Vídeo taxa de microscopia de varredura confocal e Microendoscopy

Summary

A construção completa de um costume, sistema de imagens em tempo real confocal de varredura é descrito. Este sistema, que pode ser facilmente utilizado para vídeo-microscopia e taxa de microendoscopy, permite uma variedade de geometrias de imagem e aplicações que não sejam acessíveis usando o padrão comercial sistemas confocal, em uma fração do custo.

Abstract

Microscopia confocal tem se tornado uma ferramenta valiosa na biologia e nas ciências biomédicas, permitindo rápido, de alta sensibilidade e alta resolução de seccionamento óptico de sistemas complexos. Microscopia confocal é rotineiramente usado, por exemplo, para estudar alvos celulares específicos ^1, monitor dinâmica em células vivas ^2-4, e visualizar a evolução tridimensional de organismos inteiros ^5,6. Extensões de sistemas de imagem confocal, como microendoscopes confocal, permitem alta resolução de imagem in vivo ⁷ e estão actualmente a ser aplicado a imagem da doença e diagnóstico em clínicas ^8,9.

Microscopia confocal tridimensional fornece resolução criando os chamados "seções óptica" utilizando óptica geométrica simples. Em um microscópio de campo amplo padrão, de fluorescência gerada a partir de uma amostra é coletada por uma lente objetiva e retransmitidas diretamente para um detector. Enquanto aceitarcapaz de amostras de imagem fina, as amostras de espessura embaçada por fluorescência gerada acima e abaixo do plano objetivo focal. Em contraste, microscopia confocal permite corte, virtual óptico de amostras, rejeitando out-of-foco de luz para construir de alta resolução representações tridimensionais de amostras.

Microscópios confocal a conseguir este feito através de uma abertura confocal no caminho do feixe de detecção. A fluorescência de uma amostra coletada pelo objectivo é retransmitida de volta através dos espelhos de varredura e através do espelho primário dicróicas, um espelho para refletir cuidadosamente selecionados comprimentos de onda mais curtos, como o feixe de laser de excitação durante a passagem do tempo, Stokes-shifted emissão de fluorescência. Este sinal de longo comprimento de onda de fluorescência é então passado para um par de lentes de ambos os lados de um diafragma que é posicionado em um avião exatamente conjugado com o plano focal da lente objetiva. Fótons coletados a partir do volume focal do objeto são colimadospela lente objetiva e estão focados pelas lentes confocal através do pinhole. Fluorescência gerado acima ou abaixo do plano focal, portanto, não ser colimada corretamente, e não vai passar pelo pinhole confocal ^1, a criação de uma secção óptica na qual apenas a luz do foco do microscópio é visível. (Fig. 1). Assim, o pinhole age efetivamente como uma abertura virtual no plano focal, restringindo a emissão detectada apenas uma localização espacial limitada.

Comercial moderno microscópios confocal oferecer aos usuários uma operação totalmente automatizada, fazendo procedimentos de imagem anteriormente complexo relativamente simples e acessível. Apesar da flexibilidade e potência desses sistemas, comercial microscópios confocal não são adequados para todas as tarefas de imagem confocal, como muitos em aplicações de imagem in vivo. Sem a capacidade de criar sistemas de imagem personalizada para atender suas necessidades, experiências importantes podem ficar fora da reaçãoh para muitos cientistas.

Neste artigo, nós fornecemos um método passo-a-passo para a construção completa de um costume, sistema de imagem de vídeo de taxa de confocal a partir de componentes básicos. O microscópio vertical será construído utilizando um espelho ressonante galvanométricos para fornecer o eixo de varredura rápida, enquanto um padrão de velocidade de espelho ressonante galvanométricos irá verificar o eixo lento. Para criar um feixe preciso digitalizados no foco da lente objetiva, esses espelhos serão posicionados nos planos chamados telecêntrica usando quatro lentes relay. Detecção confocal será realizada usando um padrão, tubo fotomultiplicador off-the-shelf (PMT), e as imagens serão capturadas e exibidas usando um cartão de framegrabber Matrox eo software incluído.

Protocol

A escolha do comprimento de onda laser, espelho dicróico e filtros ópticos deve ser determinado com base no corantes específicos sendo usada no experimento. Por exemplo, a imagem confocal de uma amostra corados com Alexa Fluor 488 é feita através de um laser de 488 nm, a 500 nm longa-pass espelho dicróico, e um espelho de 30 nm de largura de banda de banda centrada em 515 nm. Em contraste, a imagem latente confocal do corante vermelho Alexa Fluor 647 exigiria um conjunto diferente de componentes. O microscópio neste protocolo foi construído para visualizar qualquer corante que absorve fortemente em 400 nm e emite além de 450 nm. Assim, optamos por um laser de 406 nm de excitação e um 425 nm longa-pass dicróicas para refletir o feixe de laser. Fluoróforos animado pode ser seletivamente imaginado por selecionar os filtros de emissão apropriado. É importante o uso de hardware óptico montagem correta durante todo o protocolo quando indicado; hardware imprópria ou improvisadas não irá realizar o alinhamento bem e pode ser um risco de segurança.

