Summary
यहाँ हम संवर्धन एक glial फीडर परत की उपस्थिति में चूहे cortical न्यूरॉन्स के लिए एक प्रोटोकॉल प्रदान करते हैं. सभ्य न्यूरॉन्स स्थापित polarity और synapses बनाने, और इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी, इमेजिंग कैल्शियम, सेल अस्तित्व assays, immunocytochemistry, और आरएनए / / प्रोटीन अलगाव डीएनए जैसे विभिन्न अनुप्रयोगों में प्रयोग के लिए glia से अलग किया जा सकता है.
Protocol
1. Glia विच्छेदन (~ 2 सप्ताह चढ़ाना न्यूरॉन्स पहले)
- 70% इथेनॉल में विच्छेदन जगह बाँझ उपकरणों के लिए तैयार करने के लिए, पिघलना बर्फ पर 4 एमएल ठंड विच्छेदन मध्यम 60 मिमी व्यंजन (मस्तिष्क प्रति एक डिश), और जगह 2.5% trypsin और DNase जोड़ने के लिए (तालिका छठी में सर्जिकल उपकरणों के बारे में विवरण देखने के ).
- बड़ी कैंची का प्रयोग एक 100 मिमी बाँझ पकवान में 2-4 दिन पुराने पिल्ले और जगह सिर सिर काटना.
- मध्यम कैंची का प्रयोग त्वचा के माध्यम से एक midline कटौती करने और वापस खोपड़ी बेनकाब त्वचा खींच. घुमावदार कैंची का प्रयोग मस्तिष्क के ऊतकों के नीचे हानिकारक के बिना एक midline कटौती और खोपड़ी के माध्यम से दो पार्श्व कटौती, कर. ऊपरी मस्तिष्क बेनकाब खोपड़ी निकालें.
- मस्तिष्क निकालें और इसे अपने स्वयं के 60 मिमी 4 एमएल ठंड विच्छेदन मध्यम युक्त पकवान में जगह है (तालिका देखें मैं रचना के लिए). एक stereomicroscope (Leica 2000 ZOOM, ज़ूम नियंत्रण: 70-30) के तहत पकवान प्लेस और No.5 संदंश का उपयोग करने के लिए गोलार्द्धों अलग, मध्यमस्तिष्क हटायें, और ओ छीलएफएफ meninges.
- ठंड विच्छेदन के माध्यम से एक ताजा 60 मिमी डिश में सभी dissected मस्तिष्क cortices ले लीजिए, और घुमावदार कैंची के साथ ऊतक कीमा.
- एक बाँझ 15 एमएल ट्यूब कीमा बनाया हुआ ऊतक स्थानांतरण. ठंड विच्छेदन के माध्यम से 4.5 एमएल मात्रा लाओ और 2.5% की trypsin के 500 μL जोड़ें. Parafilm में ट्यूब लपेटें और इसे 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में तैरने लगते हैं, हर 5 मिनट उलटा द्वारा मिश्रण.
(नोट: यहाँ हम हम आम तौर पर पालन करें जब 5 दिमाग के लिए ऊपर का उपयोग प्रोटोकॉल का वर्णन है, अगर अधिक पिल्ले का इस्तेमाल कर रहे हैं, मात्रा के लिए उचित रूप से समायोजित किया जा आवश्यकता हो सकती है)
- एक नया 15 एमएल ट्यूब ऊतक स्थानांतरण, trypsin युक्त विच्छेदन पर किया जाता माध्यम की मात्रा कम से कम. ताजा विच्छेदन माध्यम से 4.8mL मात्रा ले आओ और 200 μL DNase जोड़ने के लिए 60 स्नातकीय / एमएल (स्टॉक समाधान: DNase और MgSO4 विच्छेदन के माध्यम से 2 एमएल में 5 मिलीग्राम के 3 मिलीग्राम) की एक अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने. धीरे एक बाँझ 5 एमएल pipet के साथ ~ 20 बार महीन चुर्ण बनानाते, तो glia चढ़ाना माध्यम के 10 एमएल जोड़ने के लिए (तालिका द्वितीय रचना के लिए).
