Summary
DT40, en modell virveldyr genetisk system, gir et kraftig verktøy for å analysere protein funksjon. Her beskriver vi en enkel metode som gjør det mulig kvalitativ analyse av parametere som påvirker DNA syntese under S-fasen i DT40 celler på ett molekyl-nivå.
Abstract
Vedlikehold av replikasjonsgaffelen stabilitet er av største betydning for å dele celler til å bevare levedyktighet og forebygge sykdom. Prosessene som er involvert ikke bare sikre trofaste genomet duplisering i ansiktet av endogene og eksogene DNA-skader, men også hindre genomisk ustabilitet, en anerkjent utløsende faktor i tumor utvikling.
Her beskriver vi en enkel og kostnadseffektiv fluorescens mikroskopi-basert metode for å visualisere DNA replikasjon i avian B-cellelinje DT40. Denne cellelinje gir et kraftig verktøy for å undersøke protein funksjon in vivo ved revers genetikk i virveldyr cellene 1. DNA fiber fluorography i DT40 celler mangler et spesifikt gen tillater en å belyse funksjonen til dette genet produktet i DNA replikasjon og genomet stabilitet. Tradisjonelle metoder for å analysere replikasjonsgaffelen dynamikk i virveldyr cellene er avhengige av å måle den generelle hyppigheten av DNA syntese i en befolkning på puls-merket celler. Dette er en kvantitativ tilnærming og ikke tillater for kvalitativ analyse av parametere som påvirker DNA-syntese. I kontrast, kan frekvensen av bevegelsen av aktive gafler følges direkte når du bruker DNA fiber teknikken 2-4. I denne tilnærmingen, er begynnende DNA merket in vivo ved inkorporering av halogenerte nukleotider (Fig 1A). Deretter er individuelle fibrene strukket ut på et objektglass, og den merkede DNA replikasjon traktene er beiset med spesifikke antistoffer og visualiseres ved fluorescens mikroskopi (fig 1B). Oppstart av replikering samt gaffel retningen bestemmes av påfølgende bruk av to forskjellige modifiserte analoger. Videre tillater dual-merking tilnærming for kvantitativ analyse av parametere som påvirker DNA syntese under S-fasen, dvs. replikering strukturer som pågående og stoppet gafler, replikering opprinnelse tetthet samt gaffel avslutninger. Endelig kan den eksperimentelle prosedyren skal utretteed løpet av en dag, og krever kun generell laboratorieutstyr og en fluorescens mikroskop.
Protocol
Metoden er beskrevet her ble brukt i følgende publikasjon: Schwab m.fl., EMBO J., 29 (4) :806-18 5..
1. DT40 cellekultur
Materialer: Fetal bovin serum (FBS), kylling serum, penicillin / streptomycin, 2-mercaptoethanol, RPMI
- Forbered cellekultur medium: legg til 7% FBS, 3% kylling serum, 1x penicillin / streptomycin og 10 mm 2-mercaptoethanol til RPMI medium.
- DT40 celler dyrkes i sterile cellekultur flakonger ved 38 ° C og 5% CO 2 i et fuktet inkubator. Split celler hver dag til en tetthet på 5 x 10 5 celler / ml 6.
2. In vivo merking
Materialer: Idu, CldU
- Forbered lager løsninger av nukleotidanaloger: Løs Idu til 5 mm og CldU til 2,5 mm i medium. Heat begge løsninger kort til 60 ° C og vortex inntil nucleotide analogUES oppløses helt.
- Legg IDU til en endelig konsentrasjon på 25 mM til eksponentielt voksende DT40 celler og bland cellesuspensjonen godt. Inkuber cellene i 20 minutter ved 38 ° C og 5% CO 2.
- Etter inkubering med den første etiketten, legger CldU til en endelig konsentrasjon på 250 mM og behandle celler som beskrevet i forrige trinn.
- Vask celler med iskald PBS og resuspender dem i en konsentrasjon på 7,5 x 10 5 celler / ml i kaldt PBS. Hold merkede cellene på is.
Merkingen prosedyren som er beskrevet er bare et forslag og kan endres for å løse spesifikke spørsmål. Vennligst referer til diskusjonen delen for mer informasjon om eksperimentell design.
3. Cellelyse og DNA spre
Materialer: Glass slides, fiber lysis løsning
- Klargjør fiber lysis løsningen: 50 mM EDTA og 0,5% SDS i 200 mM Tris-HCl, 7,5 pH
- Pipet 7 mL lysis løsning på toppen av cellesuspensjonen og forsiktig røre med pipettespissen å blande løsningene. Inkuber i 2 minutter for cellelyse å fortsette.