<class = p "jove_title"> 1. Criação do espelho de ressonância galvanométricos e óptica relay

Um conceito importante na construção de qualquer tipo de sistema de digitalização confocal é telecentricidade. Em um sistema telecêntrica óptica, as lentes são espaçadas umas das outras pela soma de suas distâncias focais, de tal forma que a ampliação do sistema é simplesmente definido pela razão entre os comprimentos focais ^1. Isto permite a construção de um sistema de relé óptico onde a ampliações e, assim, as propriedades do sistema, são facilmente definidos pela escolha de lentes. Outro conceito importante envolve os chamados "estacionário" aviões óptica, também conhecida como "planos de abertura". Um plano de abertura é uma posição ao longo do caminho óptico, onde o feixe de luz não sofre qualquer tipo de movimento lateral. Neste projeto microscópio, há três planos de abertura importante: os espelhos primeira e segunda verificação, e na parte traseira de abertura da lente objetiva. A fim de atingir melhor feixe scanning no plano focal da objetiva, o feixe de entrar na abertura parte de trás da lente objetiva deve ser estacionário, varrendo apenas no ângulo. A fim de criar este estacionário, plano de ângulo varrido, precisamos colocar os espelhos primeira e segunda varredura em conjugado, aviões telecêntrica para o objectivo de volta de abertura. Lentes colocado entre os espelhos e as lentes objetivas servem para transmitir o feixe de ângulo digitalizados entre estes aviões estacionários (Fig. 2). Os espelhos de varredura são montados em dois galvos digitalização, cada um dos quais é responsável para a digitalização de uma dada direção do plano de imagem (X e Y). Para obter a taxa de varredura de linha necessária para o vídeo de taxa de imagem, um Galvo alta freqüência de ressonância é necessário para digitalizar o eixo x (também conhecido como o eixo "fast"). Estes utilizam uma galvos sensíveis, circuitos de feedback de circuito fechado para criar um padrão de leitura sinusoidal e são capazes de operar a freqüências muito altas, que selecionou um Galvo 8 kHz para esta compilação.

1. Estabelecero colimador de fibra óptica no monte e cerca de dirigir o feixe usando os parafusos de ajuste de tal forma que ele viaja em linha reta tanto horizontalmente quanto verticalmente. Agora, pegue uma íris e coloque-o na frente do colimador da fibra, ajustando a altura vertical da íris é tal que o feixe passa limpa através do centro da íris. Em seguida, mova a íris de distância do colimador ao longo do caminho do feixe e observar se o feixe ainda viaja pelo centro da íris. Se não, ajustar a posição do feixe na íris usando os dois parafusos de ajuste.
2. Coloque o espelho montado dicróicas no caminho do feixe com o feixe de laser posicionado a aproximadamente o centro do espelho. Antes de fixar o espelho para a mesa, girar o titular espelho para refletir o raio de aproximadamente 90 graus e cerca de ajustar a reflexão para que a altura vertical do feixe de laser refletido não muda.
3. Coloque um espelho ressonante montada galvanométricos no caminho do feixe de laser, tendo carroe para garantir que o feixe de laser é posicionado no centro exato horizontal da superfície do espelho. Neste protocolo, o espelho Galvo ressonante foi expoxied diretamente a uma montagem de espelho. Gire a montagem de espelho para refletir o feixe de laser em um ângulo de 90 graus. Cerca de ajustar o reflexo do espelho para manter a altura do feixe de laser mesma vertical.
4. , A fim de direcionar qualquer raio de luz em uma determinada direção, deve-se, por definição, definir dois pontos no espaço através do qual o raio vai viajar. Isto é tipicamente realizado pela colocação de dois íris ao longo do caminho desejado horizontal e vertical e manipular o feixe de laser para passar pelo centro de cada íris. Quatro graus de liberdade são necessárias para ajustar o feixe; dois graus horizontal e vertical de liberdade para cada íris. A forma mais comum e simples de alcançar estes graus de liberdade é a utilização de dois espelhos para dirigir, ou "andar", um feixe de laser.
   Tome duas íris, e definir a sua altura vertical comono passo 1.1, usando o feixe de laser refletido no espelho Galvo ressonante como uma referência. Agora, usando os orifícios dos parafusos na breadboard óptico como um guia para o olho, aperto as duas íris para baixo em uma linha reta.
5. Ajustar o espelho dicróico e espelho Galvo ressonante para dirigir o feixe de laser através do centro das duas íris. Use o primeiro espelho no caminho (o espelho dicróico) para o centro do feixe sobre a íris primeiro, e depois usar o segundo espelho no caminho (o espelho Galvo ressonante) para o centro do feixe na íris segundo. Iterativamente ajustar estes dois espelhos até que o feixe é alinhado através de ambas as íris, garantindo que todo o feixe de laser refletido no espelho Galvo ressonância ainda é refletida a partir do centro do espelho aproximados. Se o feixe se desviou, ajustar a montagem colimador de fibra e repita os passos acima iterativo.
6. Com o feixe centrado em ambos íris, vamos agora colocar as duas lentes relay imagem que o nosso primeiro plano, estacionário telecêntricae (ou seja, o espelho Galvo ressonância) para o nosso segundo plano, estacionário telecêntrica (isto é, o padrão de velocidade Galvo espelho). Para este microscópio especial, as lentes selecionados no primeiro relé têm o mesmo comprimento focal, "f", então a distância entre os dois espelhos em nosso sistema telecêntrica é simplesmente 4f. Para garantir que as lentes são precisamente centrada no caminho do feixe, use o truque de alinhamento da lente. Coloque a primeira lente no caminho do feixe e olhe para o local feixe de laser na íris seguinte no caminho do feixe após a lente. Em seguida, ajuste a altura da lente na vertical para que o centro vertical do feixe está no centro da íris. Finalmente, ajustar a posição horizontal do feixe para o centro do feixe sobre a íris. Realizar este mesmo procedimento para a segunda lente.

