Realización de experimentos de microarrays personalizados microARN

Summary

Un procedimiento sencillo de llevar a cabo experimentos de microarrays de encargo de microARN se describe. Los pasos incluyen el aislamiento de ARN, el ARN y el ADN de referencia el etiquetado, la hibridación de las muestras de microarrays, el escaneado de los microarrays, cuantificar y analizar las señales de hibridación.

Abstract

microARN (miRNA) son una gran familia de ~ 22 nucleótidos (nt) de longitud moléculas de ARN que se expresan ampliamente en las células eucariotas ^1. Genomas complejos codifican por lo menos cientos de miRNAs, que sobre todo inhibir la expresión de un gran número de genes diana transcripcional después de ^{2, 3.} miRNAs control de una amplia gama de procesos biológicos ^1. Además, la expresión alterada miRNA se ha asociado con enfermedades humanas como el cáncer, y los miRNAs pueden servir como biomarcadores de enfermedades y el pronóstico ^{4, 5.} Es importante, por lo tanto, para entender la expresión y función de los miRNAs en diferentes condiciones.

Tres enfoques principales han sido empleados para el perfil de expresión de miARN: PCR en tiempo real, de microarrays, secuenciación y profundidad. La técnica de los microarrays de miRNA tiene la ventaja de ser de alto rendimiento, en general, menos costoso, y la mayoría de las medidas experimentales y el análisis puede ser carrIED en un laboratorio de biología molecular en la mayoría de las universidades, escuelas médicas y hospitales asociados. Aquí se describe un método para realizar experimentos de microarrays de encargo miRNA. Una sonda conjunto miRNA se imprimirán en láminas de vidrio para producir microarrays miRNA. El ARN es aislado utilizando un método o reactivo que preserva las especies pequeñas de ARN, y marcado con un colorante fluorescente. Como control, los oligonucleótidos de ADN de referencia que corresponde a un subconjunto de miRNAs están marcados con un colorante fluorescente diferente. El ADN de referencia servirá para demostrar la calidad de la diapositiva y la hibridación y también se utiliza para la normalización de datos. El ARN y el ADN se mezclan y se hibridó con una diapositiva que contiene sondas de microarrays para la mayoría de los miRNAs en la base de datos. Después del lavado, la diapositiva se escanea para obtener imágenes y cuantificar la intensidad de los puntos individuales. Estas señales en bruto será procesada y analizada, los datos de expresión de los miRNAs correspondiente. MicroArray diapositivas se puede eliminar y se regenera para reducir el costo de microarrays y de mejorar la coherencia de experimentos de microarrays. Los mismos principios y procedimientos son aplicables a otros tipos de experimentos de microarrays personalizados.

Protocol

1. La impresión de microarrays miARN personalizado

1. Imprimir los microarrays diapositivas con los servicios básicos de microarrays instalaciones de una universidad o una empresa. La calidad de fabricación de microarrays es uno de los factores más críticos para el éxito de un experimento de microarrays. Pruebe algunos de los servicios si es posible. Lo ideal sería imprimir 50-100 diapositivas a la vez, y todas las diapositivas se ven idénticas, con buena separación, los puntos individuales.
2. Para el apoyo de microarrays, que el uso de las diapositivas GAPS II recubiertos.
3. Para las sondas de miRNA, se utiliza el nCode Multi-Especies miARN microarrays sonda Set V2.
4. Disolver todos los oligonucleótidos en 3 x SSC a 10 M y cuádruplemente imprimirlas en las diapositivas. Fijar las diapositivas por la irradiación ultravioleta de acuerdo a las instrucciones de las diapositivas GAAPS II. Etiqueta de la diapositiva con un lápiz de diamante para marcar el área y el lado con las sondas impreso. Almacenar a 22 ° C.

