Summary
La construcción completa de una costumbre, en tiempo real, sistema de microscopía confocal de exploración se describe. Este sistema, que puede ser fácilmente utilizada para microscopía de vídeo de tipo y microendoscopy, permite una gran variedad de geometrías de imágenes y aplicaciones que no son accesibles con los sistemas estándar confocal comercial, a una fracción del costo.
Abstract
La microscopía confocal se ha convertido en una herramienta indispensable en la biología y las ciencias biomédicas, lo que permite una rápida y de alta sensibilidad y alta resolución de seccionamiento óptico de los sistemas complejos. La microscopía confocal se utiliza habitualmente, por ejemplo, para estudiar los objetivos específicos celulares 1, la dinámica del monitor en las células vivas 2-4, y visualizar la evolución en tres dimensiones de organismos enteros 5,6. Extensiones de los sistemas de visualización de imagen confocal, como microendoscopes confocal, permite imágenes de alta resolución en vivo 7 y actualmente se aplican a las imágenes de enfermedades y diagnóstico en la práctica clínica 8,9.
La microscopía confocal ofrece en tres dimensiones resolución mediante la creación de las llamadas "secciones ópticas" utilizando sencilla óptica geométrica. En una norma de amplio campo del microscopio de fluorescencia generada a partir de una muestra es recogida por una lente objetivo y transmitida directamente a un detector. Mientras que aceptarpoder de las muestras de imágenes finas, las muestras de espesor desdibujado por fluorescencia generada por encima y por debajo del plano focal del objetivo. En contraste, la microscopía confocal permite el corte virtual, ópticas de las muestras, el rechazo fuera del foco de luz para construir de alta resolución representaciones tridimensionales de las muestras.
Microscopios confocal lograr esta hazaña con una apertura confocal en la trayectoria del haz de detección. La fluorescencia de una muestra recogida por el objetivo se retransmiten a través de los espejos de exploración ya través del espejo primario dicroicas, un espejo cuidadosamente seleccionados para reflejar longitudes de onda cortas, como el haz de excitación láser al pasar el tiempo, Stokes-cambió de emisión de fluorescencia. Esta señal de fluorescencia de onda larga se pasa a un par de lentes a cada lado de un agujero de alfiler que se coloca en un plano exactamente conjugado con el plano focal de la lente del objetivo. Fotones recogidos en el volumen focal del objeto son colimadospor el objetivo y se centran en las lentes confocal a través del agujero. Fluorescencia generada por encima o por debajo del plano focal por lo tanto no se colimado correctamente, y no pasará a través del agujero de alfiler un confocal, la creación de una sección de óptica en la que sólo la luz del foco microscopio es visible. (Fig. 1). Así, el agujero de alfiler actúa efectivamente como una apertura virtual en el plano focal, limitando la emisión detectada a una sola ubicación espacial limitada.
Modernos microscopios confocal comerciales ofrecen a los usuarios un funcionamiento totalmente automático, los procedimientos de toma de imágenes antes complejo relativamente sencillo y accesible. A pesar de la flexibilidad y potencia de estos sistemas, comercial microscopios confocal no son adecuados para todas las tareas de visualización de imagen confocal, como muchas aplicaciones de imagen en vivo. Sin la capacidad de crear imágenes de sistemas a medida para satisfacer sus necesidades, experiencias importantes pueden permanecer fuera de las reaccionesh para muchos científicos.
En este artículo se proporciona un método paso a paso para la construcción completa de una costumbre, video sistema de tipo de imagen confocal de componentes básicos. El microscopio vertical se construye con un espejo de galvanómetros de resonancia para proporcionar el eje de barrido rápido, mientras que una velocidad estándar de resonancia espejo galvanométrico analizará el eje lento. Para crear un haz de escaneado preciso en el enfoque de la lente objetivo, estos espejos se colocará en los planos telecéntrico llamada con cuatro lentes de relé. Detección confocal se realiza mediante una norma, fuera de la plataforma de tubos fotomultiplicadores (PMT), y las imágenes se capturan y se muestran usando una tarjeta digitalizadora Matrox y el software incluido.
Protocol
La elección de láser de longitud de onda, espejo dicroico, y filtros de luz debe ser determinado sobre la base de los tintes específicos que se utilizan en el experimento. Por ejemplo, la imagen confocal de una muestra teñida con Alexa Fluor 488 se logra mejor utilizando un láser de 488 nm, 500 nm un largo pase espejo dicroico, y un ancho de banda de 30 nm de paso de banda centrado en el espejo de 515 nm. En contraste, la imagen confocal del colorante rojo Alexa Fluor 647 requeriría un conjunto diferente de componentes. El microscopio de este protocolo fue diseñado para visualizar cualquier tinte que absorbe fuertemente a 400 nm y emite más allá de 450 nm. Por lo tanto, eligió un láser de 406 nm de excitación y 425 nm de largo-pass dicroicos para reflejar el rayo láser. Fluoróforos excitados pueden ser selectivamente imaginado por la selección de los filtros de emisión apropiados. Es importante el uso adecuado del hardware de montaje óptico en todo el protocolo que se indique; hardware inadecuado o expediente no dará la alineación, así y puede ser un peligro para la seguridad.