2. Criação do espelho de varredura segunda e girando o microscópio

1. Para encontrar a posição exata do avião telecêntrica segundo, ligar o Galvo ressonante parasua digitalização unidade e ligá-lo. Use um cartão de visita branco para acompanhar o feixe de varredura através das duas lentes. Você vai encontrar o avião telecêntrica na distância aproximada de 4f do Galvo de ressonância, onde o feixe de laser aparecerá completamente parado. Marcar esta posição na breadboard.
2. A posição do espelho de varredura padrão Galvo neste local exato telecêntrica avião, e ajustar a altura do espelho e da posição tal que o feixe no plano telecêntrica atinge o centro exato do espelho de varredura. É fundamental ligar o hardware de controle espelho e colocou uma tensão de 0 volts na entrada espelho de digitalização para que o espelho se instala à sua posição neutra durante este processo. Cuidadosamente ajustar o ângulo de espelho para direcionar o feixe verticalmente, e suavemente aperte o espelho na posição.
3. Como estamos construindo um microscópio vertical, agora vamos anexar o breadboard segundo em um ângulo de 90 graus com 90 graus suportes de montagem. Certifique-se de desligaro laser e eletrônica de varredura, desligue a fibra, e desconectar os espelhos de varredura durante este processo. Para fazer o resto do alinhamento mais fácil, uma vez que os suportes são aparafusadas no lugar, gire cuidadosamente todo o microscópio para que o novo breadboard está agora deitado. Use uma pinça para fixar a breadboard para a superfície de trabalho. Agora o restante da configuração anteriormente verticais podem ser facilmente realizadas no breadboard plana.

3. Configurando o scan, tubos e lentes objetivas

Em seguida, vamos configurar o segundo conjunto de lentes relay, formalmente conhecido como o "lente scan" e "lente de tubo". É importante escolher a combinação certa de lentes de modo a alcançar a ampliação correta no foco objetivo e otimizar a resolução da imagem final. Em primeiro lugar, para alcançar a abertura máxima numérica (NA) de qualquer lente objetiva dada, o raio laser atingindo a parte de trás do objectivo deve preencher ovolta de abertura completamente, e somente então a lente objetiva ser capaz de criar o foco mais apertados. Lentes objetivas têm uma gama de tamanhos de abertura para trás, escolheu uma taxa de ampliação lente ligeiramente sobrecarregue a abertura de trás do objetivo selecionado. Segundo, a fim de conseguir a ampliação direita, a lente objetiva deve ser combinado com o comprimento focal da lente do tubo para o qual foi projetado. Infelizmente, os fabricantes objetivo diferente microscópio optou por usar comprimentos de tubo diferentes lente focal, por isso é importante para construir um microscópio com a lente correta para o tubo de lente objetiva específica empregada. Além disso, alguns fabricantes, tais como Zeiss, design suas lentes de tubo para compensar as aberrações cromáticas específicas de seus objetivos combinados, de tal forma que utilizando um par de lente objetiva imprópria tubo de fato introduzir novas aberrações que não de outra forma seriam presentes. Normalmente, preferem objetivos Olympus, como todas as compensações cromática é realizada in the objetivo em si, fazendo com que a lente objetiva / tubo de emparelhamento mais fácil. Embora o microscópio ainda funcionará se o objetivo ea lente do tubo não coincidirem, a ampliação do microscópio real, provavelmente, não coincidir com a ampliação listadas na lente objetiva. Para este particular microscópio construir, o tamanho da abertura ótima volta estava determinado a ser de 4 mm, o que requer uma taxa de ampliação 1:4 entre a lente de digitalização e lente do tubo. Para este microscópio personalizado criar, vamos usar um comprimento de lente de digitalização de 75 mm e um comprimento de tubo de lente de 300 mm.

