Bilaminar Co-cultivo de neuronas de rata primaria cortical y la glía

Summary

Aquí les ofrecemos un protocolo para el cultivo de neuronas de rata cortical en presencia de una capa alimentadora glial. Los cultivos de neuronas de establecer la polaridad y la creación de sinapsis, y se puede separar de la glía para su uso en diversas aplicaciones, tales como la electrofisiología, imágenes de calcio, los ensayos de supervivencia de las células, inmunocitoquímica, y ADN / ARN / aislamiento de las proteínas.

Abstract

Este video le guiará en el proceso de cultivo de neuronas de rata cortical en presencia de una capa alimentadora glial, un sistema conocido como bilaminar o el modelo de co-cultivo. Este sistema es adecuado para una variedad de necesidades experimentales de solicitar un sustrato de vidrio o de plástico y el crecimiento también puede ser utilizado para el cultivo de otros tipos de neuronas.

Las neuronas corticales de rata obtenidos a partir de la última etapa embrionaria (E17) se colocan sobre un cubreobjetos de vidrio o platos de cultivo de tejidos frente a una capa de alimentación de las células de crecer en los platos o laminillas de plástico (conocido como Thermanox), respectivamente. La elección entre las dos configuraciones depende de la técnica específica experimental utilizado, que puede requerir, o no, que las neuronas se producen en el vidrio (por ejemplo, imágenes de calcio en comparación con Western blot). La capa de alimentación gliales, una cultura astroglía enriquecida de las células de secundaria mixta, es preparado por separado a partir de las cortezas de las crías recién nacido (P2-4) con anterioridad a la neuronaldisección.

Una gran ventaja de este sistema de cultivo en comparación con una cultura de neuronas sólo es el soporte del crecimiento neuronal, la supervivencia y la diferenciación proporcionada por factores tróficos secretada por la capa de alimentación gliales, que se asemeja más precisión el entorno del cerebro in vivo. Por otra parte, el co-cultivo pueden ser usados ​​para estudiar las interacciones neuronales-gliales ^1.

Al mismo tiempo, la contaminación de las células de la capa neuronal es prevenir por diferentes medios (la cultura de baja densidad, además de inhibidores de la mitosis, la falta de suero y el uso de medio de cultivo optimizado) que conduce a una capa neuronal prácticamente pura, comparable a otros métodos establecidos ^{1 -3.} Las neuronas pueden ser fácilmente separada de la capa gliales en cualquier momento durante el cultivo y se utilizan para diferentes aplicaciones experimentales que van desde la electrofisiología ^4, biología celular y molecular ^05.08, bioquímica ^5, imágenes y micrófonoroscopy ^4,6,7,9,10. Las neuronas primarias se extienden axones y dendritas para formar sinapsis funcionales ^11, un proceso que no se observa en líneas de células neuronales, aunque algunas líneas celulares se extienden los procesos.

Un protocolo detallado de las neuronas del hipocampo de rata de cultivo que utilizan este sistema de co-cultivo ha sido descrita previamente ^4,12,13. Aquí detallamos un protocolo modificado adecuado para las neuronas corticales. Ya que aproximadamente 20x10 ⁶ células se recuperan de cada embrión de rata, este método es especialmente útil para los experimentos que requieren un gran número de neuronas (pero no se preocupa acerca de una población neuronal altamente homogénea). La preparación de las neuronas y la glía es necesario planificar de una manera y plazos específicos. Vamos a ofrecer el protocolo paso a paso para el cultivo de neuronas de rata cortical, así como el cultivo de células gliales de apoyo a las neuronas.

Protocol

1. Disección de la glía (alrededor de 2 semanas antes de las neuronas chapado)

1. Para prepararse para las herramientas de disección lugar estéril en el 70% de etanol, añadir 4 ml de medio de disección fría para placas de 60 mm (un plato por el cerebro), y el lugar del 2,5% de tripsina y DNasa en el hielo se descongele (ver detalles acerca de las herramientas quirúrgicas en la tabla VI ).
2. Utilice unas tijeras grandes para decapitar a 2-4 días de edad los cachorros y los jefes de una cápsula estéril 100 mm.
3. Use las tijeras medianas para hacer un corte medio a través de la piel y tirar hacia atrás la piel para exponer el cráneo. Use tijeras curvas para hacer un corte medio y dos cortes laterales a través del cráneo, sin dañar el tejido por debajo del cerebro. Eliminar el cráneo superior para exponer el cerebro.
4. Extraer el cerebro y lo coloca en su propio plato de 60 mm con 4 ml de medio disección en frío (ver tabla I para la composición). Coloque el plato bajo un microscopio estereoscópico (Leica ZOOM 2000, control de zoom: 7-30) y el uso de fórceps No.5 para separar los hemisferios, retire el cerebro medio, y la cáscara oy siguientes de las meninges.
5. Recoge todas las cortezas cerebrales disecados en un plato fresco 60 mm con el medio de la disección en frío, y picar el tejido con tijeras curvas.
6. Transferencia del tejido picado a un tubo estéril de 15 ml. Obtener un volumen de 4,5 ml con medio de la disección en frío y añadir 500 l de 2,5% de tripsina. Envuelva el tubo en Parafilm y flotar en un baño de agua a 37 ° C durante 15 minutos, mezclando por inversión cada 5 minutos.