- ऊतक के बड़े टुकड़े करने के लिए 4-5 मिनट के लिए व्यवस्थित की अनुमति दें, तो एक 50ml ट्यूब सेल निलंबन के ऊपर 80% हस्तांतरण. Glia चढ़ाना मध्यम के एक अतिरिक्त 2-3 एमएल (और एक छोटे विंदुक अगर जरूरत का उपयोग) के साथ ऊतक विचूर्णन दोहराएँ, फिर से, ऊतकों को व्यवस्थित करने के लिए अनुमति देते हैं, और पिछले संग्रह करने के लिए शीर्ष 80% जोड़ें. Glia चढ़ाना और 280 पर 15 मिनट के लिए मध्यम अपकेंद्रित्र के साथ 20 एमएल के लिए कुल मात्रा लाओ जी (या एक आईईसी Centra CL2 अपकेंद्रित्र में 1300 rpm).
- सतह पर तैरनेवाला महाप्राण (व्यंजन) और glia चढ़ाना मध्यम में सेल गोली resuspend (लगभग 5-7 एमएल इस्तेमाल किया पिल्ले की संख्या पर निर्भर करता है का उपयोग कर), तो अतिरिक्त चढ़ाना मध्यम जोड़ने के क्रम में प्रत्येक dissected मस्तिष्क के लिए 10 एमएल है. और अच्छी तरह से थाली प्रत्येक 75 सेमी 2 फ्लास्क (यानी फ्लास्क प्रति एक मस्तिष्क) में सेल निलंबन के 10 एमएल मिक्स.
- एक मशीन सेट के 37 में संस्कृति बोतल चाल डिग्री सेल्सियस (5 से 10 सीओ 2%, सोडियम bicarbona के लिए आनुपातिकमध्यम के ते सामग्री). 24-48 घंटे, तो हर 3-4 दिनों के बाद संस्कृति के माध्यम से बदलें.
2. माध्यमिक Glia (चढ़ाना न्यूरॉन्स के 48 घंटे पहले)
- प्रत्येक धोया और autoclaved thermanox की परिधि के चारों ओर पिघल paraplast मोम की 3 छोटे बूँदें जोड़कर thermanox coverslips (अगर न्यूरॉन्स बर्तन पर चढ़ाया जाएगा) तैयार करें. कक्ष thermanox के इस पक्ष पर चढ़ाया जाएगा. हमारे thermanox हस्तनिर्मित पुन: प्रयोज्य ~ 60 मिमी ~ 50 मिमी 2 के माध्यम से drilled छेद के साथ प्लास्टिक (अभिकर्मकों की तालिका छठी देखें) से काट आवेषण हैं, हालांकि व्यावसायिक रूप से उपलब्ध संस्कृति को अच्छी तरह से आवेषण के बजाय इस्तेमाल किया जा सकता है.
- पीबीएस दो बार के साथ प्राथमिक glia धो, सख्ती प्रत्येक फ्लास्क मिलाते हुए किसी भी स्वाधीन कोशिकाओं को हटाने. सहधारा प्राथमिक glia साथ प्रत्येक फ्लास्क लगभग 10 लाख अस्थिकणिका प्रदान करते हैं, इसलिए हम नियमित रूप से प्रयोग प्रति 2-4 बोतल का उपयोग करें.
- 0.05% tryspin - EDTA (1 mL10X 0.5% शेयर trypsin EDTA पीबीएस के 9 एमएल में पतला समाधान) के साथ कोशिकाओं को अलग. कोम्बीपूर्वोत्तर के एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 2 बोतल से कोशिकाओं और glia चढ़ाना मध्यम के एक बराबर राशि जोड़ (अभिकर्मकों के द्वितीय तालिका देखें). 280 जी में 15 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र सतह पर तैरनेवाला महाप्राण (व्यंजन) और glia चढ़ाना मध्यम के कुछ एमएल में glia गोली भंग.
- Hematocytometer का उपयोग कोशिकाओं की गिनती और पतला सेल निलंबन के रूप में की जरूरत (~ 1x10 6 कोशिकाओं / एमएल), थाली या तो 60mm व्यंजन (अगर न्यूरॉन्स coverslips पर चढ़ाया जाएगा) पर, या thermanox coverslips (कोशिकाओं अगर न्यूरॉन्स पर मढ़वाया जाएगा 60 मिमी) व्यंजन. कक्ष प्रति पकवान या thermanox glia चढ़ाना माध्यम का उपयोग 500,000 कोशिकाओं पर चढ़ाया जाना चाहिए. Thermanox coverslips, प्लेट कोशिकाओं के एक dropwise फैशन में 600 μL, तो 2 घंटे और glia चढ़ाना माध्यम से फ्लिप thermanox डूब कोशिकाओं के बाद के मामले में.
