Summary
Une procédure simple d'effectuer des expériences de micropuces personnalisées microARN est décrite. Les étapes comprennent isoler l'ARN, l'étiquetage ARN et l'ADN de référence, l'hybridation des échantillons à puces, la numérisation des microarrays, quantifier et analyser les signaux d'hybridation.
Abstract
microARN (miARN) sont une grande famille de ~ 22 nucléotides (nt) de longues molécules d'ARN qui sont largement exprimés dans les eucaryotes 1. Génomes complexes codent pour au moins plusieurs centaines de miARN, qui sont principalement inhiber l'expression d'un grand nombre de gènes cibles de post-transcriptionnel 2, 3. miARN contrôler un large éventail de processus biologiques 1. En outre, l'expression du miARN modifié a été associée à des maladies humaines telles que les cancers, et miARN peuvent servir de biomarqueurs pour les maladies et le pronostic 4, 5. Il est donc important de comprendre l'expression et les fonctions des miARN dans diverses conditions.
Trois grandes approches ont été employées pour l'expression du miARN profil: PCR en temps réel, puces à ADN et le séquençage en profondeur. La technique des biopuces miARN a l'avantage d'être à haut débit, généralement moins coûteux, et la plupart des étapes expérimentales et l'analyse peuvent être CarrIED dans un laboratoire de biologie moléculaire à la plupart des universités, écoles de médecine et des hôpitaux associés. Ici, nous décrivons une méthode pour effectuer des expériences de micropuces personnalisées miARN. Un ensemble de sondes miARN seront imprimés sur des lames de verre pour produire des puces miARN. L'ARN est isolé en utilisant une méthode ou d'un réactif qui préserve les espèces de petits ARN, puis marquées avec un colorant fluorescent. Comme contrôle, oligonucléotides d'ADN de référence correspondant à un sous-ensemble des miARN sont également marqués par un colorant différent de fluorescence. L'ADN de référence servira à démontrer la qualité de la lame et l'hybridation et sera également utilisé pour la normalisation des données. L'ARN et l'ADN sont mélangés et hybridés sur une lame de biopuces contenant des sondes pour la plupart des miARN dans la base de données. Après le lavage, la lame est scanné afin d'obtenir des images et des intensités des spots individuels quantifiés. Ces signaux bruts seront encore traitées et analysées que les données d'expression de l'miARN correspondants. MicroAdiapositives rray peut être dépouillé et régénérée pour réduire le coût des puces à ADN et à renforcer la cohérence des expériences sur biopuces. Les mêmes principes et les procédures sont applicables à d'autres types d'expériences de micropuces personnalisées.
Protocol
1. Impression de puces personnalisées miARN
- Imprimer la puce diapositives en utilisant les services biopuces installation de base à une université ou une entreprise. La qualité de fabrication de puces à ADN est l'un des facteurs les plus critiques pour le succès d'une expérience microarray. Essayez un peu de services si possible. Idéalement, il faudrait imprimer de 50 à 100 lames à la fois, et toutes les diapositives sera identique, avec bien séparés, les taches individuelles.
- Pour le support de microréseau, nous utilisons des lames GAPS II couché.
- Pour les sondes miARN, nous utilisons le nCode multi-espèces miARN Microarray Probe Set V2.
- Dissoudre tous les oligonucléotides dans 3 x SSC à 10 uM et quadruply les imprimer sur les diapositives. Fixer les lames par irradiation aux ultraviolets conformément aux instructions pour les diapositives II GAAP. Étiquette de la diapositive avec un stylo de diamants pour marquer la zone et le côté avec les sondes imprimé. Magasin à 22 ° C.
2. La préparation des échantillons
- Toute méthodeou réactif peut être utilisé pour isoler l'ARN, tant qu'elle préserve les petits ARN. Nous utilisons généralement Trizol (Invitrogen) pour extraire l'ARN total, avec la quantité satisfaisante et la qualité des préparations d'ARN, tel que mesuré par A et A 260 nm lectures 280nm.