   (Nota: aquí se describe el protocolo que siguen generalmente cuando se utiliza un máximo de 5 cerebros, si se utilizan más las crías, el volumen puede ser necesario ajustar adecuadamente)

7. Transferir el tejido a un tubo de 15 ml nuevo, minimizando el volumen del medio de la disección de la tripsina que contienen prorrogados. Obtener un volumen de 4.8mL con el medio de la disección fresca y añadir 200 l DNasa para alcanzar una concentración final de 60 ug / mL (solución de reserva: 3 mg de DNasa y 5 mg de MgSO4 en 2 ml de medio de disección). Triturar cuidadosamente ~ 20 veces con una pipeta estéril de 5 mlte, a continuación, añadir 10 ml de medio de las células de revestimiento (véase el cuadro II de la composición).
8. Permiten grandes piezas de tejido que conformarse con unos 4-5 minutos, a continuación, transferir la parte superior del 80% de la suspensión de células a un tubo de 50 ml. Repita la trituración de tejidos con un adicional de 3.2 ml de medio de las células de revestimiento (y con una pipeta pequeñas si es necesario), de nuevo, permitir que el tejido para resolver, y añadir la parte superior del 80% de la colección anterior. Obtener un volumen total de 20 ml con medio glia placas y centrifugar durante 15 minutos a 280 g (o 1300 rpm en una centrífuga IEC Centra CL2).
9. Aspirar el sobrenadante y resuspender el botón celular en medio de las células de revestimiento (más o menos con 5-7 ml en función del número de crías que se utiliza), a continuación, se añade medio de placas adicionales con el fin de contar con 10 mL de cada cerebro disecado. Mezclar bien y la placa 10 ml de suspensión celular en cada una de 75 cm ² frasco (es decir, un cerebro por frasco).
10. Mover los frascos de cultivo de una incubadora a 37 ° C (5 a 10% de CO2, proporcional a la bicarbona de sodiote el contenido de la media). Cambio medio de cultivo después de 24-48 horas y luego cada 3-4 días.

2. Glia secundaria (48 horas antes de las neuronas chapado)

1. Prepare Thermanox cubreobjetos (si las neuronas se sembraron en platos), añadiendo 3 gotas de cera derretida paraplast alrededor de la circunferencia de cada Thermanox lavado y autoclavado. Las células se sembraron en este lado de la Thermanox. Nuestra Thermanox son hechos a mano reutilizables ~ 60 mm de corte insertos de plástico (ver tabla VI de reactivos), con dos agujeros de aproximadamente 50 mm perforado a través de, a pesar de la cultura disponible en el mercado y se inserta se puede utilizar en su lugar.
2. Lave la glía primaria con PBS dos veces, sacudiendo vigorosamente cada frasco para eliminar las células sueltas. Cada frasco con glía primaria confluentes proporcionará aproximadamente 10 millones de astroglía, por lo que regularmente utilizan frascos de 2.4 por experimento.
3. Separar las células con un 0,05% tryspin-EDTA (1 mL10X 0,5% de tripsina-EDTA solución madre diluida en 9 ml de PBS). Combine a las células de 2 frascos en un tubo cónico de 50 ml y añadir una cantidad igual de medio de las células de revestimiento (véase el cuadro II de reactivos). Centrifugar durante 15 minutos a 280 g. Aspirar el sobrenadante y disolver el pellet glía en algunos ml de medio de las células de revestimiento.
4. Contar las células utilizando un hematocitómetro y diluir la suspensión celular, según sea necesario (~ 1x10 ⁶ células / ml), la placa de las células, ya sea en 60 mm platos (si las neuronas se sembraron en cubreobjetos), o en cubreobjetos Thermanox (si las neuronas se sembraron en placas de 60 mm). Las células deben ser chapada a 500.000 células por plato o Thermanox utilizando un medio de glía placas. En el caso de Thermanox cubreobjetos, placa 600 l de células en un gota a gota, a continuación, después de 2 horas Thermanox tapa y sumergir en el medio de las células gliales de galvanoplastia.
5. Si la preparación de placas de 60 mm de las células de secundaria para cubreobjetos neuronal, el cambio medio a N2.1 la noche antes de la disección neuronal.