2. Preparación de la muestra

1. Cualquier métodoo reactivo se puede utilizar para aislar ARN, mientras que conserva los pequeños RNAs. Por lo general, el uso Trizol (Invitrogen) para extraer el ARN total, con la cantidad y calidad satisfactoria de preparaciones de ARN, según lo medido por un _{260 nm} y _{280 nm} A lecturas.
2. Para el ARN de etiquetado, mezcla de aproximadamente 25 g de ARN total con 0,5 mg de 5'-UCP-DY547-3 ^"6 en 1 x tampón (50 mM HEPES, pH 7,8, 20 mM MgCl _2, 10 mg / ml de BSA, el 10% DMSO) que contiene aproximadamente 20 unidades de T4 ARN ligasa 1, suplementado con 10 mM TDT ~ ~ 0.02-0.03 y volumen final de la 10 x T4 ARN ligasa un buffer de ATP.
3. Permitir el etiquetado de proceder en el hielo dentro de un refrigerador durante 2-24 horas. Precipitar el ARN con acetato de sodio 0,3 M y 3 volúmenes de etanol. Para la ligadura de eficiencia y la precipitación, se disuelven en el ARN total de más de 2 mg / ml, y mantener el volumen total de la ligadura de ~ 20 l.
   1. Si es menor de ARN está disponible, la cantidad de ARN de entrada y 5'-UCP-DY547-3 'puede ser reducido. </ Li>
   2. Si el ARN es muy diluida, añadir soporte como tRNA de levadura para ayudar en la precipitación.
4. Combine y la etiqueta de un total de 1 mg de oligonucleótidos de ADN de referencia correspondiente a un subconjunto de miRNAs de mamíferos utilizando la Ulysis Alexa Fluor 647 Kit nucleicos Etiquetado ácido ⁶ como un control para el proceso de hibridación. Purificar el ADN marcado con una columna Centrisep y guardar en la oscuridad a -20 ° C.

3. Microarrays de hibridación

1. Para utilizar las diapositivas, por primera vez, antes de la hibridación de las diapositivas de una solución de filtrado de 3 x SSC, SDS 0,1%, 0,2% BSA durante 30-60 min a 37 ° C. Sumergirlos en agua unas cuantas veces, y luego en isopropanol. Secar los portaobjetos al uso de una centrífuga con un adaptador para diapositivas a 100 g por 5 min a 22 ° C.

Nota: Usamos Corning cámaras de hibridación de microarrays y Erie Scientific mSeries de Lifterslips para llevar a cabo la hibridación de microarrays.

2. Enjuague la lifterslips en el agua, y luego en etanol, antes del secado en el aire. Coloque una diapositiva dentro de una base de la cámara de microarrays de hibridación, y un lifterslip en la parte superior de la diapositiva. El lifterslip cubrirá el área de la sonda, con sus franjas blancas en contacto con la diapositiva.
3. En la oscuridad, la desaceleración del precipitado, ARN marcado. Lavar una vez con etanol al 70%, y el aire seco de la pastilla. La pastilla debe ser de color rojizo.
4. Prepare una solución de hibridación que contenía 400 mM Na ₂ HPO ₄ pH 7,0, el 0,8% de BSA, 5% SDS, 12% de formamida ⁶ con 1/15-1/100 l de la purificada, con la etiqueta de ADN de referencia (2,4) por cada muestra de ARN. La cantidad de ADN de referencia añadido depende de la cantidad de diferentes oligonucleótidos están etiquetados (2,4). Si hay más de 100, entonces una menor dilución que se necesita.
5. Disolver el precipitado de ARN bien con aproximadamente 60 l de la solución de hibridación.
6. Añadir 20 l de agua para cada uno de los pozos de humidificación en la base de Corning cámara de hibridación de microarrays.
7. Añadir tque mezcla de ARN y el ADN marcado referencia a la diapositiva. Utilice una punta de pipeta fina, toque suavemente el borde de la lifterslip, y permitir que la solución penetre en el espacio entre el lifterslip y deslizarse a través de la succión.
8. Coloque la cámara de hibridación cubierta sobre la base, luego sellar la cámara con clips metálicos.
9. Ponga toda la cámara interior de la bolsa de plástico que viene con el cartucho de cámara de Corning.
10. Coloque la cinta de la cámara (s) dentro de un recipiente con una toalla de papel humedecida, cubra el recipiente con papel plástico y se coloca dentro de 37 ° C húmedo, incubadora de cultivo de células de ~ 24 horas. Estas precauciones (3.6, 3.9, 3.10) asegurarse de que la solución de hibridación no se seque durante la incubación.