1. Como a distância total entre o espelho segundo exame e foco objetivo é grande, este segmento do microscópio vai construir primeiro layout os espelhos necessários para dirigir o feixe da lente objetiva. Coloque o primeiro grande, 2 "(50 mm) de diâmetro de espelho perto da borda da breadboard, e gire a montagem de espelho para refletir o feixe de laser de aproximadamente 90 graus. Cerca de ajustar o reflexo do espelho para manter a mesma bea verticaism de altura. Coloque os outros 2 espelho "no limite oposto da breadboard em uma orientação que dirige o feixe para baixo em um ângulo de 90 graus. Use os parafusos de ajuste para garantir a altura vertical da viga não se altera. Configurar duas íris, como no passo 1.4, e ajustar os dois espelhos, conforme indicado no passo 1,5 para o centro do feixe sobre a íris.
2. Com a íris ainda no lugar, colocar a lente de digitalização no caminho do feixe e ajustar sua posição horizontal e vertical ao centro o ponto do laser na íris em primeiro lugar. A uma distância de 75 mm + 300 mm da lente (entre os dois espelhos), coloque cuidadosamente o tubo de lente grande 2 "e ajustar a sua posição horizontal e vertical para o centro do feixe na íris em primeiro lugar. Para fins de manter o alinhamento no futuro, é útil para deixar esses íris no lugar; para esta aplicação, um cartão com um buraco de tamanho apropriado pode ser colado a um stand e inserido no caminho do feixe.
3. Com todos os espelhos e lentesagora no lugar, começar a digitalizar o espelho Galvo ressonante e do espelho de varredura padrão. Nesta compilação, o espelho de varredura padrão acabará por ser sincronizado com a taxa de varredura do espelho ressonante através de um circuito de controle custom-built, tal como descrito na Figura 3, o que fornece sincronização vertical e horizontal superior. No entanto, para fins de alinhamento e muitas aplicações de imagem, o espelho pode ser facilmente escaneados usando um padrão dente de serra a partir de um gerador de função. Usando um cartão de visita, localize o feixe de laser em um milímetro a posição 300 após a lente do tubo. Embora o feixe é a digitalização em outras partes do microscópio em ambas as direções vertical e horizontal, o feixe deve ser perfeitamente parado perto desse local. Este é o lugar onde a abertura para trás da lente objetiva será colocado. Se os planos horizontal e vertical estacionário não coincidem no mesmo plano ao longo do caminho do feixe, cuidadosamente unclamp e traduzir a lente do tubo ao longo do caminho óptico para garantir queambos os planos se sobrepõem, tanto quanto possível. Re centro-posição vertical e horizontal da lente do tubo e apertá-lo firmemente na posição.
4. Coloque a lente objetiva no caminho do feixe, certificando-se de posição da lente objetiva de volta o mais próximo da abertura ao plano estacionária possível. A abertura de volta verdade objetiva não pode realmente ser sempre localizado na abertura traseira física do objetivo devido a escolhas de design variados fabricante. Portanto, é sempre o melhor verificar com o fabricante para determinar a posição de abertura verdadeira para trás.
5. Configure o estágio da amostra, certificando-se que o suporte de tradução que permitirá eixo z movimento pode passar a sua gama completa sem correr para a montagem da lente objetiva.

4. Criação e alinhando o pinhole confocal e detector

1. Desconecte todos os suprimentos de energia e fibra óptica, e girar o conjunto de microscópio de tal forma que mais uma vez se baseia na breadboard segurando a resoespelho de varredura dominante. Prender a breadboard firmemente no lugar, então re-connect a fibra do colimador, e re-conectar os dois cabos galvos e seu controle. Como antes, coloque 0 volts na tensão de controle dirigindo o Galvo padrão de digitalização.
2. No palco da amostra, colocar um cartão de visita ou um pequeno volume de um corante brilhante no foco objetivo, espremido entre dois lamínulas. A escolha da tintura vai depender do laser e dicróicas selecionada, neste caso vamos usar a emissão de fluorescência de um cartão de visita branco para alinhar o sistema de detecção confocal. Pontos quânticos também podem ser úteis para fins de alinhamento, como eles são brilhantes e não photobleach. Outras alternativas incluem partículas fluorescentes e / ou amostras de tecido exposto a cor / lavanderia branqueador, os quais apresentam forte fluorescência. Ligue a fonte de laser e levar a amostra para o foco do microscópio usando a etapa de tradução. Uma vez em foco, a fluorescência gerada a partir da amostra deve ser visível atrás tele espelho dicróico, como descrito na próxima etapa. Maximizar a potência do laser para fazer a fluorescência tão brilhante quanto possível.
3. Usando um cartão de visita, traçar a emissão de fluorescência da amostra através da objectiva e para trás através do sistema de digitalização para o espelho dicróico. O espelho dicróico vai transmitir a emissão de fluorescência, enquanto refletindo o feixe de laser; encontrar este sinal de fluorescência do outro lado do espelho dicróico. Agora, colocar um espelho por trás do espelho dicróico e usá-lo para refletir a emissão em um ângulo de 90 graus. Tome uma íris, como foi feito no passo 1.1, e usá-lo juntamente com o espelho para direcionar o feixe de fluorescência como retos e paralelos ao breadboard possível. Este passo pode ser melhor realizado com pouca luz.
4. Configurar a unidade pinhole confocal, conforme descrito na Figura 2. Descobrimos que o filtro espacial gaiola montagem montagem de ThorLabs é ideal para esta tarefa. É importante escolher um apropriado Pinholtamanho e para garantir que o sistema confocal atinge a sua melhor resolução sem sacrificar sinal muito. Para este microscópio personalizado, um tamanho de 100 mm pinhole foi selecionado. Coloque a unidade espacial do filtro em linha com o caminho do feixe de fluorescência, tendo o cuidado de montar o centro de primeira lente focando o feixe de emissão de fluorescência. Depois de montar uma lente de comprimento focal curto na unidade (uma objetiva de microscópio também pode ser usado), deslize a montagem z-tradução até um foco claro pode ser observado na superfície pinhole. Certifique-se de toda a unidade está orientado ao longo da linha recta exacta definida pelo feixe de fluorescência. Prender o aparelho à breadboard.
   A emissão da maioria das amostras é fraco em comparação com os níveis de luz ambiente, mesmo em quartos escuros. Assim, é fundamental que adequada blindagem / luz desconcertante ser usado ao longo do caminho de emissão para proteger da contaminação luz difusa. Além disso, altos níveis de luz ambiente vai sobrecarga e danos PMTs muitos, especialmente aqueles que não cproteção ACTUAL. Os leitores são, portanto, fortemente instados a usar tubos de lente para colocar o caminho do feixe de emissão, um sistema devidamente blindado, como o demonstrado aqui, é capaz de operar em luz ambiente com pouca ou nenhuma contaminação luz difusa.
5. Agora, usando os botões de ajuste no palco tradução, sistematicamente mover o pinhole confocal para encontrar o ponto onde o sinal de fluorescência através do pinhole é maximizada. Esta posição é mais facilmente identificados através de ajuste iterativo dos dois eixos para realizar uma pesquisa sobre a superfície 2D montagem pinhole. Uma vez que a posição do sinal é encontrado maximizando, coloque a lente colimadora no monte gaiola após o pinhole. Encontre a emissão de fluorescência que atravessa a unidade confocal usando um cartão de visita, e deslize a lente colimadora ao longo do posts até que o sinal de fluorescência emitida é colimada como possível. Uma vez que o feixe é colimado, não se esqueça de colocar o filtro apropriado no caminho do feixe em uma banheira de lentee.
6. Configure o tubo fotomultiplicador montagem (PMT). Coloque uma lente de 50 milímetros comprimento focal no caminho de fluorescência de emissão do feixe e encontrar o seu ponto focal utilizando um cartão de visita. Marcar esta posição na breadboard. Agora, desligue o laser completamente - isto é importante, como a luz do laser dispersos ou unattenuated pode danificar permanentemente a maioria dos PMTs. Posição da PMT de modo que sua área ativa está localizado o mais próximo do ponto marcado focal possível. Conecte o conjunto PMT para a lente de focalização utilizando tubos de lente ajustável, e cuidadosamente enrole fita escura ao redor todos os caminhos viga após a pinhole.
7. Ligue o laser, mas não se esqueça de manter a sua energia extremamente baixo de tal forma que a emissão de fluorescência é pouco visível. Ligue a PMT, a leitura atenta a sua tensão em um osciloscópio como a tensão de controle é maior. A PMT é gerado um sinal através de uma série de estágios de elétrons multiplicando, se a fotocorrente é demasiado elevado para o nível de luz incidente, o tubo pode serPMTs irreversivelmente danificado. circuitos com limitação de corrente são, portanto, altamente recomendável, especialmente para usuários que não tenham trabalhado com detectores do tipo antes.
   Aumentar a tensão de controle PMT até uma leitura spike-like e / ou um deslocamento DC pode ser visto na tela do osciloscópio; para a maioria dos PMTs, este sinal será negativo em relação ao chão. Confirmar que este sinal realmente surge a partir da fluorescência, girando a potência do laser off observar uma perda de sinal.
8. Finalmente, iterativamente alinhar o pinhole para o sinal máximo no osciloscópio pela primeira manipular as lentes com foco z-position, e depois ajustando o estágio tradução yz.
9. O hardware de vídeo microscópio taxa é completa! Agora ligar os espelhos, quadros de controle personalizado, eo computador como diagramado na Figura 3. Como acima, recomenda-se usar o sistema de imagem para a primeira visualizar um padrão de tamanho conhecido para encontrar a melhor resolução do microscópio e calcular o pixelA resolução constante para o sistema de imagem. Existem padrões de tamanho muitos que podem ser utilizadas, tais como cartões de visita branco, com tamanhos bem conhecida carta, alvos força de fluorescência ou reflexiva, ar e microesferas fluorescentes.

