Utföra Custom Experiment MikroRNA Microarray

Summary

En enkel procedur för att utföra egna experiment mikroRNA microarray beskrivs. De steg som ingår isolera RNA, märkning RNA och referens-DNA, hybridisering proverna till mikroarrayer, skannar microarrays, kvantifiera och analysera hybridisering signaler.

Abstract

mikroRNA (miRNA) är en stor familj av ~ 22 nukleotider (NT) långa RNA-molekyler som ofta uttrycks i eukaryoter ^1. Komplexa arvsmassa kodar minst hundratals miRNA, som främst hämmar uttrycket av ett stort antal mål gener efter transkriptionellt ^{2, 3.} miRNA styra ett brett utbud av biologiska processer ^1. Dessutom har förändrat miRNA uttryck har associerats med mänskliga sjukdomar såsom cancer, och miRNA kan fungera som biomarkörer för sjukdomar och prognos ^{4, 5.} Det är därför viktigt att förstå uttryck och funktioner miRNA under många olika förhållanden.

Tre viktiga metoder har använts för att profilera miRNA uttryck: realtids-PCR, microarray, och djupa sekvensering. Tekniken att miRNA microarray har fördelen av att vara hög genomströmning i allmänhet billigare, och de flesta av de experimentella och analys steg kan CarrIED i en molekylärbiologiska laboratoriet vid de flesta universitet, medicinska skolor och tillhörande sjukhus. Här beskriver vi en metod för att utföra egna experiment miRNA microarray. En miRNA sond som ska skrivas ut på objektglas för att producera miRNA mikroarrayer. RNA är isolerad med hjälp av en metod eller reagens som bevarar små RNA-arter, och sedan märkt med fluorescens färgämne. Som en kontroll, är referens-DNA oligonukleotider motsvarar en delmängd av miRNA också märkt med en annan fluorescens färgämne. Hänvisningen DNA kommer att visa kvaliteten på bild och hybridisering och kommer också att användas för data normalisering. RNA och DNA blandas och hybridiseras till en microarray bild med sonder för de flesta av miRNA i databasen. Efter tvätt är bilden skannas för att få bilder och intensiteten hos enskilda platser kvantifieras. Dessa råa signaler kommer att ytterligare bearbetas och analyseras som ett uttryck uppgifter i motsvarande miRNA. Microarray diabilder kan avlägsnas och regenereras för att minska kostnaderna för microarrays och öka samstämmigheten i microarray experiment. Samma principer och förfaranden som gäller för andra typer av anpassade microarray experiment.

Protocol

1. Utskrift av anpassade miRNA microarrays

1. Skriv ut microarray bilder med hjälp av microarray tjänster core facilitet vid ett universitet eller ett företag. Kvaliteten på microarray tillverkning är en av de mest kritiska faktorerna för att lyckas med en microarray experiment. Prova att ett fåtal tjänster om möjligt. Helst skulle man skriva ut 50-100 diabilder i taget, och alla bilder ser identiska, med väl separerade, enskilda platser.
2. För microarray stöd använder vi the Gaps II belagda diabilder.
3. För miRNA sonder använder vi nCode flera arter miRNA Microarray Probe Set V2.
4. Lös alla oligonukleotider i 3 x SSC vid 10 mikroM och quadruply skriva ut dem på bilderna. Fäst bilderna med ultraviolett strålning enligt anvisningarna för god redovisningssed II bilderna. Märk bilden med en diamant penna för att markera området och sidan med den tryckta sonder. Förvaras vid 22 ° C.

2. Provberedning

1. Alla metodereller reagens som kan användas för att isolera RNA, så länge det bevarar små RNA. Vi använder i allmänhet Trizol (Invitrogen) för att extrahera den totala RNA, med tillfredsställande kvantitet och kvalitet av RNA förberedelser, mätt med en _260nm och A _{280 nm} avläsningar.
2. För RNA-märkning, blanda ~ 25 mikrogram av det totala RNA med 0,5 mikrogram av 5'-PCU-DY547-3 ^"6 in 1 x buffert (50 mM HEPES, pH 7,8, 20 mm MgCl _2, 10 mikrogram / ​​ml BSA, 10% DMSO) innehåller ~ 20 enheter T4 RNA ligas 1, kompletterat med ~ 10 mM DTT och ~ 0,02-0,03 slutliga volym på 10 x T4 RNA ligas en buffert för ATP.
3. Låt märkning för att gå vidare på is i ett kylskåp 2-24 timmar. Fällning RNA med 0,3 M natriumacetat och 3 volymer av etanol. För effektiv ligation och nederbörd, lös totala RNA på över 2 mg / ml, och hålla den totala ligation volym på ~ 20 l.
   1. Om mindre RNA är tillgänglig, den ingående RNA och 5'-PCU-DY547-3 "kan skalas ner. </ Li>
   2. Om RNA är mycket utspädda, lägg bärare såsom jäst tRNA till stöd i nederbörd.
4. Kombinera och etikett i totalt 1 mikrogram av oligonukleotider referens DNA motsvarar en delmängd av däggdjur miRNA använda Ulysis Alexa Fluor 647 nukleinsyra Labeling Kit ⁶ som en kontroll för hybridisering processen. Rena märkt DNA med en CentriSep kolumn och spara i mörker vid -20 ° C.