<p class = "jove_title"> 1. Configuración del espejo resonante galvanómetros y la óptica del reléUn concepto importante en la construcción de cualquier tipo de sistema confocal de barrido es telecentricidad. En un sistema óptico telecéntrico, lentes están separadas entre sí por la suma de sus distancias focales, de tal manera que la ampliación del sistema se define simplemente por la relación de las longitudes focales 1. Esto permite la construcción de un sistema de transmisión óptica, donde los aumentos, y por lo tanto las propiedades del sistema, son fáciles de definir por la elección de los lentes. Otro concepto importante consiste en los llamados "estacionarios" planos ópticos, también conocidos como "aviones de apertura". Un avión de la apertura es una posición a lo largo del camino óptico del rayo de luz que no sufre ningún tipo de movimiento lateral. En este diseño del microscopio, hay tres planos de apertura importante: los espejos de primera y segunda exploración, y la apertura posterior de la lente del objetivo. Con el fin de lograr un óptimo sca rayonning en el plano focal del objetivo, el haz de entrar en la abertura posterior de la lente objetivo debe ser estacionaria, barriendo únicamente en ángulo. Con el fin de crear esta parado, el ángulo de barrido por avión, tenemos que colocar los espejos primero y segundo de exploración en el conjugado, aviones telecéntrico con el objetivo posterior de apertura. Lentes colocados entre los espejos y las lentes del objetivo servir para transmitir el haz de ángulo escaneados entre estos planos fijos (Fig. 2). Los espejos de exploración se montan en dos galvos de exploración, cada uno de ellos es responsable de escanear una dirección dada, de la plano de la imagen (X e Y). Para obtener la tasa de línea de exploración necesarios para obtener imágenes de video-tasa, un galvo de resonancia de alta frecuencia es necesario para escanear el eje X (también conocido como el "rápido" eje). Estos galvos utilizar una sensibilidad, de circuito cerrado circuito de retroalimentación para crear un patrón de lectura sinusoidal y son capaces de operar a frecuencias muy altas, hemos seleccionado una galvo 8 kHz para esta construcción.
- Establecerel colimador de fibra óptica en el monte y cerca de dirigir el haz uso de los tornillos de ajuste de tal manera que se desplaza en línea recta, tanto horizontal como verticalmente. Ahora, tome un iris y lo coloca en frente del colimador de fibra, el ajuste de la altura vertical del iris es tal que el haz pasa limpiamente por el centro del iris. A continuación, mover el iris lejos del colimador a lo largo de la trayectoria del rayo y observar si el rayo sigue viajando por el centro del iris. Si no es así, ajuste la posición del haz en el iris con los dos tornillos de ajuste.
- Coloque el espejo dicroico montado en la trayectoria del haz con el rayo láser situado aproximadamente en el centro del espejo. Antes de pinzar el espejo de la tabla, gire el soporte del espejo para reflejar el haz de aproximadamente 90 grados y más o menos ajustar la reflexión para que la altura vertical del rayo láser reflejado no cambia.
- Coloque un espejo montado en resonancia galvanométrico en la trayectoria del haz láser, teniendo cochee para asegurarse de que el rayo láser se coloca exactamente en el centro horizontal de la superficie del espejo. En este protocolo, la resonancia espejo galvo se expoxied directamente a la montura del espejo. Gire la montura del espejo para reflejar el rayo láser en un ángulo de 90 grados. Más o menos ajustar el reflejo en el espejo para mantener la altura del rayo láser misma vertical.
- Con el fin de dirigir a cualquier rayo de luz en una dirección dada, se debe, por definición, se definen dos puntos en el espacio a través del cual los rayos de viaje. Esto se realiza generalmente mediante la colocación de dos iris a lo largo de la trayectoria deseada horizontal y vertical y la manipulación del rayo láser para pasar por el centro de cada iris. Cuatro grados de libertad son necesarias para ajustar el haz, dos grados en horizontal y vertical de la libertad de cada iris. La forma más común y sencillo para lograr estos grados de libertad es el uso de dos espejos para dirigir, o "caminar", un rayo láser.
Tome dos lirios, y establecer su altura verticalen el paso 1.1, utilizando el rayo láser se reflejaba en el espejo resonante galvo como referencia. Ahora, utilizando los orificios de la mesa óptica como una guía para el ojo, abrazadera de los dos iris en una línea recta. - Ajuste el espejo y el espejo dicroico galvo resonancia para dirigir el rayo láser a través del centro de los dos iris. Use el espejo por primera vez en el camino (el espejo dicroico) al centro de la viga en el iris, luego use el segundo espejo en el camino (la resonancia espejo galvo) al centro de la viga en el iris segundos. Iterativamente ajustar estos dos espejos hasta que el haz está alineado a través de ambos iris, asegurando en todo que el rayo láser reflejado desde el espejo resonante galvo todavía se refleja desde el centro del espejo aproximados. Si el haz se ha desviado, ajustar el montaje de fibra colimador y repita los pasos iterativos anteriores.
- Con el rayo centrado en ambos iris, ahora vamos a colocar las dos lentes de relé que será la imagen de nuestro primer plan fijo, telecéntricoe (es decir, la resonancia espejo galvo) en nuestro segundo plano fijo, telecéntrico (es decir, la velocidad estándar galvo espejo). Para este microscopio particular, las lentes seleccionados en el primer relevo tienen la misma longitud focal, "f", de modo que la distancia entre los dos espejos de nuestro sistema telecéntrico es simplemente 4f. Para asegurarse de que las lentes son precisamente centrado en la trayectoria del haz, usar el truco de alineación de la lente. Coloque el lente por primera vez en la trayectoria del haz y mirar el haz de luz láser en la siguiente en la trayectoria del haz del iris después de la lente. A continuación, ajuste la altura de la lente vertical, de modo que el centro vertical de la viga está en el centro del iris. Finalmente, ajuste la posición del haz horizontal al centro de la viga en el iris. Llevar a cabo este mismo procedimiento para la segunda lente.
2. Configuración del espejo de escaneado segundo y girando el microscopio
- Para encontrar la posición exacta del avión telecéntrico segundo, conectar el galvo resonanteescaneo de la unidad y vuelva a encenderlo. Utilice una tarjeta de visita blanca para seguir el haz de exploración a través de las dos lentes. Se encuentra el plano telecéntrico en la distancia aproximada del 4f de la resonancia galvo, donde el rayo láser aparece completamente inmóvil. Marque esta posición en la placa.
