Udførelse Brugerdefineret MicroRNA Microarray Eksperimenter

Summary

En simpel procedure til at udføre brugerdefinerede microRNA microarray eksperimenter er beskrevet. Trinene omfatter isolere RNA, mærkning RNA og reference DNA, hybridizing prøverne til microarrays, scanning af microarrays, kvantificere og analysere hybridisering signaler.

Abstract

microRNA (miRNA) er en stor familie af ~ 22 nukleotider (NT) lange RNA molekyler, der er bredt udtrykt i eukaryoter ^1. Komplekse genomer indkode mindst hundredvis af miRNA, der primært hæmmer udtryk for et stort antal af mål gener efter transcriptionally ^{2, 3.} miRNA styre en bred vifte af biologiske processer ^1. Hertil kommer, har ændret miRNA udtryk været forbundet med menneskelige sygdomme såsom kræft, og miRNA kan tjene som biomarkører for sygdomme og prognose ^{4, 5.} Det er derfor vigtigt, at forstå udtryk og funktioner miRNA under mange forskellige forhold.

Tre store tilgange har været ansat for at profilere miRNA udtryk: real-time PCR, microarray og dybe sekventering. Teknikken af ​​miRNA microarray har den fordel, at high-throughput, generelt billigere, og de fleste af de eksperimentelle og analyse trin kan CarrIED i et molekylærbiologisk laboratorium på de fleste universiteter, medicinske skoler og tilknyttede hospitaler. Her beskriver vi en metode til at udføre brugerdefinerede miRNA microarray eksperimenter. En miRNA probe sæt vil blive trykt på objektglas til at producere miRNA microarrays. RNA er isoleret ved hjælp af en metode eller reagens, der bevarer små RNA arter, og derefter mærket med et fluorescerende farvestof. Som en kontrol, der henvises DNA oligonukleotider svarende til en delmængde af miRNA også mærket med en anden fluorescens farvestof. Henvisningen DNA vil tjene til at demonstrere kvaliteten af ​​dias og hybridisering, og vil også blive brugt til data normalisering. RNA og DNA er blandet og hybridiseret til en microarray slide indeholdende prober for de fleste af miRNA i databasen. Efter vask er det dias scannes for at få billeder og intensiteten af ​​de enkelte pletter kvantificeret. Disse rå signaler vil blive yderligere behandlet og analyseret som et udtryk data i de tilsvarende miRNA. Microarray slides kan fjernes, og regenereres til at reducere omkostningerne ved microarrays og styrke sammenhængen i microarray eksperimenter. De samme principper og procedurer, som gælder for andre typer af brugerdefinerede microarray eksperimenter.

Protocol

1. Udskrivning af brugerdefinerede miRNA microarrays

1. Udskriv microarray dias ved hjælp af microarray core facility services på et universitet eller en virksomhed. Kvaliteten af ​​microarray fabrikation er en af ​​de mest kritiske faktorer for succes i en microarray eksperiment. Prøv et par tjenester, hvis det er muligt. Ideelt set ville man udskrive 50-100 dias ad gangen, og alle dias vil se ens ud, med godt adskilte, individuelle pletter.
2. For microarray support, bruger vi de huller II-belagte objektglas.
3. For miRNA sonder, bruger vi NCode flere arter miRNA Microarray Probe Set V2.
4. Opløs alle oligonukleotider i 3 x SSC på 10 m og quadruply udskrive dem på dias. Fastgør objektglassene ved ultraviolet bestråling i henhold til vejledningen til GAAP II dias. Mærk slide med en diamant kuglepen til at markere området og side med den trykte sonder. Opbevares ved 22 ° C.