3. Disección neuronaly Cultura

1. Prepare cubreobjetos de vidrio (15 mm de diámetro) mediante la adición de 3 gotas de cera derretida paraplast alrededor de la circunferencia de cada cubreobjetos estériles, con el fin de separar físicamente las capas de células y evitar raspar la célula. Las células se sembraron en este lado del cubreobjetos.
2. Placas de abrigo o cubreobjetos con 0,5 mg / ml polilisina (ya sea poli-L-lisina o poli-D-lisina disuelta en tampón borato, véase el cuadro VI) durante 2 horas o toda la noche. Lavar con agua estéril 2-3 veces y deje que se seque por completo. Nota: cubreobjetos se colocan en una placa de Petri hidrofóbico para evitar que se derrame / difusión de las soluciones durante el revestimiento con planchas de poli-lisina o celular, lo que puede ocurrir fácilmente si los cubreobjetos se colocan en placas de cultivo tisular.
3. Prepararse para la disección neuronal en cuanto a la disección de la glía (paso 1.1). La eutanasia a una rata preñada de 17 días, rocíe la piel con etanol al 70%, y cortar en sentido medial a través de la piel para exponer el útero. Retire todos los fetos y colocarlos en unestéril 100 mm plato.
4. Rápidamente diseccionar libre y decapitar a cada feto, la colocación de cada cabeza en su propio plato de 60 mm con medio disección en frío (4 ml). Normalmente, diseccionar los fetos 4.5 por experimento como aproximadamente 20 millones de neuronas se derivan de cada feto E17. Si hay más embriones son necesarios, asegúrese de que todo el procedimiento (de paso 3.4 al 3.12) no dura más de 90-100 minutos.
5. El uso de un microscopio estereoscópico y unas pinzas No.1/No.5 aislar la corteza cerebral tirando abrir la piel y el cráneo, la extracción del cerebro, que separa los hemisferios, y quitando el cerebro medio y las meninges.
6. Recoge todas las cortezas disecado en un plato fresco 60 mm con el medio de la disección en frío, y picar el tejido con tijeras curvas en piezas de ~ 1 mm.
7. Transferencia del tejido picado a un tubo estéril de 15 ml. Obtener un volumen de 4,5 ml con medio de la disección en frío y añadir 500 l de 2,5% de tripsina. Envuelva el tubo en Parafilm y flotar en un baño de agua 36 ° C durante 15 minutes, mezclando por inversión cada 5 minutos.
8. Transferir el tejido a un tubo de 15 ml nuevo, minimizando el volumen del medio de la disección de la tripsina que contienen prorrogados. Llevar a 4,8 ml con medio de disección fresca y añadir 200 l DNasa para alcanzar una concentración final de 60 ug / mL. Triturar aproximadamente 10 veces con una aguja estéril 5 o 2 ml de una pipeta, repita este paso según sea necesario utilizando una pulida al fuego (en frío) pipeta Pasteur de disociar la mayoría de los tejidos. A continuación, permiten que las piezas restantes de tejido (por lo general muy pocas, si las hay) para resolver durante 4-5 minutos.
9. Quitar la parte superior de una sola suspensión celular, dejando detrás de las piezas de tejido se establecieron, y el lugar esta solución en un tubo nuevo, con un volumen igual de medio de recubrimiento de neuronas (ver cuadro III). Mezclar bien pero suavemente, y luego contar las células, el 15 de placa cubreobjetos mm (35.000 células en cada una de 200 l) o placas de 60 mm (1x10 ⁶ células cada una de 3 ml), según sea necesario. La transferencia de células de la incubadora (36,5 ° C, CO2 5-10%).
10. Después de 3-4 horas combinandoe la capa de neuronas y la glía secundaria de la siguiente manera. Para las neuronas en placas de 60 mm, se lavan las células con DMEM caliente, cambiar el medio a 4 ml de medio libre de suero (N2, ver tabla IV), y añadir un Thermanox con las células de cada placa (células gliales debe hacer frente a las neuronas). Para cubreobjetos neuronal, la transferencia de 3 a 5 cubreobjetos para cada plato de 60 mm de las células de secundaria, con las neuronas hacia abajo.
11. 24 horas después de la siembra de las neuronas, añadir 10 M de citosina-β-D-arabinofuranoside para cada plato, con el fin de prevenir la proliferación de células gliales. Preparamos cuatro soluciones madre mM, diluir 1:10 con medio N2, y se añaden 25 uL / ​​mL de solución diluida a cada plato.
12. Las células se utilizan generalmente para experimentos después de 7-10 días en la cultura, aunque el tiempo exacto depende de la etapa de diferenciación deseada, sino que han sido cultivados durante un máximo de 4 semanas sin una reducción significativa en la supervivencia. Después de la primera semana, se recomienda que la mitad del volumen de los medios de ser sustituido cada semana.