- La posición de la exploración estándar espejo galvo en este lugar plano telecéntrico exacta, y ajustar la altura del espejo y la posición de tal manera que la viga en el plano telecéntrico golpea el centro exacto del espejo de escaneado. Es fundamental que el poder del hardware de control de espejo y poner una tensión de 0 voltios en la entrada de espejo de escaneado para que el espejo se asienta en su posición neutral durante este proceso. Con cuidado, ajustar el ángulo de espejo para dirigir el haz verticalmente, y suavemente apriete el espejo en su posición.
- Como estamos construyendo un microscopio vertical, ahora vamos a colocar la placa segundo en un ángulo de 90 grados con 90 grados de soportes de montaje. Asegúrese de apagarel láser y la electrónica de barrido, desconectar la fibra, y desconecte los espejos de exploración durante este proceso. Para hacer que el resto de la alineación más fácil, una vez que los soportes se atornillan en su lugar, gire con cuidado el microscopio todo lo que la nueva placa está acostado. Use una abrazadera para fijar la placa a la superficie de trabajo. Ahora el resto de la configuración antes vertical puede ser fácilmente llevado a cabo en la placa plana.
3. Configuración de la exploración, el tubo, y las lentes de objetivo
A continuación se pondrá en marcha el segundo juego de lentes de relevo, formalmente conocido como el "lente de exploración" y "lente de tubo". Es importante elegir la combinación adecuada de lentes a fin de lograr la ampliación correcta en el enfoque objetivo y optimizar la resolución de la imagen final. En primer lugar, para lograr la máxima apertura numérica (NA) de cualquier lente de objetivo determinado, el rayo láser golpear la parte trasera del objetivo debe llenar elapertura de nuevo por completo, sólo entonces la lente del objetivo ser capaz de crear el foco más ajustado. Lentes del objetivo con una gama de tamaños de abertura atrás, eligió una relación de ampliación del objetivo llenar de un poco de la apertura posterior del objetivo seleccionado. En segundo lugar, a fin de lograr la ampliación del derecho, la lente del objetivo debe corresponderse con la longitud focal del tubo para el cual fue diseñado. Desafortunadamente, diferentes fabricantes objetivo de microscopio han optado por utilizar diferentes longitudes focal del tubo, lo que es importante para construir un microscopio con el lente del tubo correcto para la lente del objetivo específico empleado. Además, algunos fabricantes, como Zeiss, el diseño de sus lentes de tubo para compensar las aberraciones cromáticas específicas de su objetivo coincide, de manera que con un objetivo inadecuado del tubo par de lentes, de hecho, introducir nuevas aberraciones que de otro modo no estaría presente. Por lo general prefieren los objetivos de Olympus, como toda compensación cromática se realiza en thobjetivo e sí mismo, haciendo que el lente del objetivo / tubo de emparejamiento más fácil. Aunque el microscopio seguirá funcionando si el objetivo y la lente del tubo no coinciden, el microscopio óptico real es probable que no coincida con el aumento que aparece en la lente del objetivo. Para este microscopio especialmente la construcción, el tamaño óptimo de apertura de nuevo estaba decidido a ser de 4 mm, lo que requiere una relación de magnificación 1:4 entre la lente de escaneado y la lente del tubo. Para este microscopio de generación personalizada, vamos a utilizar una lente de distancia de barrido de 75 mm y una longitud de tubo de la lente de 300 mm.
- Como la distancia total entre el espejo segunda exploración y el enfoque objetivo es grande, este segmento de la construcción se microscopio primer diseño de los espejos necesarios para dirigir el haz de la lente del objetivo. Coloque los 2 primeros grandes "(50 mm) de diámetro espejo cerca del borde de la placa, y girar la montura del espejo para reflejar el rayo láser de aproximadamente 90 grados. Más o menos ajustar el reflejo en el espejo para mantener la misma vertical beam de altura. Coloque los otros dos "espejo en el borde opuesto de la placa en una orientación que dirige el haz hacia abajo en un ángulo de 90 grados. Use los tornillos de ajuste para asegurar la altura vertical del haz no cambia. La creación de dos lirios, como en el paso 1.4, y ajustar los dos espejos como se indica en el paso de 1,5 a centro de la viga en el iris.
- Con el iris todavía en su lugar, coloque la lente de análisis en la trayectoria del haz y ajustar su posición horizontal y vertical al centro del punto láser en el iris en primer lugar. A una distancia de 75 mm + 300 mm de la lente (entre los dos espejos), coloque cuidadosamente el de 2 "tubo de la lente y ajustar su posición horizontal y vertical al centro de la viga en el iris en primer lugar. A los efectos de mantener la alineación en el futuro, es útil dejar estos lirios en su lugar, para esta aplicación, una tarjeta de visita con un agujero del tamaño adecuado podría ser pegado a un soporte y se inserta en la trayectoria del haz.
- Con todos los espejos y lentesahora en su lugar, comenzar a escanear el espejo resonante galvo y el espejo de escaneado estándar. En esta versión, el espejo de escaneo estándar en última instancia, será sincronizado con la velocidad de barrido del espejo de resonancia a través de un circuito de control a medida, tales como los descritos en la Figura 3, lo que proporciona una sincronización superior, vertical y horizontal. Sin embargo, para la alineación y muchas aplicaciones de imagen, el espejo puede ser escaneado usando un patrón de diente de sierra de un generador de funciones. Usando una tarjeta de visita, busque el rayo láser en una posición de 300 mm después de la lente del tubo. A pesar de la viga es de exploración en otras partes del microscopio en las direcciones vertical y horizontal, el rayo debe estar perfectamente inmóvil cerca de este lugar. Aquí es donde la abertura trasera de la lente del objetivo se colocarán. Si los planos fijos horizontales y verticales no coincidan en el mismo plano a lo largo de la trayectoria del haz, con cuidado despinzar y traducir el lente del tubo a lo largo del camino óptico para asegurarse de queambos planos se superponen en la mayor medida posible. Volver a centrar la posición vertical y horizontal de la lente del tubo y la abrazadera de forma segura en su posición.