3. Microarray hybridisering

1. För att använda bilderna för första gången, pre-hybridisera bilderna i en filtrerad lösning av 3 x SSC, 0,1% SDS, 0,2% BSA i 30-60 minuter vid 37 ° C. Sänk dem i vatten ett par gånger, sedan i isopropanol. Torka bilderna med hjälp av en centrifug med en bild adapter vid 100 gi 5 minuter vid 22 ° C.

Observera: Vi använder Corning microarray-hybridisering kammare och Erie Scientifics mSeries av Lifterslips att utföra microarray hybridisering.

2. Skölj lifterslips i vatten, sedan i etanol, före torkning i luft. Placera en bild i en microarray-hybridisering kammare bas, och en lifterslip ovanpå bilden. Den lifterslip täcker sonden området, med sin vita remsor kontakta bilden.
3. I mörkret, snurra ner utfällda, märkt RNA. Tvätta det en gång med 70% etanol och lufttorka pelleten. Den pellets ska vara rödaktig.
4. Förbered en hybridisering lösning som innehåller 400 mM Na ₂ HPO ₄ pH 7,0, 0,8% BSA, 5% SDS, 12% formamid ⁶ med 1/15-1/100 l av renat, märkt referens DNA (2,4) per RNA prov. Mängden tillsatt referens DNA beror på hur många olika oligonukleotider är märkta (2,4). Om det finns över 100, sedan mindre utspädning behövs.
5. Lös RNA pellets väl med ~ 60 ìl av hybridisering lösningen.
6. Tillsätt 20 l vatten till varje befuktning brunnar i Corning microarray-hybridisering kammare bas.
7. Lägg tHan blandning av märkt RNA och referens DNA till bilden. Använd en tunn pipettspetsen försiktigt röra vid kanten av lifterslip och låt lösningen att komma in i utrymmet mellan lifterslip och glida igenom sug.
8. Placera hybridisering locket över basen, sedan försegla kammaren med metallclips.
9. Sätt hela kammaren i plastpåsen som medföljer kammare kassetten från Corning.
10. Placera kammaren kassetten (s) i en behållare med fuktade hushållspapper, täcka behållaren med plastfolie och lägg den i en 37 ° C fuktig, cellodling inkubator för ~ 24 timmar. Dessa försiktighetsåtgärder (3,6, 3,9, 3,10) se till att hybridisering lösningen inte torka ut under inkubationstiden.

4. Post-hybridisering bearbetning

1. Demontera kammaren kassetterna en efter en. Sänk en bild och dess lifterslip i 2 x SSC vid 22 ° C. Den lifterslip kommer givetvis att falla från glaset. Lägg den i 0,8 x SSC. Tvättabilderna i 0,8 x SSC två gånger, sedan tre gånger i 0,4 x SSC, 1-2 minuter totalt. Torka bilderna med hjälp av en centrifug med en bild adapter. Tvätta lifterslips med vatten och spara för återanvändning senare.
2. Skanna diabilder med någon lämplig scanner, t.ex. den Perkin Elmer ScanArray 5000 eller Molecular Devices Axon GenePix 4000B microarray scanner. Skanna vid våglängder nära 547 nm och 647 nm för att få motsvarande bildfiler.
3. Använd program som BlueFuse att kvantifiera pixel intensiteter i input, bildfiler från 4,2). Inspektera enskilda platser med programmet att utesluta onormala fläckar på microarrays från vidare behandling. Dessa onormala fläckar uppstår oftast av dålig bild utskrift eller bild hantering efter hybridisering.
4. Använd program som GeneSpring och Excel för dataanalys och presentation. Allmänna synpunkter på microarray uppgifter normalisering tillämpas, vilket är utanför ramen för denna uppsats.
5. När tillfredsställande signaler erhålls afTER 4,3), skala microarray bilderna för återanvändning ^7. Skölj objektglasen i vatten och sedan doppa i förvärmda, 1 mM NaOH och 0,1 x Rymdbolaget i en färgning maträtt vid 62 ° C i 10-20 minuter. Upprepa inkubation gång. Tvätta bilderna några gånger i vatten upp till 60 minuter med försiktig skakning vid 22 ° C. Torka bilderna med hjälp av en centrifug och förvara vid 22 ° C.
6. För att kunna använda den regenererade bilderna, är det inte nödvändigt att i förväg hybridisera dem igen. Helt enkelt tvätta dem i vatten, följt av isopropanol, och torka glasen precis innan hybridisering.