2. Prøveforberedelse

1. Enhver metodeeller reagens kan anvendes til at isolere RNA, så længe det bevarer små RNA. Vi plejer at bruge Trizol (Invitrogen) til at udtrække total RNA med tilfredsstillende kvantitet og kvalitet af RNA præparater, målt ved en _260nm og A _280nm aflæsninger.
2. For RNA mærkning, bland ~ 25 mikrogram total RNA med 0,5 mikrogram af 5'-PCU-DY547-3 ^{'6 in} 1 x buffer (50 mM HEPES, pH 7,8, 20 mM MgCl _2, 10 mikrogram / ​​ml BSA, 10% DMSO) indeholder ~ 20 enheder T4 RNA-ligase 1, suppleret med ~ 10 mM DTT og ~ 0,02-0,03 endelige volumen af ​​de 10 x T4 RNA-ligase en buffer for ATP.
3. Tillad mærkning for at fortsætte på is inde i et køleskab i 2-24 timer. Bundfald RNA med 0,3 M natriumacetat og 3 mængder af ethanol. For effektiv ligatur og nedbør, opløses alt RNA på over 2 mg / ml, og holde den samlede ligatur lydstyrken på ~ 20 μl.
   1. Hvis mindre RNA er tilgængelig, mængden af ​​input-RNA og 5'-PCU-DY547-3 'kan skaleres ned. </ Li>
   2. Hvis RNA er meget fortyndet, tilføje carrier såsom gær tRNA til støtte i nedbør.
4. Kombiner og etiket i alt 1 mikrogram henvisning DNA oligonukleotider, der svarer til en delmængde af pattedyr miRNA ved hjælp af Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit ⁶ som kontrol for hybridisering processen. Rense mærkede DNA ved hjælp af en CentriSep kolonne og gemme i mørke ved -20 ° C.

3. Microarray hybridisering

1. Hvis du vil bruge dias for første gang, præ-hybridisere de dias i en filtreret opløsning af 3 x VSK, 0,1% SDS, 0,2% BSA i 30-60 min ved 37 ° C. Nedsænkes i vand et par gange, derefter i isopropanol. Tør dias ved hjælp af en centrifuge med et dias adapter på 100 gr i 5 min ved 22 ° C.

Bemærk: Vi bruger Corning microarray hybridisering kamre og Erie Scientifics mSeries af Lifterslips at udføre microarray hybridisering.

2. Skyl lifterslips i vand, derefter i ethanol, inden tørring i luften. Placer et dias i en microarray hybridisering kammer base, og en lifterslip på toppen af ​​diaset. Den lifterslip vil dække sonden område, med sine hvide striber kontakte diaset.
3. I mørket, spin ned udfældede, mærkede RNA. Vask det én gang med 70% ethanol, og lufttørre pellet. Pillen skal være rødlig.
4. Forbered en hybridiseringsopløsning indeholdende 400 mM Na ₂ HPO ₄ pH 7,0, 0,8% BSA, 5% SDS, 12% formamid ⁶ med 1/15-1/100 μl af renset, mærket henvisning DNA (2,4) pr RNA prøve. Den tilsatte mængde henvisning DNA afhænger af, hvor mange forskellige oligonukleotider er mærket (2,4). Hvis der er over 100, så mindre fortynding er nødvendig.
5. Opløs RNA pellet godt med ~ 60 μl af hybridiseringsopløsning.
6. Tilsæt 20 μl af vand til hver af de befugtning brønde i Corning microarray hybridisering kammer base.
7. Tilføj than blanding af mærket RNA og reference DNA til diaset. Brug en tynd pipette spids, blidt røre ved kanten af ​​lifterslip, og lad opløsningen at komme ind i rummet mellem lifterslip og glide gennem suge.
8. Placer hybridisering kammer dækker over basen, og derefter forsegle kammeret med metal clips.
9. Put det hele kammer inde i plastikposen, der kommer med kammeret kassette fra Corning.
10. Placer kammer kassette (r) inde i en beholder med fugtet køkkenrulle; dække beholderen med plastfolie og læg den i en 37 ° C fugtigt, cellekultur inkubator for ~ 24 timer. Disse forholdsregler (3,6, 3,9, 3.10) sikre, at hybridisering løsning ikke tørrer ud under inkubationen.