- Coloque el lente objetivo en la trayectoria del haz, asegurándose de que la posición de la lente del objetivo posterior apertura lo más cercano al plano fijo como sea posible. El objetivo de apertura de nuevo verdadera en realidad no puede estar siempre situado en la pequeña apertura física del objetivo debido a las diferentes opciones de diseño del fabricante. Por tanto, es siempre el mejor consultar con el fabricante para determinar la posición de la espalda de apertura real.
- Montar el escenario de la muestra, asegurándose de que el soporte de traducción que permita el movimiento del eje Z se puede mover en todo su rango sin caer en la montura del objetivo objetivo.
4. La creación y la alineación de la pinhole confocal y el detector
- Desconecte todos los suministros de energía y fibra óptica, y gire el montaje microscopio de tal manera que de nuevo se basa en la placa la celebración de la resonanciaespejo dominante de exploración. Fije la placa en su lugar, vuelva a conectar la fibra al colimador, y vuelva a conectar tanto galvos y sus cables de control. Como antes, el lugar 0 voltios de la tensión de control de la conducción de la galvo estándar de exploración.
- En el escenario de la muestra, coloque una tarjeta de visita o un pequeño volumen de un tinte brillante en el enfoque objetivo, intercalada entre dos cubreobjetos. La elección del medio de contraste dependerá del láser y dicroicas seleccionado, en este caso vamos a utilizar la emisión de fluorescencia de una tarjeta de visita blanco para alinear el sistema de detección confocal. Los puntos cuánticos también pueden ser útiles para la alineación, ya que son brillantes y no photobleach. Otras alternativas incluyen perlas fluorescentes y / o muestras de tejidos expuestos a abrillantador color / ropa, tanto de los que presentan fluorescencia brillante. Encienda la fuente de láser y poner la muestra en el centro microscopio utilizando la etapa de traducción. Una vez en el foco, la fluorescencia generada a partir de la muestra debe ser visible detrás de tél espejo dicroico, como se describe en el siguiente paso. Maximizar la potencia del láser para hacer la fluorescencia tan brillante como sea posible.
- Usando una tarjeta de visita, rastrear la emisión de fluorescencia de la muestra a través de la lente del objetivo y de vuelta a través del sistema de escaneo para el espejo dicroico. El espejo dicroico transmite la emisión de fluorescencia, mientras que refleja el rayo láser; encontrar esta señal de fluorescencia en el otro lado del espejo dicroico. Ahora, coloque un espejo detrás del espejo dicroico y lo utilizan para reflejar la emisión en un ángulo de 90 grados. Tome un iris, como se hizo en el paso 1.1, y lo utilizan junto con el espejo para dirigir el haz de fluorescencia tan recta y paralela a la placa como sea posible. Este paso puede ser el mejor llevado a cabo con poca luz.
- Configurar la unidad pinhole confocal, tal como se describe en la figura 2. Hemos encontrado que la distribución espacial de filtro de caja de montaje de montaje de Thorlabs es ideal para esta tarea. Es importante seleccionar una adecuada pinholtamaño e para asegurar que el sistema confocal llega a su resolución óptima sin sacrificar demasiada señal. Para este microscopio personalizado, un tamaño de agujero de 100 micras fue elegido. Coloque la unidad espacial de filtro en línea con la trayectoria del haz de fluorescencia, teniendo cuidado de centro el primer montaje de lentes de enfoque sobre la haz de emisión de fluorescencia. Después de montar una lente de distancia focal corta en la unidad (un objetivo de microscopio también se puede utilizar), deslice el montaje z-traducción hasta que un objetivo claro se puede observar en la superficie del agujero de alfiler. Asegúrese de que toda la unidad se orienta a lo largo de la línea recta exacta fijada por el haz de fluorescencia. Fije la unidad a la placa.
La emisión de la mayoría de las muestras es débil en comparación con los niveles ambientales de luz, incluso en habitaciones oscuras. Por tanto, es crucial que una protección adecuada / luz desconcertante ser utilizado a lo largo de la trayectoria de las emisiones para proteger de la contaminación de la luz parásita. Además, los altos niveles de luz ambiental PMT sobrecarga y daño muchos, sobre todo aquellos que no cprotección ACTUAL. Los lectores son por lo tanto, sugiere la utilización de lentes tubos para encerrar el paso del haz de emisión, un sistema blindado, como el que se ha demostrado aquí, es capaz de funcionar en la luz de la habitación con poca o ninguna contaminación de la luz parásita. - Ahora, utilizando los botones de ajuste en la etapa de traducción, de manera sistemática mover el agujero confocal para encontrar el punto donde se maximiza la señal de fluorescencia a través del agujero. Esta posición es más fácilmente identificable a través de ajuste iterativo de los dos ejes para realizar una búsqueda en 2D sobre la superficie de montaje del agujero de alfiler. Una vez que la posición de la señal máximo se encuentra, el lugar de la lente de colimación en la jaula después de montar el agujero. Buscar la emisión de fluorescencia que pasa por la unidad de confocal utilizando una tarjeta de visita, y deslice la lente de colimación a lo largo de los mensajes hasta que la señal de fluorescencia emitida es colimado posible. Una vez que el haz es colimado, asegúrese de colocar el filtro adecuado en la trayectoria del haz en una tina de lentee.