- Tilt lysbilder til 15 ° slik at fibrene til å spre seg langs raset.
- Når fiber løsningen har nådd bunnen av lysbildet, plasser den horisontalt til lufttørke. Etter tørking bør en tynn, gjennomsiktig linje være synlig langs raset. På dette punktet, bør begynnelsen av strukket fiber være merket med en blyant som etter farging linjen vil ikke være synlig lenger. Dette merket vil senere bidra til å lokalisere fibrene under mikroskopet.
Fire. Immunfluorescens flekker
Materialer: Metanol, eddiksyre, HCl, 5% BSA i PBS, flekker jar, anti-BrdU (mus) antistoff,anti-BrdU (rotte) antistoff, sau anti-mus Cy3 antistoff, geit anti-rotte Alexa Fluor 488 antistoff, Vectashield montering medium, Dekkglass, neglelakk
- Fordyp lysbilder i metanol / eddiksyre (3:1) i en flekker krukke og inkuberes i 10 minutter.
- Vask lysbilder i destillert H 2 O, deretter fordype i 2,5 M HCl for 80 minutter.
- Vask lysbilder tre ganger i PBS i 5 minutter.
- Fjern lysbilder fra flekker krukken og samle overskytende PBS med et papirhåndkle. Plasser lysbilder horisontalt og pipettér 5% BSA på toppen av hvert lysbilde. Dekk lysbilder forsiktig med et dekkglass å spre BSA jevnt over sklie og inkuberes i 20 minutter.
- Fortynn den primære antistoffer hos 5% BSA på følgende konsentrasjoner: 01:25 anti-BrdU (mus) og 1:400 anti-BrdU (rotte).
- Flytt dekkglass forsiktig ned i glasset skyv å fjerne det. Ikke bruk makt dersom dekkglass holder til i lysbildet. Raset kan rehydrert i PBS inntil dekkglass blir løs end kan fjernes med letthet. Samle overskudd BSA med et papirhåndkle og plasser lysbilder horisontalt. Pipetter 50 mL av de primære antistoff løsningen på hvert lysbilde. Cover igjen med et dekkglass å spre antistoff løsningen jevnt over raset og inkuberes i en fuktet kammer for 2 timer.
- Etter å ha fjernet Dekkglass, vask lysbildene tre ganger i PBS i 5 minutter
- Fortynn den sekundære antistoffer hos 5% BSA på følgende konsentrasjoner: 1:500 sau anti-mus Cy3 og 1:400 geit anti-rotte Alexa Fluor 488.
- Påfør 50 mL av de sekundære antistoff løsning som beskrevet for den primære antistoffer. Beskytt lysbilder fra lys og inkuberes i 1 time.
- Etter å ha fjernet Dekkglass, vask lysbildene tre ganger i PBS i 5 minutter.
- Legg til en dråpe Vectashield montering medium på hvert lysbilde og bruke en dekkglass. Trykk forsiktig Dekkglass og fjerne overflødig væske rundt den med et papirhåndkle. Seal Dekkglass med gjennomsiktig spiker polish og la dem tørke. Oppbevar lysbilder ved -20 ° C.
5. Bilde oppkjøp
Materialer: fluorescens mikroskop, kamera
Legg en dråpe nedsenking olje på et lysbilde nær blyant merke og starte finne fibrene. Vanligvis er det en viktig fiber bunt, men disse fibrene er for innviklet og ikke kan analyseres senere. Flytt bort fra hoved bunt å finne områder hvor fiber er klart adskilt fra hverandre (Fig. 2). Vi ville velge bilder bare bruker én farge kanal for å unngå skjevhet. Deretter ville vi ta ca 10 bilder av hvert tidspunkt, konsentrasjon eller cellelinje. Imidlertid avhenger av antall bilder på hvor mange fibrene kan telles på hvert bilde. Flytt langs lysbildet å ta forskjellige bilder, som et område av et lysbilde ikke kan gi representative fiber lengder eller replikering strukturer.
Seks. Dataanalyse
Materialer: Bildeanalyse program, f.eks ImageJ ( http://rsbweb.nih.gov/ij/ )
Importere bilder inn i et bilde analyse program. Mål lengder av fiber traktater og / eller telle de forskjellige replikering strukturer (fig 3). Bare telle fibre som er godt synlige og som ikke strekker seg over kanten av bildet. Vi vanligvis måle lengden på ca 100 fibre og telle 150-200 replikering strukturer og vi ville gjenta individuelle eksperimenter minst tre ganger.