- Pour l'ARN étiquetage, mélanger ~ 25 ug d'ARN total avec 0,5 ug de 5'-PCU-DY547-3 '6 en 1 x tampon (50 mM HEPES, pH 7,8, 20 mM MgCl2, 10 ug / ml de BSA, 10% DMSO) contenant environ 20 unités de T4 ARN ligase 1, complétée par la TNT ~ ~ 10 mM et 0,02 à 0,03 volume final de la 10 x T4 ARN ligase 1 tampon pour l'ATP.
- Autoriser l'étiquetage de procéder sur glace à l'intérieur d'un réfrigérateur pour les 2-24 heures. Précipiter l'ARN, avec 0,3 M d'acétate de sodium et 3 volumes d'éthanol. Pour la ligature efficace et précipitations, dissoudre l'ARN total à plus de 2 mg / ml, et maintenir le volume total de la ligature à ~ 20 pl.
- Si moins d'ARN est disponible, le montant de l'apport de l'ARN et le 5'-PCU-DY547-3 'peuvent être revus à la baisse. </ Li>
- Si l'ARN est très dilué, ajouter transporteur comme ARNt de levure pour l'aide dans les précipitations.
- Combinez et étiquettes au total 1 ug d'oligonucléotides d'ADN de référence correspondant à un sous-ensemble des miARN de mammifères en utilisant les Ulysis Alexa Fluor 647 Kit Nucleic Acid Étiquetage 6 comme un contrôle pour le processus d'hybridation. Purifier l'ADN marqué à l'aide d'une colonne Centrisep et sauvegarder dans l'obscurité à -20 ° C.
3. L'hybridation microarray
- Pour utiliser les diapositives pour la première fois, la pré-hybridation des lames dans une solution filtrée de 3 x SSC, SDS 0,1%, 0,2% de BSA pendant 30-60 min à 37 ° C. Les submerger dans l'eau à quelques reprises, puis à l'isopropanol. Sécher les lames à l'aide d'une centrifugeuse avec un adaptateur diapositives à 100 g pendant 5 min à 22 ° C.
Note: Nous utilisons des chambres Corning hybridation microarray et mSeries Érié scientifique de Lifterslips pour effectuer l'hybridation de biopuces.
- Rincez le lifterslips dans l'eau, puis dans de l'éthanol, avant le séchage à l'air. Placez une diapositive dans une base de microréseaux chambre d'hybridation, et un lifterslip sur le dessus de la glissière. Le lifterslip couvrira la zone de la sonde, avec ses bandes blanches contactant la diapositive.
- Dans l'obscurité, le ralentissement de la précipitation, l'ARN étiquetés. Lavez une fois avec 70% d'éthanol, et l'air sec du culot. Le culot doit être rougeâtre.
- Préparer une solution d'hybridation contenant 400 mM de Na 2 HPO 4 pH 7,0, 0,8% de BSA, 5% de SDS, le formamide 12% 6 avec 1/15-1/100 pl de la purifier, étiquetées ADN de référence (2,4) par échantillon d'ARN. La quantité d'ADN de référence ajoutée dépend du nombre de différents oligonucléotides sont étiquetés (2,4). S'il ya plus de 100, alors moins de dilution est nécessaire.
- Dissoudre le culot d'ARN bien avec ~ 60 pl de la solution d'hybridation.
- Ajouter 20 ul d'eau pour chacun des puits d'humidification dans la base de microréseaux chambre d'hybridation Corning.
- Ajouter tIl mélange de l'ARN et l'ADN de référence étiqueté à la diapositive. Utiliser une pipette fine, toucher doucement le bord de la lifterslip, et permettre à la solution d'entrer dans l'espace entre les lifterslip et glisser à travers aspiration.
- Placer la chambre d'hybridation couvrent plus de la base, puis sceller la chambre avec des pinces métalliques.
- Mettez toute la chambre à l'intérieur du sac en plastique qui vient avec la cassette de chambre de Corning.
- Placer la cassette de chambre (s) à l'intérieur d'un conteneur avec une serviette de papier mouillé; couvrez le récipient avec une pellicule plastique et placez-le dans un 37 ° C et humide, de culture cellulaire incubateur pour ~ 24 heures. Ces précautions (3,6, 3,9, 3,10) s'assurer que la solution d'hybridation ne se dessèche pas pendant l'incubation.