- Configure el tubo fotomultiplicador (PMT) de la Asamblea. Colocar una lente de 50 mm de distancia focal en el camino del haz de emisión de fluorescencia y encontrar su punto focal usando una tarjeta de visita. Marque esta posición en la placa. Ahora, apague el láser completamente - esto es importante, como la luz del láser perdida o atenuados puede dañar permanentemente la mayoría de los PMT. La posición de la PMT, para que su área activa se encuentra tan cerca del punto focal marcada como sea posible. Conecte el conjunto PMT para la lente de enfoque ajustable con tubos de lente, y con cuidado envuelva cinta oscura en torno a todas las trayectorias de rayos expuestos tras el agujero de alfiler.
- Encienda el láser, pero asegúrese de mantener su energía extremadamente bajo de tal manera que la emisión de fluorescencia es apenas visible. A su vez en el PMT, leer cuidadosamente su voltaje en un osciloscopio como la tensión de control es mayor. Un PMT genera una señal a través de una serie de etapas de multiplicación de electrones, si la fotocorriente es demasiado alto para el nivel de luz incidente, el tubo puede serPMT daños irreversibles. con un circuito limitador de corriente, por lo tanto muy recomendable, especialmente para los usuarios que no han trabajado con estos detectores antes.
Aumento de la tensión de control PMT hasta una lectura de punta-como y / o un desplazamiento DC se puede ver en la pantalla del osciloscopio, para la mayoría de PMT, esta señal será negativo con relación al suelo. Confirme que la señal de hecho surge de la fluorescencia por convertir la potencia del láser de observar una pérdida de señal. - Por último, iterativa alinear el ojo de aguja para la máxima señal en el osciloscopio, en primer lugar la manipulación de la lente de enfoque z-posición, y luego ajustando la etapa de traducción yz.
- El hardware de vídeo-microscopio tasa está completo! Ahora conectar los espejos, tableros de control personalizados, y el ordenador como se esquematiza en la figura 3. Como el anterior, se recomienda utilizar el sistema de imagen para visualizar primero un tamaño estándar conocidos para encontrar la mejor resolución del microscopio y calcular el pixelA la resolución constante para el sistema de imágenes. Hay muchos estándares de tamaño que pueden ser utilizados, tales como tarjetas de visita blanco con un tamaño de letra conocida, blancos aéreos de fluorescencia o de reflejo la fuerza, y microesferas fluorescentes.
5. Preparación del sistema para confocal de exploración microendoscopy
En esta construcción se utiliza una fibra de imagen coherente, que consiste en un paquete de muchos miles de núcleos de fibra, como el arreglo permite a una imagen que se transmite a través de la fibra y fácil reconstrucción y / o ampliar en el otro extremo (Fig. 4). El haz de fibras coherentes utilizados en la construcción de este endoscopio es pulida por los dos extremos, por lo que es el llamado "contacto-mode" microendoscope. Una imagen de enfoque por lo tanto, sólo se forman cuando la punta microendoscope se pone en contacto cercano con un objeto. En este arreglo pseudo-confocal, la acción de exploración del microscopio enfoca el láser en una fiber núcleo a la vez, mientras que el agujero confocal asegura que no hay luz fuera de foco de las fibras de alrededor se le permite pasar a través del detector. Para aplicaciones de imágenes diferentes, un conjunto de lentes se pueden añadir en el extremo distal para permitir mirando hacia el frente, imágenes de fluorescencia de larga distancia. Lentes Microoptic, así como el índice de refracción de gradiente (GRIN), lentes puede ser fácilmente adaptado para este uso, y puede ser colocada en el extremo distal de fibra óptica utilizando colas de calidad.
- Para configurar el sistema de imágenes para microendoscopy, retire con cuidado el escenario de la muestra y sustituirla por una etapa de la celebración de la fibra (Fig. 5). Sumerja un extremo del haz de fibras en una solución débil de medio de contraste para que la emisión de fluorescencia se genera de forma homogénea en todos los núcleos de las fibras. Encienda el sistema de escaneo y ajuste el titular de la fibra para que el otro extremo del haz de fibras (el extremo proximal, o el extremo más cercano a la óptica de microscopio) en el foco. En primer lugar, utilizar la traducción de ajuste scrsistema de alerta temprana al centro de la fibra en el campo de escaneado. Ahora, mira la imagen de emisión de fluorescencia de la punta de la fibra proximal durante la exploración. Cuando la superficie microendoscope completa está en el plano focal del objetivo, la emisión de fluorescencia en todos los núcleos de fibra será lo más uniforme posible. Use los botones de ajuste de ángulo para ajustar la fibra para hacer frente a todos los núcleos de las fibras con brillo uniforme. Durante este ajuste, es probable que sea necesario volver a ajustar la posición de traducción para volver a centrar la fibra en el campo de escaneado. Iterar a través de estos ajustes hasta que la punta de la fibra está correctamente enfocado.
- Antes de utilizar el microendoscope, limpie suavemente la punta distal con papel de limpieza de lentes ligeramente humedecido con metanol grado HPLC. Al igual que antes, utilizar un tamaño estándar conocidos para medir y calcular la resolución del sistema de imagen microendoscope.
6. Los resultados representativos:
La figura 6 muestra un ejemplo de un producto acabado uprDERECHO microscopio confocal de barrido configurado para microendoscopy. Los rayos láser y las emisiones se han elaborado como una guía para el ojo. Un montaje de fibra tiene la fibra de la imagen en su lugar durante la operación microendoscopy. Este sistema de montaje de fibra puede ser fácilmente sustituido por una xy o xyz etapa de traducción para su uso como plataforma de microscopio vertical. Thorlabs partes PT3 (traducción XYZ) o dos etapas apiladas PT1 (XY traducción) funciona bien para esta aplicación, junto con un soporte en ángulo recto, como parte Thorlabs AP90.
