدامها الشرائح أكثر من ست مرات ، وعثرت على جودة البيانات لا تزال مرضية. لضمان أفضل الحساسية لعينات أثمن أو العينات مع إدخال الحد الأدنى من الرنا ، ومع ذلك ، فإنه لا يزال من الحكمة استخدام الشرائح الطازجة 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
وأيد العمل في جزء من المعهد الوطني لتعاطي المخدرات مركز (P50 DA 011806) وجيش الولايات المتحدة وزارة الدفاع (W81XWH - 07 - 1 - 0183).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2 | Invitrogen | MIRMPS201 | Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest. |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis. |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit | Invitrogen | U21660 | This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well. |
| 5’-pCU-DY547-3’ | Dharmacon | Custom made | Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation. |
| CentriSep columns | Princeton Separations | CS-901 | |
| GAPSII coated slide | Corning | 40004 | Other types of slides may be also used. |
| Microarray hybridization chambers | Corning | 2551 or 40080 | Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours. |
| Lifterslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 25X60I-M5439-001-LS | |
| BlueFuse | BlueGenome | ||
| GeneSpring | Agilent Technologies |
References
- Ambros, V.
- Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs. Genome Res. 19, 92-105 (2009).
- Chekulaeva, M., Filipowicz, W. Mechanisms of miRNA-mediated post-transcriptional regulation in animal cells. Curr. Opin. Cell Biol. 21, 452-460 (2009).
- Farazi, T. A., Spitzer, J. I., Morozov, P., Tuschl, T.
- Small, E. M., Olson, E. N. Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology. Nature. 469, 336-342 (2011).
- Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression. Nat. Methods. 1, 47-53 (2004).
- Zhang, X., Xu, W., Tan, J., Zeng, Y. Stripping custom microRNA microarrays and the lessons learned about probe:slide interactions. Anal. Biochem. 386, 222-227 (2009).
- Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. miRBase: tools for microRNA genomics. Nucl. Acids. Res. 36, D154-D158 (2008).
- Landgraf, P. A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing. Cell. 129, 1401-1414 (2007).
- Chiang, H. R. Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes. Genes. Dev. 24, 992-1009 (2010).