5. Representativa resultat:

Vi i stort sett har följt de beskrivna förfarandena att profilera globala miRNA uttryck i tusentals prover, dvs RNA isolerat från zebrafisk till mänskliga exemplaret under många olika förhållanden. Figur 1 visar en skannad bild av ett microarray att demonstrera mycket exakt och starka hybridisering signaler på bild. Den Pearson correlatiom koefficienter mellan tekniska replikat av microarray-hybridisering är ~ 0,99 ^7, vilket indikerar god reproducerbarhet.

Figur 1 Sammansatt bild av en skannad miRNA microarray bild efter hybridisering. Röda prickar berodde hybridizations med hänvisningen DNA, gröna fläckar från DY547-märkt RNA prov, medan de gula fläckarna var från hybridizations av både DNA och RNA till samma sonder.

Discussion

Trots den senaste tidens framsteg i djup sekvenseringsteknologier förblir microarray ett lönsamt val för high-throughput analyser av DNA och RNA. Jämfört med djupa sekvensering, microarray experiment är billigare, och en typisk molekylärbiologiska laboratoriet kan utföra de flesta av de experiment och dataanalys i egen regi, som möjliggör flexibilitet och sparar tid. I framtiden mikroarrayer sannolikt väl lämpade för intensivt förhöra uppsättningar gener, t ex kan hela eller en delmängd av transkriptionsfaktorer i arvsmassan eller miRNA, och samma principer och metoder som presenteras här kan användas i anpassade microarray experiment för att studera genfamiljer förutom miRNA. Naturligtvis är en stor nackdel om microarrays sekvensen information måste finnas tillgänglig på förhand. Detta är inte ett problem för de flesta familjer protein genen i modellorganismer, men hur många miRNA gener finns fortfarande oklara. Sonden som vi har använt var utformat baserat på miRBase ⁸ 9, 10, är det uppenbart att den mest förekommande och mest biologiskt relevanta däggdjur miRNA redan omfattas av denna sond set.

Det finns inga stora tekniska utmaningar för att utföra anpassade microarray experiment. Baserat på vår erfarenhet, nycklarna till framgång för en microarray experiment är: 1) för att få väl tryckt diabilder, 2) att förbereda RNA av god kvalitet och i tillräcklig mängd, och 3) att ordentligt tvätta bilderna efter hybridisering. Trizol reagens ger normalt tillräcklig mängd intakt RNA för senare studier. Ändå varierar miRNA uttryck mellan olika vävnader och cellinjer. Under de flesta förhållanden bör 20-25 mikrogram av det totala RNA ge tillräckligt stark microarray signaler när märkas av ligering metoden. Mindre RNA krävs för miRNA-rika prover såsom hjärnan och nervceller. Om bara 1-5 mikrogram av det totala RNA eller mindre är tillgänglig, annan märkning metodS får användas, t ex RNA märkning kit från Invitrogen, och de är förenliga med de anpassade microarray plattformen beskrivs här. För bästa jämförelser bör en etikett alltid minst en kopia av all kontroll och experimentella prov samtidigt och hybridisera dem till samma utskrift parti bilder i ett enda experiment. Denna forskning design kommer att minimera bidraget till signalerna differential microarray som följer av ändringar i prov märkning och behandling och i bild kvalitet. Hänvisningen DNA (i röd kanal) fungerar som en kontroll för kvaliteten på bilden, hybridisering, och tvätt. En lyckad hybridisering ger rena och starka signaler i rött. Om DNA-signaler är bra men RNA signaler är inte så man ska felsöka stegen av RNA isolering och märkning. Till exempel, RNA har förhållandet A _260nm / A _{280 nm} mellan 1,9 och 2,1? Är pellets rödaktig i 3,3?

Merparten av investeringenför microarrays kan vara för bild utskrift och skanning. En microarray skrivare och en scanner är ofta utrustade med core facilitet vid många universitet och medicinska skolor. Utskrift microarrays i bulk och återanvända bilder och lifterslips kommer att avsevärt minska kostnaderna. Återanvända bilderna har dessutom fördelen av bättre konsekvens av microarray experiment ^7. Vi har återanvändas diabilder mer än sex gånger och hittade datakvaliteten fortfarande tillfredsställande. För att säkerställa bästa känsligheten för de mest värdefulla prover eller prover med minimal input RNA, dock är det fortfarande klokt att använda färska bilder ^7.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest.
Trizol	Invitrogen	15596018	We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis.
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit	Invitrogen	U21660	This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well.
5’-pCU-DY547-3’	Dharmacon	Custom made	Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation.
CentriSep columns	Princeton Separations	CS-901
GAPSII coated slide	Corning	40004	Other types of slides may be also used.
Microarray hybridization chambers	Corning	2551 or 40080	Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours.
Lifterslips	Thermo Fisher Scientific, Inc.	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent Technologies