Una tarjeta digitalizadora de video-tasa se utiliza para generar imágenes de la señal entrante. La figura 7 muestra una imagen de prueba representativa, obtenida de una minúscula "m" impreso en una tarjeta de visita blanco utilizando el sistema de video-microscopio de velocidad de exploración. Papel blanco blanqueado contiene fluoróforos que son excitados por la luz UV y azul, lo que resulta en el fondo oscuro brillante detrás de la carta "m". Un filtro de emisión centrado en 515 nm fue elegido para recoger esta emisión fluorescente. A mINOR distorsión de la imagen se puede observar, sobre todo cerca de los bordes laterales de la caja de imagen. Esto da como resultado una distorsión de los patrones de exploración sinusoidal de la 8kHz gavlo espejo, y será discutido en detalle más adelante.
Figura 1. Diagrama que demuestra el principio de funcionamiento de un microscopio confocal. Los rayos procedentes del enfoque objetivo se transmiten a través del sistema y se centró a través del agujero confocal (rojo). Los rayos se originan tanto por encima (azul) o inferior (verde) el enfoque objetivo no surgen de los objetivos colimado, y por lo tanto no se transmite de manera eficiente a través del agujero confocal.
Figura 2. Diagrama que muestra todos los haces de luz a través del sistema de barrido del haz. Los espejos de exploración se sientan en los planos telecéntrico con la estacióncionario, de nuevo objetivo plano de la abertura. Pares de lentes entre los planos fijos actuar para transmitir los rayos digitalizada. Los dos primeros lentes de relevo tienen la misma distancia focal, la formación de un telescopio de 1:1. El segundo par de lentes, conocida formalmente como la lente de escaneado y la lente del tubo, no es necesario tener la misma longitud focal, y sirven a menudo como un telescopio haz expansión para asegurar el objetivo está demasiado llena de nuevo de apertura. La luz emitida desde la muestra viaja a través del sistema de escaneo y se pasa a través del espejo dicroico. Una lente de enfoque corto se centra la emisión de luz a través del agujero confocal, que luego se colimada por una lente. Un objetivo final se centra la emisión confocal filtrado en un tubo fotomultiplicador. Haga clic aquí para ver una versión en tamaño completo de esta imagen.
Figura 3. (A) Diagrama general de la configuración electrónica de barrido. Señal del microscopio de referencia global y de base de tiempo es la "sincronización" de salida TTL del espejo eje rápido de resonancia galvo, lo que genera un pulso TTL al final de cada línea escaneada (es decir, cuando el galvo ha completado un ciclo). Esto proporciona la señal de H-sync a la tarjeta digitalizadora. La salida de la galvo de sincronización es también conectado a la placa V-sync de control, que progresivamente aumenta la tensión de salida en respuesta a cada pulso de H-sync para generar la forma de onda de diente de sierra que lleva el eje de exploración lenta. Una vez que todas las líneas han sido escaneados, se restablece el V-Sync la forma de onda diente de sierra y genera un pulso TTL que sirve como señal de V-sync de la framegrabber. La entrada final a la tarjeta digitalizadora es la señal analógica del tubo fotomultiplicador (PMT Tenga en cuenta que muchos de generar la tensión de salida negativa, asegúrese de diseñar un circuito ded elegir el hardware correspondiente). La tasa de imágenes de vídeo se genera y se muestra en el software de Matrox digitalizadora. (B) Ejemplo de circuito de control. En este diseño, el voltaje de cada pulso de H-Sync es "añadido" / integrado en el amplificador operacional integrador para generar la rampa de diente de sierra de forma de onda, pulsos son contados de forma concomitante a la etapa del contador TTL. Cuando el número de líneas deseado se ha alcanzado (es decir, cuando el análisis de la trama es completa), el contador genera un activo bajo "llevar a cabo" el pulso, que impulsa el gatillo Schmitt para generar un pulso de reset para el integrador. Esto restablece tanto el contador y el amplificador operacional integrador, preparando el circuito para el próximo ciclo. Elección de los componentes adecuados hace de este circuito ampliamente aplicable a una variedad de tamaños de trama. Esta es sólo una aplicación, muchas otras implementaciones son posibles y pueden ser preferibles en ciertas circunstancias. Además, este circuito está diseñado para su uso con tarjeta digitalizadora Matroxs, que detectar y corregir fase de la imagen automáticamente. Si el circuito se va a utilizar con framegrabbers otros, los circuitos de corrección de fase o de software que sean necesarios. Haga clic aquí para ver una versión en tamaño completo de esta imagen.
Figura 4. Transmisión de imágenes a través de un haz de fibras coherente. En este esquema, las lentes a cada lado del paquete estén en su lugar a escala de la imagen proyectada en la entrada del haz de fibras, así como ampliar la imagen de la salida de un haz de fibras.
Figura 5. Ejemplo de un haz de fibras montadas en un soporte de 5 ejes. Un pequeño un "bloque de aluminio de diámetro era tan aburrido que el haz de fibras se podría insertar la imagen. La fibra fue pegado con resina en el interior del bloque de aluminio en el both la parte superior e inferior del bloque de la estabilidad.
Figura 6. Imagen del sistema de microscopía completa con la microendoscope adjunto. Para visualizar mejor los caminos de la luz, la trayectoria del haz de excitación se dibuja en azul, mientras que la trayectoria del haz de emisión después de que el espejo dicroico se dibuja como una línea roja.
Figura 7. Ejemplo de imagen generada por el sistema de tipo de video-microscopía confocal de barrido. A oscuras en minúsculas la letra "m" aparece en el fondo brillante de fluorescencia de una tarjeta de visita blanco.