4. Post-traitement de l'hybridation
- Démonter les cassettes de chambre, un par un. Plonger une lame et son lifterslip en 2 x SSC à 22 ° C. Le lifterslip va naturellement tomber la lame. Placez-le dans 0,8 x SSC. Laverles diapositives de 0,8 x SSC deux fois, puis trois fois en 0,4 x SSC, 1-2 min au total. Sécher les lames à l'aide d'une centrifugeuse avec un adaptateur de diapositives. Laver les lifterslips avec de l'eau et à économiser pour les réutiliser plus tard.
- Numérisez les diapositives avec n'importe quel scanner approprié, par exemple, l'Perkin Elmer ScanArray 5000 ou Molecular Devices Axon GenePix 4000B biopuces scanner. Balayage des longueurs d'onde proche de 547 nm et 647 nm pour obtenir les fichiers d'image correspondante.
- Utiliser des programmes tels que BlueFuse de quantifier les intensités des pixels dans l'entrée, les fichiers image de 4,2). Inspectez taches individuelles avec le programme d'exclure des taches anormales sur les microarrays d'un examen plus approfondi. Ces taches anormales résultent habituellement d'imprimerie glisser mauvaise manipulation ou une diapositive après hybridation.
- Utiliser des programmes tels que GeneSpring et Excel pour l'analyse des données et la présentation. Considérations générales pour la normalisation des données biopuces s'appliquent, ce qui est au-delà de la portée du présent document.
- Une fois les signaux satisfaisants sont obtenus after 4,3), la bande des lames microarray pour réutilisation 7. Rincer les lames dans de l'eau, puis plonger dans préchauffé, NaOH 1 mm et 0,1 x SSC dans un plat à coloration à 62 ° C pendant 10-20 minutes. Répétez l'incubation fois. Lavez le C. diapositives à quelques reprises dans l'eau pendant 60 minutes avec agitation douce à 22 ° Sécher les lames à l'aide d'une centrifugeuse, et conserver à 22 ° C.
- Pour utiliser les diapositives régénéré, il n'est pas nécessaire de les pré-s'hybrider à nouveau. Il suffit de les laver à l'eau suivie de l'isopropanol, et sécher les diapositives à droite avant l'hybridation.
5. Les résultats représentatifs:
Nous avons largement suivi les procédures décrites au profil de l'expression du miARN mondial dans des milliers d'échantillons, c'est-à ARN isolé de poisson zèbre au spécimen humain dans diverses conditions. La figure 1 montre une image numérisée d'une biopuce à démontrer signaux d'hybridation très précis et très forte sur le diapositive. Le correlati Pearsonsur les coefficients techniques entre les répliques de l'hybridation microarray sont ~ 0.99 7, indiquant une excellente reproductibilité.
Figure 1 Image composite d'une lame de biopuces miARN numérisée après l'hybridation. Taches rouges résulté de hybridations par l'ADN de référence, des taches vertes de l'échantillon DY547-ARN marqué, tandis que les taches jaunes étaient d'hybridations à la fois par l'ADN et d'ARN pour les mêmes sondes.
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Discussion
Malgré les progrès récents dans les technologies de séquençage profond, biopuces reste un choix viable pour analyse à haut débit de l'ADN et l'ARN. Comparé à un séquençage en profondeur, les expériences biopuces sont moins chers, et un laboratoire de biologie moléculaire typique peut exécuter la plupart des expériences et l'analyse des données en interne, ce qui permet une flexibilité et un gain de temps. Dans l'avenir, les puces sont susceptibles bien adapté à interroger de manière intensive des ensembles de gènes, par exemple, tout ou une partie des facteurs de transcription dans un génome ou miARN, et les mêmes principes et procédures présentées ici peuvent être utilisés dans des expériences biopuces sur mesure à l'étude familles de gènes en plus miARN. Bien sûr, un inconvénient majeur à propos des puces est que l'information de séquence doit être disponible a priori. Ce n'est pas un problème pour la plupart des familles de gènes de protéines dans des organismes modèles, bien que le nombre de gènes de miRNA il ya demeurent obscures. L'ensemble de sondes que nous utilisons a été conçu sur la base miRBase 8 9, 10, il est évident que les miRNAs plus abondants et les plus pertinentes biologiquement mammifères sont déjà couverts par cet ensemble de sonde.