Pocas horas después de las neuronas han unido al sustrato, que comienzan a extenderse lamelliopodia. Procesos continúan alargándose (Fig. 2A) y polarizar durante varios días en la cultura, y los axones y las dendritas extendido son claramente visibles (Fig. 2B; MAP2 manchas). Como las neuronas maduras las pérgolas dendríticas se vuelven más elaborados y desarrollar los contactos sinápticos, alrededor de 2-3 semanas después de sembrar muchas espinas dendríticas son visibles (Fig. 2C) ^11.

Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento para el cultivo de neuronas de rata cortical junto con una capa de alimentación gliales (células gliales secundaria). En primer lugar, 11 días antes de la disección de las neuronas, las células de un cultivo principal es preparado a partir de ratas recién nacidas (P2-4). Cuando las células son confluentes (aproximadamente nueve días después de la siembra de la glía primaria y dos días antes de la disección de las neuronas), los astrocitos son mecanismosanically separado de las células precursoras de los oligodendrocitos y microglia y bien chapada en platos o Thermanox (las células de secundaria). Las neuronas son obtenidos por medio de las cortezas de embriones E17 y chapada en cubreobjetos o bien en los platos (recubiertos con poli-lisina). Cuatro horas después de la siembra, la capa neuronal se añade a la glía secundaria.

Figura 2 Ejemplos de culturas en las distintas etapas (por ejemplo, 5 horas, 12 DIV, 21 DIV).. Las cifras son imágenes representativas de las neuronas corticales en cubreobjetos en diferentes momentos. Después de las neuronas se adhieren a las neuronas de sustrato comienzan a extenderse lamelliopodia. La imagen de contraste de fase muestra una neuritas pocos extendió cinco horas después de la siembra (A). La imagen en el medio (B, de Cook et al. 2010, con permiso) muestra 12 neuronas corticales DIV fijo y immunostained con el marcador neuronal dendríticas MAP2. Tinción de Hoechst fue utilizado como counterstaiNing. Como las neuronas maduras espinas dendríticas también se hacen visibles (C). Las barras de escala: A, B = 25 m; C = 10 micras.

Discussion

Este protocolo proporciona un método para el cultivo de neuronas corticales primarias de rata en la presencia de células de la glia, al tiempo que permite que las neuronas se pueden aislar fácilmente para el análisis experimental. El apoyo al desarrollo de las células de un fenotipo neuronal sanos, mientras que las respuestas neuronales también la modulación a los tratamientos experimentales de una forma fisiológicamente relevantes. Además, por pases antes de la glía principal cultivo de neuronas con esta población celular se convierte selectivamente enriquecido en los astrocitos, lo que impide la estimulación inflamatoria microglial. Para ciertos tipos de experimentos, sin embargo, diferentes proporciones de las células gliales pueden ser deseados, por lo que las culturas más células gliales pueden llevar a cabo para optimizar la composición celular. Este protocolo también puede ser adaptada para el cultivo de neuronas derivadas de otras regiones del cerebro, tales como el hipocampo, para adaptarse a las exigencias particulares de experimentación

Las principales preocupaciones de esta técnica incluyen la prevención de cont bacterianaaminación y la prevención de proliferación glial en la capa neuronal. Este sistema no incluye a los agentes antibióticos, por lo tanto las técnicas de esterilización son especialmente críticos en todas las etapas. Proliferación glial es impedido por la adición del agente anti-mitótico citosina arabinofuranoside, las planchas de baja densidad y el medio de cultivo libre de suero, siguiendo este protocolo debe componer los astrocitos no más de 3-5% de las células en la capa de ^1,4 neuronal y menos del 1% microglia debe ser detectado. Immunopanning u otras técnicas se pueden utilizar para eliminar esta contaminación, incluso las células de baja ^4.

Esta técnica también puede ser modificada por cualquier variedad de co-cultivo de los tipos de células adherentes al aislar un solo tipo de análisis es deseable. Por ejemplo, este sistema se ha adaptado con éxito para analizar los efectos de los osteoblastos en la Ca ^{2 +} señalización en las células del cáncer óseo metastásico ^14.