4. Post-hybridisering behandling

1. Afmonter kammeret kassetter én efter én. Nedsænkes et dias og dens lifterslip i 2 x SSC ved 22 ° C. Den lifterslip vil naturligvis falde væk fra diaset. Placer den i 0,8 x SSC. Vaskdias i 0,8 x SSC to gange, derefter tre gange i 0,4 x SSC, 1-2 min i alt. Tør dias ved hjælp af en centrifuge med et dias adapter. Vask lifterslips med vand og gemme til genbrug senere.
2. Scanne dias med en egnet scanner, fx den Perkin Elmer ScanArray 5000 eller Molecular Devices Axon GenePix 4000B microarray scanner. Scan bølgelængder tæt på 547 nm og 647 nm for at opnå den tilsvarende billedfiler.
3. Bruge programmer såsom BlueFuse at kvantificere pixel intensiteten i input, billedfiler fra 4.2). Efterse enkelte pletter med det program for at udelukke unormale pletter på microarrays fra videre behandling. Disse unormale pletter som regel skyldes dårlig slide udskrivning eller slide håndtering efter hybridisering.
4. Brug programmer som GeneSpring og Excel til dataanalyse og præsentation. Generelle overvejelser for microarray data normalisering gælder, som ligger uden for rammerne af dette papir.
5. Når tilfredsstillende signaler er opnået ofTer 4.3), strimler af microarray lysbilleder til genbrug ^7. Skyl objektglassene i vand, så nedsænkes i forvarmet, 1 mM NaOH og 0,1 x VSK i en farvning parabol på 62 ° C i 10-20 minutter. Gentag inkubation gang. Vask slides et par gange i vand i op til 60 minutter under forsigtig omrystning ved 22 ° C. Tør dias ved hjælp af en centrifuge, og opbevares ved 22 ° C.
6. Hvis du vil bruge regenereret dias, er det ikke nødvendigt at pre-hybridisere dem igen. Du skal bare vaske dem i vand efterfulgt af isopropanol, og tør det slides lige før hybridisering.

5. Repræsentative resultater:

Vi har stort set fulgt de beskrevne procedurer for at profilere globale miRNA udtryk i tusindvis af prøver, det vil sige, RNA isoleret fra zebrafisk for menneskers modellen under mange forskellige forhold. Figur 1 viser et scannet billede af en microarray at demonstrere meget præcise og stærke hybridisering signaler på dias. Den Pearson correlatiom koefficienter mellem tekniske analyser af microarray hybridisering er ~ 0,99 ^7, der angiver fremragende reproducerbarhed.

Figur 1 Composite billede af et scannet miRNA microarray slide efter hybridisering. Røde pletter skyldes hybridizations af henvisningen DNA, grønne pletter fra DY547-mærkede RNA stikprøven, mens de gule pletter var fra hybridizations af både DNA og RNA til samme sonder.

Discussion

Trods nylige fremskridt i dyb sekventering teknologier, forbliver microarray en levedygtig valg for high-throughput analyse af DNA og RNA. Sammenlignet med dyb sekventering, microarray eksperimenter er billigere, og en typisk molekylærbiologisk laboratorium kan udføre de fleste af de eksperimenter og dataanalyse in-house, hvilket giver mulighed for fleksibilitet og sparer tid. I fremtiden er microarrays sandsynligvis velegnet til intensivt afhøre sæt af gener, fx kan alle eller en delmængde af de transkriptionsfaktorer i et genom eller miRNA, og de samme principper og procedurer, der fremsættes her, bruges i brugerdefinerede microarray eksperimenter til at studere gen familier foruden miRNA. Selvfølgelig er en stor ulempe om microarrays denne rækkefølge oplysninger skal være tilgængelige på forhånd. Dette er ikke et problem for de fleste protein-gen familier i modelorganismer, men hvor mange miRNA gener der er fortsat uklare. Sonden satte vi har brugt er designet ud fra miRBase ⁸ 9, 10, er det klart, at den mest udbredte og mest biologisk relevante pattedyr miRNA allerede er omfattet af denne sonde sæt.