5. Preparando o sistema para confocal de varredura microendoscopy

Nesta compilação que usamos uma fibra de imagem coerente, que consiste em um conjunto de muitos milhares de núcleos de fibras; tal arranjo permite que uma imagem a ser transmitida através da fibra e facilmente reconstruídos e / ou ampliados na outra extremidade (Fig. 4). O feixe de fibras coerente utilizados na construção deste endoscópio é polida nas duas extremidades, tornando-se o chamado "contato-mode" microendoscope. Uma imagem em foco, portanto, só será formado quando a ponta microendoscope é trazido em contato com um objeto. Neste arranjo pseudo-confocal, a ação de varredura do microscópio focaliza a laser em uma fIber núcleo de cada vez, enquanto o pinhole confocal assegura que nenhuma luz fora de foco das fibras circundante é permitido passar através do detector. Para aplicações em imagens diferentes, um conjunto de lentes podem ser adicionados na ponta distal para permitir a frente imagens de fluorescência, de longa distância. Microoptic lentes, assim como o índice de refração gradiente (GRIN) lentes podem ser facilmente adaptado para este uso, e pode ser aposta na ponta da fibra distal uso de colas de qualidade óptica.

1. Para configurar o sistema de imagem para microendoscopy, remova cuidadosamente a fase de amostra e substitui-lo com um palco segurando fibra (Fig. 5). Mergulhe uma das extremidades do feixe de fibras em uma solução fraca de tintura para que emissão de fluorescência é gerado uniformemente em todos os núcleos de fibra. Ligue o sistema de digitalização e ajustar o titular de fibra para levar a outra extremidade do feixe de fibras (extremidade proximal, ou o fim mais próximo para a ótica do microscópio) em foco. Primeiro, use tradução ajuste screws para o centro da fibra no campo digitalizado. Agora, olhe para a imagem de emissão de fluorescência da ponta de fibra proximal durante a digitalização. Quando a superfície microendoscope completa está no plano focal da objetiva, a emissão de fluorescência em todos os núcleos de fibra será tão uniforme quanto possível. Use os botões de ajuste para ajustar o ângulo da face de fibra para fazer todos os núcleos de fibras uniformemente brilhante. Durante este ajuste, ele provavelmente vai ser necessário re-ajustar a posição da tradução para o re-centro de fibra no campo digitalizado. Iterar através destes ajustes até que a ponta da fibra inteira é corretamente em foco.
2. Antes de usar o microendoscope, limpe cuidadosamente a ponta distal com papel de limpeza de lentes levemente umedecido com HPLC metanol. Como antes, use um padrão de tamanho conhecido para medir e calcular a resolução do sistema de imagens microendoscope.