7. Representant Resultater:
Nylig replikert DNA kan visualiseres som linjer av antistoff-merket nukleotidanaloger. I våre eksperimenter en pågående gaffel er representert som tilstøtende røde og grønne signaler (fig 3). Den doble merking protokollen lar oss også til å definere fire store klasser av replikasjon strukturer: 1) ny igangsetting hendelser kan divid ed inn opprinnelse som har avfyrt mens cellene ble inkubert med den første etiketten og opprinnelse som har avfyrt under inkubasjon med den andre etiketten. Den tidligere består av nabolandet grønn-rød-grønn signaler og sistnevnte av en grønn linje bare. 2) oppsigelse events manifest som tilgrensende rød-grønn-rød signaler. 3) ispedd opprinnelse er områder i genomet med tett linjeavstand opprinnelse. Slike nettsteder består av sammenhengende opprinnelse og opphør signaler. 4) avhengig av eksperimentell design, stoppet / kollapset gafler kan enten defineres som en rød bare signal 7 eller en rød linje etterfulgt av en kort grønn skrift 8,9.
Bruk av forholdene beskrevet her, villtype DT40 celler har en gjennomsnittlig gaffel hastighet på 0,4 mikrometer / min. Vi kan oppdage ca 63% pågående gafler, 10% opprinnelse, 16% stoppet gafler (rød bare traktater), 8% avslutninger og 3% interspersed fibre.
ure 1 "/>
. Figur 1 (A) Den venstre side av tegneserie skildrer første trinn i DNA merking prosedyren: legge Idu til eksponentielt voksende DT40 celler fører nucleotide analog til være lett innarbeides i den nylig syntetisert ledende og lagging DNA-trådene. Dette kan visualiseres ved hjelp av et spesifikt antistoff, og vises som en rød tråd når den vises under mikroskopet. Deretter er den samme prosedyren gjentas med CldU som vist på høyre side av figuren. Etter inkubering med andre nucleotide analoge, vil en aktiv gaffel være synlig som et tilstøtende rød-grønn skrift. Den gjennomsnittlige fiber lengde er proporsjonal med inkubasjonstid på nukleotidanaloger. (B) DNA fra lyserte DT40 celler er strukket av tyngdekraften på et objektglass og innlemmet nukleotidanaloger er visualisert ved hjelp av spesifikke antistoffer og fluorescens mikroskopi.
igure 2 "/>
Figur 2. En representant fluorescens bildet viser fibre fra villtype DT40 celler senere merket med sprøytebruk og CldU i 20 minutter hver. Mesteparten av fiber er godt atskilt fra hverandre og kan dermed lett bli analysert. Den hvite linjen representerer 10 mikrometer.
. Figur 3 dobbel-merking fiber teknikken gjør det mulig å skille mellom ulike replikering strukturer; 1 - aktivt replikere gafler, 2 - nye områder av DNA replikasjon (avfyring av nye opprinnelse), 3 - gaffel avslutninger (to konvergerende gafler), 4 - interspersed fiber (steder av tett linjeavstand opprinnelse) og 5 - stoppet gafler (red kun signal).
Discussion
Vi beskriver en metode som gjør det mulig for kvantitativ analyse av parametere som påvirker DNA syntese i S-fasen på et enkelt molekyl-nivå. I løpet av de siste ti årene, var ulike versjoner av DNA fiber fluorography teknikken utviklet for å visualisere bevegelsene til replikering gafler inne i levende celler. Den kritiske parameteren i alle disse teknikkene er prosedyren brukes for å oppnå best mulig strekking av DNA på glassflater gir godt atskilt DNA fibre. Et viktig skritt for å oppnå dette er inkubasjonstiden av cellesuspensjonen på objektglass samt lysis tid. Disse parametrene avhengig av temperatur og luftstrøm i et bestemt lab og bør bestemmes empirisk. Den praktiske delen av et DNA fiber eksperimentet er vanligvis oppnås innen én dag. Men etterfølgende bilde oppkjøp og analyse mer tidkrevende og krever praksis.