Der er ingen større tekniske udfordringer til at udføre brugerdefinerede microarray eksperimenter. Baseret på vores erfaringer, er nøglen til succes for en microarray eksperiment: 1) at få godt trykt dias, 2) at forberede RNA af god kvalitet og i tilstrækkelige mængder, og 3) til korrekt vaske slides efter krydsning. Trizol reagens typisk yder tilstrækkelige mængder af intakt RNA til efterfølgende undersøgelser. Ikke desto mindre, miRNA udtryk varierer mellem forskellige væv og cellelinier. Under de fleste forhold skulle 20-25 mikrogram total RNA giver tilstrækkelig stærk microarray signaler, når mærket af ligatur metode. Mindre RNA er nødvendig for miRNA-rige prøver, såsom hjerne regioner og neuroner. Hvis der kun 1-5 mikrogram total RNA eller mindre er til rådighed, andre mærkning metodes kan anvendes, fx RNA mærkning kits fra Invitrogen, og de er forenelige med den brugerdefinerede microarray platform, der er beskrevet her. For de bedste sammenligninger, bør man altid etiketten mindst en gengivelse af alle de kontrol-og eksperimentelle prøver samtidig og krydse dem til den samme print parti dias i en enkelt eksperiment. Denne forskning design vil minimere bidrag til forskellen microarray signaler som følge af udsving i prøve mærkning og behandling og i slide kvalitet. Henvisningen DNA (i rødt kanal) fungerer som en kontrol for kvaliteten af ​​dias, hybridisering, og vask. En succesfuld hybridisering vil give ren og stærke signaler i rødt. Hvis DNA-signaler er gode, men RNA-signaler ikke er det, så bør man problemfri skyde trin af RNA isolation og mærkning. For eksempel gør RNA har forholdet A _260nm / A _280nm mellem 1,9 og 2,1? Er pellet rødlige i 3.3?

Størstedelen af ​​investeringernefor microarrays kan være til slide udskrivning og scanning. En microarray printer og en scanner, er ofte udstyret med Core facilitet på mange universiteter og medicinske skoler. Udskrivning microarrays i bulk og genbruge dias og lifterslips vil reducere omkostningerne. Genbrug dias har den yderligere fordel af at forbedre sammenhængen i microarray eksperimenter ^7. Vi har genbrugt slides mere end seks gange og fandt datakvaliteten stadig tilfredsstillende. For at sikre den bedste følsomhed for de mest dyrebare prøver eller prøver med et minimum af input RNA, men det er stadig klogt at bruge friske dias ^7.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
NCode Multi-Species miRNA Microarray Probe Set V2	Invitrogen	MIRMPS201	Designed based on the miRBase Release 9.0 (October 2006). It contains ˜ 1,140 unmodified, 34-44 nt long oligonucleotides as probes for worm, fly, zebrafish, mouse, rat, and human miRNAs, and a number of internal control probes such as snoRNAs. The miRNA probes are doublets of the sequences complementary to mature miRNAs, hence the size of ˜ 44 nt. For analysis one can focus on miRNAs from a particular genome(s) of interest.
Trizol	Invitrogen	15596018	We have also used enriched, small RNA fraction for labeling, although total RNA samples are faster and easier to prepare and to quantify and suitable for downstream applications such as mRNA analysis.
T4 RNA Ligase 1	New England Biolabs	M0204L
Ulysis Alexa Fluor 647 Nucleic Acid Labeling Kit	Invitrogen	U21660	This kit or similar products can be used to label experimental RNA samples or a control RNA (instead of control DNA) as well.
5’-pCU-DY547-3’	Dharmacon	Custom made	Small RNA fraction can be similarly labeled by ligation.
CentriSep columns	Princeton Separations	CS-901
GAPSII coated slide	Corning	40004	Other types of slides may be also used.
Microarray hybridization chambers	Corning	2551 or 40080	Other kinds of hybridization chambers and coverslips should also work. Using commercially available hybridization machines can reduce hybridization time significantly, e.g., to ˜ 2 hours.
Lifterslips	Thermo Fisher Scientific, Inc.	25X60I-M5439-001-LS
BlueFuse	BlueGenome
GeneSpring	Agilent Technologies