6. Resultados representativos:

A Figura 6 mostra um exemplo de uma upr terminoumicroscópio de varredura confocal ight configurado para microendoscopy. Os feixes de laser e emissão ter sido desenhada como um guia para os olhos. A montagem de fibra possui a fibra de imagem no local durante a operação microendoscopy. Esta montagem de fibra pode ser facilmente substituído por um xy ou estágio tradução xyz para uso como uma plataforma de microscópio vertical. ThorLabs partes PT3 (tradução XYZ) ou dois estágios empilhados PT1 (XY tradução) funcionam bem para esta aplicação, juntamente com um suporte em ângulo reto, como parte ThorLabs AP90.

Uma placa de vídeo framegrabber taxa é usada para gerar imagens a partir do sinal de entrada. A Figura 7 mostra uma imagem de teste representativas, extraídas de uma minúscula "m", impresso em um cartão branco usando o sistema de vídeo-microscópio taxa de digitalização. Papel branco branqueada contém fluoróforos que está animado pela luz UV e azul, resultando no fundo brilhante atrás de letra escura "m". Um filtro de emissão centrada em 515 nm foi escolhido para coletar essa emissão fluorescente. A minor distorção da imagem pode ser observado, especialmente perto das bordas laterais da moldura da imagem. Isto resulta distorção do padrão de varredura senoidal do espelho gavlo 8kHz, e será discutido em detalhes abaixo.

Figura 1. Diagrama demonstrando o princípio de funcionamento de um microscópio confocal. Raios provenientes do foco objetivo são transmitidas de volta através do sistema e focalizado através do pinhole confocal (vermelho). Raios provenientes tanto acima (azul) ou abaixo (verde) o foco objetivo não surgem a partir do objetivo colimado e, portanto, não são eficientemente transmitido através do pinhole confocal.

Figura 2. Diagrama mostrando todos os caminhos de luz através do sistema de varredura do feixe. Os espelhos de varredura sentar-se em aviões telecêntrica com o staprecaução, o plano de abertura objetivo de volta. Pares de lentes entre os planos fixos agir para retransmitir as vigas digitalizada. As duas primeiras lentes relay tem igual comprimento focal, formando um telescópio de 1:1. O segundo par de lentes, conhecida formalmente como a lente de digitalização e lente do tubo, não precisam ser iguais em comprimento focal, e muitas vezes servem como um telescópio feixe de expansão para garantir o objectivo de volta de abertura, está sobrecarregada. Luz emitida a partir da amostra viaja de volta através do sistema de digitalização e é transmitida através do espelho dicróico. A lente de foco curto concentra a emissão de luz através do pinhole confocal, que é então colimado por uma lente. A final da lente foca a emissão confocal-filtrada em um tubo fotomultiplicador. Clique aqui para ver uma versão em tamanho normal da imagem.

Figura 3. (A) diagrama Visão Geral da configuração eletrônica de varredura. Sinal do microscópio de referência global e base de tempo é o "sync" saída TTL do jejum espelho eixo Galvo ressonante, o que gera um pulso TTL no final de cada linha de varredura (ie, quando o Galvo completou um ciclo de scan). Este fornece o sinal de H-sync para o cartão framegrabber. A saída do Galvo de sincronização também está ligado à V-sync controle de bordo, que gradualmente aumenta a sua tensão de saída em resposta a cada impulso H-sync para gerar a forma de onda que impulsiona o eixo de varredura lenta. Uma vez que todas as linhas foram digitalizadas, o V-sync bordo redefine a forma de onda dente de serra e gera um pulso TTL que serve como sinal do framegrabber do V-sync. A entrada final para o cartão framegrabber é o sinal analógico a partir do tubo fotomultiplicador (Note que muitos PMTs geram tensão de saída negativa; certifique-se de projetar seu circuito umd escolher o seu hardware em conformidade). As imagens de vídeo-rate são gerados e exibidos no software framegrabber Matrox. (B) Exemplo de circuito de controle. Neste projeto, a tensão de cada pulso H-Sync é "acrescentado" / integrado na integrador ampères op para gerar a forma de onda dente de serra rampa; pulsos são contados concomitantemente na fase contador TTL. Quando o número desejado de linhas foi alcançado (ie, quando a digitalização raster é completa), o contador gera um baixo ativo "realizar" de pulso, que aciona o gatilho Schmitt para gerar um pulso de reset para o integrador. Isso redefine tanto contra como o integrador de amp op, preparando o circuito para o próximo ciclo. Escolha componente apropriado torna este circuito amplamente aplicável a uma variedade de tamanhos de varredura. Esta é apenas uma implementação; inúmeras outras implementações são possíveis e podem ser preferidos sob certas circunstâncias. Além disso, este circuito é projetado para uso com cartão de Matrox framegrabbers, que detecta e corrige fase de imagem automaticamente. Se o circuito é para ser usado com Framegrabbers outro, circuito fase de correção ou software pode ser necessária. Clique aqui para ver uma versão em tamanho normal da imagem.

Figura de transmissão de imagem 4. Através de um feixe de fibras coerente. Neste esquema, as lentes de ambos os lados do pacote estão no local para dimensionar tanto a imagem projetada na entrada de feixe de fibras, bem como expandir a imagem na saída de feixe de fibras.