Discussion
Este sistema de imágenes de vídeo de tipo hace uso de un espejo de funcionamiento galvanómetros de resonancia alrededor de 8 kHz. Espejos de resonancia puede ser muy fuerte cuando se ejecuta a plena potencia, y su tono alto puede ser molesto o incluso peligroso en los tiempos de exposición suficiente. Aunque no se han presentado aquí, se recomienda proteger el espejo resonante galvanométrico dentro de una caja transparente para reducir significativamente el volumen del sistema y / o usar equipo de protección adecuada para los oídos, como tapones para los oídos.
El espejo galvanómetros de resonancia escanea en un patrón sinusoidal. Sin embargo, las tarjetas de framegrabber leer en señal de asumir una frecuencia de barrido completamente lineal en las direcciones horizontal y vertical. Desde un barrido sinusoidal se ralentiza en los bordes de la exploración, los artefactos de compresión de imágenes se puede observar a lo largo del eje rápido de la imagen (horizontal). Una forma de minimizar este problema es conducir a propósito del espejo resonante galvo rango de lectura significativamente mayor que eldiámetro de la lente de relé. Al hacer esto, sólo la barra central de casi lineal de la trama de lectura sinusoidal recorrerá la muestra, reduciendo al mínimo las distorsiones de la imagen. Otro enfoque sería para procesar imágenes post-recogida para alinear el eje rápido. Esto se puede lograr mediante imágenes de un patrón conocido fluorescentes (como una rejilla) y el uso de las dimensiones de la forma conocida para crear una secuencia de comandos de procesamiento que unwarps las imágenes recogidas.
Este sistema de escaneo en particular fue diseñada con el propósito de imágenes in vivo, que requiere a menudo una posición vertical orientada al video-tasa de microscopio. Para los experimentos de imagen celular, microscopios invertidos son más habitual. El diseño que aquí se presenta se pueden cambiar fácilmente para construir tal un microscopio invertido, todo lo que se requiere es una rotación de los últimos 2 espejo "de diámetro. En lugar de orientar el espejo para dirigir el haz de exploración hacia abajo, el espejo puede dirigir el haz hacia arriba. La colocación de la lente del objetivo unot la misma distancia del espejo, junto con una etapa de la muestra que permite obtener imágenes en una geometría invertida. Si el sistema de imagen se construye exclusivamente para obtener imágenes de microendoscópica, no hay ninguna razón para "doblar" el diseño del microscopio vertical en absoluto. En cambio, el sistema de análisis completo se puede construir sobre una placa horizontal con un solo lente objetivo del paralelo orientado a la mesa óptica.
Tenga en cuenta que el microscopio en esta versión utiliza una configuración de orificio fijo, mientras que esta prevé la construcción de mayor simplicidad y facilidad de adaptación, los usuarios que desean un sistema más versátil podría considerar la incorporación de un orificio variable, como se puede encontrar en la mayoría de los microscopios confocal comercial. Al permitir al usuario ajustar el tamaño del agujero de alfiler para compensar las muestras de mayor o menor intensidad de las emisiones, lo que permite al usuario optimizar mejor el equilibrio entre la fuerza de la señal y la resolución para una muestra dada.
La chOZ de la fibra de la imagen seleccionada para el microscopio es importante. Recomendamos el uso de fibras de Sumitomo coherente de la imagen debido a su espaciamiento núcleo de la fibra y bajos en relación con autofluorescencia. Fibras de la imagen fabricado por Fujikura se ha encontrado que tienen altas cantidades de autofluorescencia 10, que puede abrumar a las débiles señales de fluorescencia de una muestra de la sensibilidad y el límite máximo de la microendoscope. Fibras Sumitomo manufacturados, tales como la 8-30N utiliza en esta configuración en particular, tienen niveles mucho más bajos que sus equivalentes de autofluorescencia Fujikura. Mientras haces de fibra de sanguijuelas puede ser considerado atractivo para microendoscopy, su diseño general, los lugares los núcleos individuales de fibra demasiado lejos, lo que significa que los núcleos de fibra de baja densidad de los objetos de la muestra, dejando fuera a importantes regiones de interés potencial.
Por último, cabe señalar que mientras que el microscopio se describe aquí será útil en una variedad de ensayos in vitro e in vivo de solicomplementos y se pueden crear para una fracción del costo de un sistema comercial completa, que no tiene características como la detección de la luz transmitida, un ocular para ver, o una trayectoria del haz de no confocal de campo amplio de epifluorescencia. Si bien es posible construir un sistema con estas características desde el principio, los lectores que deseen un sistema que desee modificar un sistema comercial existente para satisfacer sus necesidades en lugar de iniciar una completamente nueva construcción.
Disclosures
La producción de este video este video fue patrocinado por Thorlabs, Inc.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a Thorlabs por su apoyo a este proyecto. AJN desea agradecer el apoyo de una beca de la NSF Graduate.