Merkingen protokollen kan adApted å svare på ulike vitenskapelige problemstillinger: ved hjelp av en agent som forstyrrer replikering i løpet av andre pulsen merking overvåker gaffel forlengelse / drøye svar på replicative stress. I dette scenariet gjør den første etiketten ikke trenger å bli vasket ut som den nest nucleotide er lagt i overkant. Alternativt kan medikamenter som hindrer replikasjon brukes i kombinasjon eller like etter tilsetning av den første etiketten. Dette krever at den første etiketten og stoffet skal fjernes før andre nucleotide analoge brukes. Denne prosedyren gjør det mulig å fastslå betydningen av ulike DNA-reparasjon faktorer på replicative gaffel stabilitet / recovery under forhold med replicative stress (dvs. gaffel stalling og / eller kollaps). Bemerkelsesverdig, kan en mer detaljert analyse av opplysninger om DNA replikasjon programmet utføres med bruk av alternative tilnærminger kombinere DNA gre og fluorescens in situ hybridisering. Dette er imidlertid teknisk mer utfordrende og krever kostbareomfattende utstyr.
Evnen til kvalitativt og kvantitativt analysere opplysninger om DNA replikasjon gir et viktig verktøy for å undersøke defekter i DNA replikasjon seg selv samt veier som undertrykke genomisk ustabilitet forbundet med replikering gafler. Utvilsomt vil denne analysen ytterligere bidra til å belyse mekanismene for replikering-mediert DNA-reparasjon som gjør at normale celler til å svare / tilpasse seg endringer i miljøet, samt hvordan kreftceller utnytte disse mekanismene for å motstå toksisitet av legemidler rettet replikering gafler.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklært.
Acknowledgments
Vi takker Dr T. Helleday og Dr E. Petermann for hjelp med fiber teknikken samt medlemmer av lab for nyttig diskusjon. WN er støttet av en Senior International Research Fellowship fra Association for International Cancer Research og av den polske staten Committee for Scientific Research Grant (N301 165 935).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fetal bovine serum gold (FBS) | PAA Laboratories | A15-151 | |
| Chicken serum | Sigma-Aldrich | C5405 | |
| Penicillin/Streptomycin | PAA Laboratories | P11-010 | |
| RPMI 1640 | GIBCO, by Life Technologies | 21875 | |
| 5-Iodo-2’-deoxyuridine (IdU) | Sigma-Aldrich | I7125 | |
| 5-Chloro-2’-deoxy-uridine (CldU) | Sigma-Aldrich | C6891 | |
| Microscope slides SuperFrost | VWR international | 631-0910 | |
| Cover slips No1 | Scientific Laboratory Supplies LTD | MIC3234 | |
| Vectashield mounting medium | H-1000 Vector lab | H-1000 | |
| Anti-BrdU antibody (mouse) | BD Biosciences | 347580 | |
| Anti-BrdU antibody (rat) | Abcam | ab6326 | |
| sheep anti-mouse Cy3 | Sigma-Aldrich | C2181 | |
| goat anti-rat Alexa Fluor 488 antibody | Invitrogen | A110060 |
References
- Caldwell, R. B., Fiedler, P., Schoetz, U., Buerstedde, J. M. Gene function analysis using the chicken B-cell line DT40. Methods. Mol. Biol. 408, 193-210 (2007).
- Petes, T. D., Williamson, D. H. Fiber autoradiography of replicating yeast DNA. Exp. Cell. Res. 95, 103-110 (1975).
- Takeuchi, F. Altered frequency of initiation sites of DNA replication in Werner's syndrome cells. Hum. Genet. 60, 365-368 (1982).
- Jackson, D. A., Pombo, A. Replicon clusters are stable units of chromosome structure: evidence that nuclear organization contributes to the efficient activation and propagation of S phase in human cells. J. Cell. Biol. 140, 1285-1295 (1998).
- Schwab, R. A., Blackford, A. N., Niedzwiedz, W. ATR activation and replication fork restart are defective in FANCM-deficient cells. EMBO. J. 29, 806-818 (2010).
- Saribasak, H., Arakawa, H.
- Conti, C., Seiler, J. A., Pommier, Y. The mammalian DNA replication elongation checkpoint: implication of Chk1 and relationship with origin firing as determined by single DNA molecule and single cell analyses. Cell. Cycle. 6, 2760-2767 (2007).
- Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different RAD51-mediated pathways for restart and repair. Mol. Cell. 37, 492-502 (2010).
- Edmunds, C. E., Simpson, L. J., Sale, J. E. PCNA ubiquitination and REV1 define temporally distinct mechanisms for controlling translesion synthesis in the avian cell line DT40. Mol. Cell. 30, 519-529 (2008).