Figura 5. Exemplo de um feixe de fibras montado em uma montagem de 5 eixos. Um pequeno um "bloco de alumínio de diâmetro estava entediado de modo que o feixe de fibras imagem poderia ser inserido. A fibra foi epoxied dentro do bloco de alumínio em both superior e inferior do bloco para a estabilidade.

Figura 6. Imagem do sistema de microscopia completado com a microendoscope anexado. Para visualizar melhor os caminhos de luz, o caminho do feixe de excitação é desenhado em azul, enquanto o caminho do feixe de emissão após o espelho dicróico é desenhada como uma linha vermelha.

Figura 7. Exemplo de imagem gerados pelo sistema de microscopia confocal de vídeo de taxa de digitalização. Um escuro letra minúscula "m" aparece no fundo brilhante fluorescência de um cartão de visita branco.

Discussion

Este sistema de imagem de vídeo-rate faz uso de um espelho ressonante galvanométricos operacional em cerca de 8 kHz. Espelhos de ressonância pode ser bastante alto quando trabalhar a plena potência, e seu tom alto pode ser incômodo ou até mesmo perigoso em tempos de exposição suficiente. Apesar de não demonstrado aqui, é recomendado para proteger o espelho ressonante galvanométricos dentro de uma caixa transparente de reduzir significativamente o volume do sistema e / ou para usar equipamentos adequados de proteção auditiva, como tampões de ouvido.

O espelho de ressonância galvanométricos scans em um padrão sinusoidal. No entanto, os cartões framegrabber lido em sinal assumindo uma velocidade de varredura completamente linear em ambas as direções horizontal e vertical. Desde uma varredura senoidal desacelera nas bordas da digitalização, os artefatos de compressão de imagem pode ser observada ao longo do eixo de imagem rápido (horizontal). Uma forma de minimizar este problema é propositadamente conduzir o ressonante Galvo faixa de varredura espelho significativamente maior do que odiâmetro da lente relay. Ao fazer isso, apenas varrer o quase linear central do padrão de leitura sinusoidal irá percorrer a amostra, minimizando distorções de imagem. Outra abordagem seria de pós-processamento de imagens coletadas para linearizar o eixo rápido. Isso pode ser feito por imagem um padrão conhecido fluorescentes (como uma grade) e usando as dimensões padrão conhecido para criar um script de processamento que unwarps as imagens coletadas.

Este sistema de digitalização especial foi projetado com a finalidade de imagem in vivo, que muitas vezes exige uma posição vertical orientada microscópio de vídeo-rate. Para experimentos com imagens de celular, microscópios invertidos são mais tipicamente usado. O projeto aqui apresentado pode ser facilmente alterada para construir tal um microscópio invertido, tudo que é necessário é uma rotação da final espelho de diâmetro 2 ". Em vez de orientar o espelho para direcionar o feixe de varredura para baixo, o espelho pode direcionar o feixe para cima. Colocar a lente objetiva umat a mesma distância do espelho, juntamente com um estágio de amostra permitiria imagem em uma geometria invertida. Se o sistema de imagem está sendo construída unicamente para imagens microendoscópica, não há razão para "dobrar" o projeto microscópio verticalmente em tudo. Em vez disso, o sistema de digitalização inteira pode ser construída sobre uma placa de montagem horizontal único com o paralelo lente objetiva orientada para a mesa óptica.

Note-se que o microscópio nesta compilação usa uma configuração fixa pinhole, enquanto este prevê a maior simplicidade e facilidade de construir o alinhamento, os usuários que desejam um sistema mais versátil pode considerar a incorporação de uma pinhole variável, como pode ser encontrado na maioria dos comerciais microscópios confocal. Ao permitir que o usuário ajuste o tamanho da pinhole para compensar as amostras de diferentes intensidade de emissão, isto permite que o usuário para melhor otimizar o equilíbrio entre a força do sinal ea resolução de uma dada amostra.

O choice de fibra de imagem selecionada para o microscópio é importante. Recomendamos o uso de fibras imagem Sumitomo coerente devido ao seu afastamento do núcleo de fibra perto e autofluorescência relativamente baixo. Fibras de imagem fabricado pela Fujikura foram encontrados para ter grandes quantidades de autofluorescência ^10, que pode sobrecarregar fracos sinais de fluorescência de uma amostra e limitar a sensibilidade final do microendoscope. Sumitomo fibras fabricadas, como o 8-30N utilizado nesta configuração particular, têm muito mais baixos níveis de autofluorescência do que seus equivalentes Fujikura. Enquanto feixes de fibras leeched pode ser considerado atraente para microendoscopy, o seu design tipicamente lugares núcleos de fibra individuais muito longe, o que significa que os núcleos de fibra objetos pouco de amostra, deixando de fora as regiões significativas de interesse potencial.