Il n'y a pas grands défis techniques pour réaliser des expériences biopuces personnalisées. Basé sur notre expérience, les clés de la réussite d'une expérience microarray sont: 1) pour obtenir le bien-imprimées diapositives, 2) de préparer l'ARN de bonne qualité et en quantité suffisante, et 3) pour bien laver les lames après hybridation. Réactif Trizol rendements généralement des quantités suffisantes d'ARN intact pour des études ultérieures. Néanmoins, l'expression du miARN varie selon les différents tissus et des lignées cellulaires. Dans la plupart des conditions, 20-25 ug d'ARN total devrait donner des signaux suffisamment forts quand biopuces marqués par la méthode de ligation. Moins ARN est nécessaire pour les échantillons de miARN-riches telles que les régions du cerveau et les neurones. Si seulement 1-5 ug d'ARN total ou moins est disponible, la méthode d'étiquetage d'autress peuvent être utilisés, par exemple, l'ARN des kits d'étiquetage chez Invitrogen, et ils sont compatibles avec la plateforme microarray personnalisée décrite ici. Pour la meilleure des comparaisons, on devrait toujours l'étiquette d'au moins une répétition de tous les échantillons de contrôle et d'expérimentation et de les hybrider simultanément au lot même impression de diapositives en une seule expérience. Cette conception de la recherche permettra de minimiser la contribution aux signaux différentiels biopuces découlant des variations dans l'étiquetage de l'échantillon et de transformation et de la qualité de diapositives. L'ADN de référence (en rouge) sert de contrôle pour la qualité de diapositives, l'hybridation et le lavage. Une hybridation réussie donnera un signal propre et solide en rouge. Si les signaux sont bons, mais l'ADN ARN signaux ne sont pas, alors on devrait dépanner les étapes d'isolement d'ARN et d'étiquetage. Par exemple, ne l'ARN ont le rapport A 260nm / A 280nm entre 1,9 et 2,1? Est-ce que rougeâtres culot dans 3,3?
La plupart des investissementspour les puces peuvent être pour l'impression de glisser et de numérisation. Une imprimante et un scanner biopuces sont souvent équipés par l'établissement au coeur de nombreuses universités et écoles de médecine. Microréseaux d'impression dans les diapositives en vrac et la réutilisation et lifterslips permettra de réduire considérablement le coût. Réutilisation des diapositives a l'avantage supplémentaire d'améliorer la cohérence des expériences de micropuces 7. Nous avons réutilisé diapositives plus de six fois et a constaté la qualité des données encore satisfaisante. Pour garantir la meilleure sensibilité pour les échantillons les plus précieux ou des échantillons avec des ARN d'entrée minime, cependant, il est toujours prudent d'utiliser les diapositives frais 7.
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Disclosures
Pas de conflits d'intérêt déclarés.
Acknowledgments
Le travail a été soutenu en partie par le National Institute of Drug Abuse Centre (P50 DA 011 806) et United States Army Department of Defense (W81XWH-07-1-0183).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2 | Invitrogen | MIRMPS201 | Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest. |
| Trizol | Invitrogen | 15596018 | We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis. |
| T4 RNA Ligase 1 | New England Biolabs | M0204L | |
| Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit | Invitrogen | U21660 | This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well. |
| 5’-pCU-DY547-3’ | Dharmacon | Custom made | Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation. |
| CentriSep columns | Princeton Separations | CS-901 | |
| GAPSII coated slide | Corning | 40004 | Other types of slides may be also used. |
| Microarray hybridization chambers | Corning | 2551 or 40080 | Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours. |
| Lifterslips | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 25X60I-M5439-001-LS | |
| BlueFuse | BlueGenome | ||
| GeneSpring | Agilent Technologies |
References
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