Este trabajo fue parcialmente financiado por los Institutos Nacionales de Salud a través del Nuevo Director de los NIH Programa Premio a la Innovación, el número de concesión una DP2 OD007096-01. Información sobre el Programa Innovator Award Nuevo en http://nihroadmap.nih.gov/newinnovator/ . Los autores desean agradecer a Tom Hayes para el uso del laboratorio de Harvard Electronics.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 515 nm Band Pass Filter | Chroma Technology Corp. | HQ515/50M | 46 FWHM |
| Achromatic Doublet Lens 25.4mm Dia. x 50mm FL, MgF2 Coating | Edmund Scientific | NT49-766 | |
| Achromatic Doublet Lens 25.4mm Dia. x 76.2mm FL, MgF2 Coating | Edmund Scientific | NT49-768 | |
| Achromatic Doublet Lens 25.4mm Dia. x 88.9mm FL, MgF2 Coating | Edmund Scientific | NT49-769 | |
| Achromatic Doublet Lens 50mm Dia. x 300mm FL, MgF2 Coating | Edmund Scientific | NT45-179 | |
| 8 kHz R High Frequency Optical Scanner | Electro-Optical Products Corporation (EOPC) | SC-30 | 8 kHz |
| AGC Driver | Electro-Optical Products Corporation (EOPC) | ACG:8K | |
| H7422-PA Photosensor Module | Hamamatsu Corp. | H7422-PA | Current limiting recommended |
| M9012 Power Supply | Hamamatsu Corp. | M9012 | For use with H7422-PA |
| HC PL APO CS Objective | Leica Microsystems | 11506284 | 10x/0.40 |
| Solios eA/XA Framegrabber Card | Matrox | Solios eA/XA | MIL software required; –M interconnects recommended |
| 12V Power Supply | Meanwell | LPV-100-12 | +12V, 8.5A |
| 5x Microscope Objective Lens | Newport Corp. | M-5X | 0.10 NA, 25.4 mm Focal Length |
| Coherent Image Fiber | Sumitomo Bakelite Co., Ltd. | 8-30N | |
| 1/4"-20 Cap Screw and Hardware Kit | Thorlabs Inc. | HW-KIT2 | |
| 100 μm Mounted Pinhole | Thorlabs Inc. | P100S | Ideal for building spatial filters |
| 30 mm Cage Cube Clamp | Thorlabs Inc. | B6C | |
| 30 mm Cage System Cube, 4-Way | Thorlabs Inc. | C4W | |
| 406 nm, 5 mW, B Pin Code, SM Fiber Pigtailed Laser Diode, FC/PC | Thorlabs Inc. | LPS-406-FC | Product obsolete; replaced by LP405-SF10 |
| 5-Minute Epoxy, 1 Ounce | Thorlabs Inc. | G14250 | |
| 6 Axis Kinematic Optic Mount | Thorlabs Inc. | K6X | |
| 8-32 Cap Screw and Hardware Kit | Thorlabs Inc. | HW-KIT1 | |
| 8-32 Setscrew and Hardware Kit | Thorlabs Inc. | HW-KIT3 | |
| Adapter with External RMS Threads and Internal SM1 Threads | Thorlabs Inc. | SM1A4 | |
| Adj. FC/PC and FC/APC Collimator, f = 2.0 mm, ARC: 400-600 nm | Thorlabs Inc. | CFC-2X-A | f = 2.0 mm |
| Adjustable Fiber Collimator Adapter, SM1 Threaded | Thorlabs Inc. | AD9.5F | |
| Aluminum Breadboard, 12" x 18" x 1/2" | Thorlabs Inc. | MB1218 | 1/4"-20 Threaded |
| Benchtop Laser Diode/TEC Controller | Thorlabs Inc. | ITC4001 | 1 A/96 W |
| DMLP 425 nm Long-Pass Dichroic Mirror | Thorlabs Inc. | DMLP425 | |
| Kinematic Mount for 1" Optics | Thorlabs Inc. | KM100 | |
| LD/TEC Mount for ThorLabs Fiber-Pigtailed Laser Diodes | Thorlabs Inc. | LM9LP | |
| Lens Mount for 18 mm Optics | Thorlabs Inc. | LMR18 | One retaining ring included |
| Lens Mounts for 2" Optics | Thorlabs Inc. | LMR2S | With internal and external threading; retainer ring included |
| Mini Series Cage Assembly Rod, 6" Long, 4 mm, Qty. 1 | Thorlabs Inc. | SR6 | |
| 1.0" Pedestal Pillar Post, 8-32 Taps, 1" Long | Thorlabs Inc. | RS1P8E | |
| 1" Pillar Post Extension, Length=0.5 | Thorlabs Inc. | RS05 | |
| 1" Pillar Post Extension, Length=0.75" | Thorlabs Inc. | RS075 | |
| 1" Protected Silver Mirror, 3.2 mm Thick | Thorlabs Inc. | ME1-P01 | |
| 1" SM1 Rotating Adjustable Focusing Element, L = 1" | Thorlabs Inc. | SM1V10 | |
| 2" Protected Silver Mirror, 3.2 mm Thick | Thorlabs Inc. | ME2-P01 | |
| P100S - 100 μm Mounted Pinhole | Thorlabs Inc. | P100S | |
| Polaris Low Drift 1" Kinematic Mirror Mount | Thorlabs Inc. | POLARIS-K1 | Low drift |
| SM1 Lens Tube, L = 1" | Thorlabs Inc. | SM1L-10 | One retaining ring included |
| SM1 Threaded 30 mm Cage Plate, 0.35" Thick | Thorlabs Inc. | CP02 | |
| SM1 to M25 Optical Component Threading Adaptor | Thorlabs Inc. | SM1A24 | External SM1 Threads and Internal M25.5x0.5 Threads |
| Small Beam Diameter Galvo System | Thorlabs Inc. | GVSM001 | |
| Small Clamping Fork | Thorlabs Inc. | CF125 | 1/25" counterbored slot, universal |
| Spatial Filter System | Thorlabs Inc. | KT310 | Pinhole sold separately |
| TE-Cooled Mount for 5.6 & 9 mm Lasers | Thorlabs Inc. | TCLDM9 | |
| Vertical Bracket for Breadboards | Thorlabs Inc. | VB01 | Each |
| Plan-Apochromat | Carl Zeiss, Inc. | 1101-957 | 20x/0.75 NA |
References
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- Stephens, D. J. Light Microscopy Techniques for Live Cell Imaging. Science. 300, 82-86 (2003).
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