Finalmente, deve-se notar que, enquanto o microscópio descrito aqui será útil em uma variedade de in vitro e in vivo applications e pode ser criado por uma fração do custo de um sistema full-featured comercial, ele não tem recursos como detecção de luz transmitida, uma ocular para a visão, ou um caminho do feixe para não-confocal campo amplo de epifluorescência. Embora seja possível construir um sistema com estas características a partir do zero, os leitores que desejam um sistema deste tipo pode desejar modificar um sistema comercial existente para atender suas necessidades ao invés de dar início a uma inteiramente nova construção.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
515 nm Band Pass Filter	Chroma Technology Corp.	HQ515/50M	46 FWHM
Achromatic Doublet Lens 25.4mm Dia. x 50mm FL, MgF2 Coating	Edmund Scientific	NT49-766
Achromatic Doublet Lens 25.4mm Dia. x 76.2mm FL, MgF2 Coating	Edmund Scientific	NT49-768
Achromatic Doublet Lens 25.4mm Dia. x 88.9mm FL, MgF2 Coating	Edmund Scientific	NT49-769
Achromatic Doublet Lens 50mm Dia. x 300mm FL, MgF2 Coating	Edmund Scientific	NT45-179
8 kHz R High Frequency Optical Scanner	Electro-Optical Products Corporation (EOPC)	SC-30	8 kHz
AGC Driver	Electro-Optical Products Corporation (EOPC)	ACG:8K
H7422-PA Photosensor Module	Hamamatsu Corp.	H7422-PA	Current limiting recommended
M9012 Power Supply	Hamamatsu Corp.	M9012	For use with H7422-PA
HC PL APO CS Objective	Leica Microsystems	11506284	10x/0.40
Solios eA/XA Framegrabber Card	Matrox	Solios eA/XA	MIL software required; –M interconnects recommended
12V Power Supply	Meanwell	LPV-100-12	+12V, 8.5A
5x Microscope Objective Lens	Newport Corp.	M-5X	0.10 NA, 25.4 mm Focal Length
Coherent Image Fiber	Sumitomo Bakelite Co., Ltd.	8-30N
1/4"-20 Cap Screw and Hardware Kit	Thorlabs Inc.	HW-KIT2
100 μm Mounted Pinhole	Thorlabs Inc.	P100S	Ideal for building spatial filters
30 mm Cage Cube Clamp	Thorlabs Inc.	B6C
30 mm Cage System Cube, 4-Way	Thorlabs Inc.	C4W
406 nm, 5 mW, B Pin Code, SM Fiber Pigtailed Laser Diode, FC/PC	Thorlabs Inc.	LPS-406-FC	Product obsolete; replaced by LP405-SF10
5-Minute Epoxy, 1 Ounce	Thorlabs Inc.	G14250
6 Axis Kinematic Optic Mount	Thorlabs Inc.	K6X
8-32 Cap Screw and Hardware Kit	Thorlabs Inc.	HW-KIT1
8-32 Setscrew and Hardware Kit	Thorlabs Inc.	HW-KIT3
Adapter with External RMS Threads and Internal SM1 Threads	Thorlabs Inc.	SM1A4
Adj. FC/PC and FC/APC Collimator, f = 2.0 mm, ARC: 400-600 nm	Thorlabs Inc.	CFC-2X-A	f = 2.0 mm
Adjustable Fiber Collimator Adapter, SM1 Threaded	Thorlabs Inc.	AD9.5F
Aluminum Breadboard, 12" x 18" x 1/2"	Thorlabs Inc.	MB1218	1/4"-20 Threaded
Benchtop Laser Diode/TEC Controller	Thorlabs Inc.	ITC4001	1 A/96 W
DMLP 425 nm Long-Pass Dichroic Mirror	Thorlabs Inc.	DMLP425
Kinematic Mount for 1" Optics	Thorlabs Inc.	KM100
LD/TEC Mount for ThorLabs Fiber-Pigtailed Laser Diodes	Thorlabs Inc.	LM9LP
Lens Mount for 18 mm Optics	Thorlabs Inc.	LMR18	One retaining ring included
Lens Mounts for 2" Optics	Thorlabs Inc.	LMR2S	With internal and external threading; retainer ring included
Mini Series Cage Assembly Rod, 6" Long, 4 mm, Qty. 1	Thorlabs Inc.	SR6
1.0" Pedestal Pillar Post, 8-32 Taps, 1" Long	Thorlabs Inc.	RS1P8E
1" Pillar Post Extension, Length=0.5	Thorlabs Inc.	RS05
1" Pillar Post Extension, Length=0.75"	Thorlabs Inc.	RS075
1" Protected Silver Mirror, 3.2 mm Thick	Thorlabs Inc.	ME1-P01
1" SM1 Rotating Adjustable Focusing Element, L = 1"	Thorlabs Inc.	SM1V10
2" Protected Silver Mirror, 3.2 mm Thick	Thorlabs Inc.	ME2-P01
P100S - 100 μm Mounted Pinhole	Thorlabs Inc.	P100S
Polaris Low Drift 1" Kinematic Mirror Mount	Thorlabs Inc.	POLARIS-K1	Low drift
SM1 Lens Tube, L = 1"	Thorlabs Inc.	SM1L-10	One retaining ring included
SM1 Threaded 30 mm Cage Plate, 0.35" Thick	Thorlabs Inc.	CP02
SM1 to M25 Optical Component Threading Adaptor	Thorlabs Inc.	SM1A24	External SM1 Threads and Internal M25.5x0.5 Threads
Small Beam Diameter Galvo System	Thorlabs Inc.	GVSM001
Small Clamping Fork	Thorlabs Inc.	CF125	1/25" counterbored slot, universal
Spatial Filter System	Thorlabs Inc.	KT310	Pinhole sold separately
TE-Cooled Mount for 5.6 & 9 mm Lasers	Thorlabs Inc.	TCLDM9
Vertical Bracket for Breadboards	Thorlabs Inc.	VB01	Each
Plan-Apochromat	Carl Zeiss, Inc.	1101-957	20x/0.75 NA