4. Después de la hibridación de procesamiento

1. Desmontar los casetes de la cámara de uno por uno. Sumerja una diapositiva y su lifterslip en 2 x SSC a 22 ° C. El lifterslip caerá naturalmente fuera de la diapositiva. Colocarlo en 0,8 x SSC. Lavarlas diapositivas en 0,8 x SSC dos veces, tres veces en 0,4 x SSC, 1-2 minutos en total. Secar los portaobjetos al uso de una centrífuga con un adaptador para diapositivas. Lave la lifterslips con agua y ahorrar para su reutilización posterior.
2. Escaneo de las diapositivas con cualquier escáner adecuado, por ejemplo, la Perkin Elmer 5000 o ScanArray Molecular Devices AXON GenePix 4000B escáner de microarrays. Exploración en longitudes de onda cercana a 547 nm y 647 para obtener los archivos de imagen correspondiente.
3. Utilizar programas como BlueFuse para cuantificar la intensidad de los píxeles de la entrada, los archivos de imagen de 4,2). Inspeccione los puntos individuales con el programa para excluir zonas anormales en los microarrays de mayor consideración. Estas manchas anormales suelen surgir de la impresión de diapositivas o diapositivas pobre manejo después de la hibridación.
4. Utilizar programas como GeneSpring y Excel para el análisis y presentación de datos. Consideraciones generales para la normalización de los datos de microarrays se aplican, lo que está fuera del alcance de este documento.
5. Una vez que las señales satisfactorios se obtienen after 4.3), tira de las diapositivas de microarrays para la reutilización ^7. Enjuague los portaobjetos en agua y luego sumergirse en la pre-calentado, 1 mM NaOH y 0,1 x SSC en un plato de tinción a 62 ° C durante 10-20 minutos. Repita la incubación una vez. Lave el C. desliza un par de veces en el agua hasta por 60 minutos con agitación suave a 22 ° Secar los portaobjetos utilizando una centrifugadora, y almacenar a 22 ° C.
6. Para utilizar las diapositivas regenerado, no es necesario para pre-hibridación de nuevo. Simplemente lavarlos en agua, seguido de isopropanol, y seca las diapositivas justo antes de la hibridación.

5. Los resultados representativos:

En gran medida hemos seguido los procedimientos descritos en el perfil de expresión de miRNA mundial en miles de muestras, es decir, ARN aislado de las muestras de los peces cebra que bajo muchas condiciones diferentes. La figura 1 muestra una imagen escaneada de un microarray de demostrar señales de hibridación muy precisas y fuertes en el diapositivas. El correlati Pearsonen los coeficientes entre repeticiones técnica de hibridación de microarrays se ~ 0.99 ^7, lo que indica una excelente reproducibilidad.

Figura 1 Imagen compuesta de una diapositiva escaneada miARN microarrays después de la hibridación. Manchas rojas resultado de hibridaciones por el ADN de referencia, los puntos verdes de la muestra DY547-RNA marcado, mientras que las manchas amarillas eran de hibridaciones tanto por el ADN y el ARN de las mismas sondas.

Discussion

A pesar de los avances recientes en profundidad las tecnologías de secuenciación, microarrays sigue siendo una opción viable de alto rendimiento para el análisis de ADN y ARN. En comparación con la secuenciación de profundidad, los experimentos de microarrays son más baratos, y un laboratorio típico de la biología molecular puede realizar la mayoría de los experimentos y análisis de datos in-house, que permite flexibilidad y ahorro de tiempo. En el futuro, es probable microarrays bien adaptado para interrogar intensivamente conjuntos de genes, por ejemplo, todos o un subconjunto de los factores de transcripción en un genoma o miRNAs, y los mismos principios y procedimientos que aquí se presenta puede ser utilizado en los experimentos de microarrays para el estudio personalizado familias de genes, además de miRNAs. Por supuesto, una desventaja importante de microarrays es que información de la secuencia debe estar disponible a priori. Este no es un problema para la mayoría de las familias de proteínas de genes en organismos modelo, aunque el número de genes miRNA hay siguen sin estar claros. La sonda conjunto que hemos estado usando ha sido diseñado sobre la base de miRBase ⁸ 9, 10, es evidente que los miRNAs de mamíferos más abundantes y más relevantes biológicamente ya están cubiertos por este conjunto de la sonda.

No hay grandes desafíos técnicos para llevar a cabo experimentos de microarrays de costumbre. Basándonos en nuestra experiencia, las claves para el éxito de un experimento de microarrays son: 1) para obtener así impresos diapositivas, 2) para preparar el ARN de buena calidad y en cantidad suficiente, y 3) para lavar correctamente las diapositivas después de la hibridación. Reactivo Trizol normalmente produce suficientes cantidades de ARN intacto para estudios posteriores. Sin embargo, la expresión de miRNA varía entre los diferentes tejidos y líneas celulares. En la mayoría de condiciones, 20-25 g de ARN total debe dar señales de microarrays suficientemente fuerte cuando se han etiquetado por el método de ligadura. Menos de ARN se requiere para las muestras de miRNA-ricos, tales como las regiones del cerebro y las neuronas. Si tan sólo 5.1 g de ARN total o menos es el método disponible, otro etiquetados se puede utilizar, por ejemplo, el ARN kits etiquetado de Invitrogen, y que sean compatibles con la plataforma de microarrays de encargo se describe aquí. Para obtener el mejor comparaciones, siempre se debe etiquetar al menos una réplica de todas las muestras de control y experimental al mismo tiempo y se hibridan a la impresión por lotes mismo de diapositivas en un solo experimento. Este diseño de la investigación será minimizar la contribución a las señales de microarrays diferencial resultante de las variaciones en el etiquetado y procesamiento de muestras y en la calidad de la diapositiva. El ADN de referencia (en el canal rojo) sirve como control de la calidad de la diapositiva, la hibridación y el lavado. Una hibridación exitosa dará señal limpia y fuerte en rojo. Si las señales de ADN son buenas, pero las señales de ARN no son, entonces uno debe disparar sin problemas los pasos de aislamiento de ARN y el etiquetado. Por ejemplo, ¿el ARN tienen la relación A _{260 nm} / _{280 nm} A entre 1,9 y 2,1? Es el color rojizo de pellets en 3,3?

La mayor parte de la inversiónde microarrays puede ser para la impresión de diapositivas y de exploración. Una impresora y un escáner de microarrays se equipan a menudo por la facilidad de la base de muchas universidades y escuelas de medicina. Microarrays de impresión en las diapositivas a granel y la reutilización y el lifterslips reducirá significativamente el costo. La reutilización de diapositivas tiene la ventaja adicional de mejorar la coherencia de los experimentos de microarrays ^7. Hemos reutilizado diapositivas más de seis veces y nos pareció la calidad de los datos sigue siendo satisfactoria. Para asegurar la mejor sensibilidad para las muestras más preciosas o muestras de ARN con una participación mínima, sin embargo, sigue siendo prudente utilizar diapositivas fresca ^7.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest.
Trizol	Invitrogen	15596018	We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis.
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit	Invitrogen	U21660	This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well.
5’-pCU-DY547-3’	Dharmacon	Custom made	Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation.
CentriSep columns	Princeton Separations	CS-901
GAPSII coated slide	Corning	40004	Other types of slides may be also used.
Microarray hybridization chambers	Corning	2551 or 40080	Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours.
Lifterslips	Thermo Fisher Scientific, Inc.	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent Technologies