- यदि neuronal coverslips के लिए माध्यमिक glia के 60 मिमी व्यंजन की तैयारी, N2.1 मध्यम शाम को बदलने neuronal विच्छेदन पहले.
3. Neuronal विच्छेदनऔर संस्कृति
- प्रत्येक बाँझ coverslip की परिधि के चारों ओर 3 पिघला paraplast मोम की छोटी बूँदें जोड़ने क्रम में शारीरिक रूप से सेल परतों को अलग करने के लिए और सेल scraping को रोकने के द्वारा कांच coverslips (15 मिमी व्यास) तैयार करें. कक्ष coverslip के इस पक्ष पर चढ़ाया जाएगा.
- कोट प्लेटों या 0.5 मिलीग्राम / एमएल polylysine (या तो पाली एल lysine या borate बफर में भंग पाली डी lysine, तालिका छठी देखें) के साथ 2 घंटे या रात भर के लिए coverslips. बाँझ पानी के साथ 2-3 बार धो और पूरी तरह से सूखे की अनुमति. नोट: coverslips एक hydrophobic पेट्री डिश में रखा जाता है spilling / समाधान के प्रसार पाली lysine या सेल चढ़ाना, जो आसानी से अगर coverslips टिशू कल्चर बर्तन में रखा जाता है हो सकता है के साथ कोटिंग के दौरान से बचने के.
- Glia विच्छेदन (1.1 कदम) के लिए के रूप में neuronal विच्छेदन के लिए तैयार है. एक 17 दिन गर्भवती चूहा euthanize, 70% इथेनॉल के साथ फर स्प्रे, और त्वचा के माध्यम से medially कटौती करने के लिए गर्भाशय बेनकाब. सभी भ्रूण निकालें और उन्हें एक में जगहबाँझ 100 मिमी पकवान.
- तेजी से मुक्त टुकड़े करना और प्रत्येक भ्रूण वध करना, अपने स्वयं के 60 मिमी डिश में ठंड विच्छेदन मध्यम (4 एमएल) के साथ प्रत्येक सिर दे. हम सामान्य रूप से प्रयोग प्रति 4-5 भ्रूण टुकड़े करना है के रूप में लगभग 20 लाख न्यूरॉन्स प्रत्येक E17 भ्रूण से निकाली गई है. अगर अधिक भ्रूण की जरूरत है, लगता है कि पूरी प्रक्रिया (3.4 करने के लिए 3,12 कदम से) 9-10 मिनट से पिछले नहीं करता है.
- एक stereomicroscope और No.1/No.5 संदंश का उपयोग खुला त्वचा और खोपड़ी खींच, मस्तिष्क निकालने, अलग गोलार्द्धों, और मध्यमस्तिष्क और meninges हटाने के द्वारा मस्तिष्क cortices अलग.
- ठंड विच्छेदन के माध्यम से एक ताजा 60 मिमी डिश में सभी dissected cortices लीजिए, और घुमावदार कैंची के साथ ~ 1 मिमी टुकड़ों में ऊतक कीमा है.
- एक बाँझ 15 एमएल ट्यूब कीमा बनाया हुआ ऊतक स्थानांतरण. ठंड विच्छेदन के माध्यम से 4.5 एमएल मात्रा लाओ और 2.5% की trypsin के 500 μL जोड़ें. Parafilm में ट्यूब लपेटें और minu 15 के लिए यह एक 36 डिग्री सेल्सियस पानी के स्नान में नावtes, उलटा द्वारा मिश्रण हर 5 मिनट.
- एक नया 15 एमएल ट्यूब ऊतक स्थानांतरण, trypsin युक्त विच्छेदन पर किया जाता माध्यम की मात्रा कम से कम. ताजा विच्छेदन के माध्यम से 4.8 एमएल ले आओ और 200 μL DNase जोड़ने के लिए 60 स्नातकीय / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता तक पहुँचने. महीन चुर्ण बनाना एक बाँझ 5 या 2 एमएल विंदुक के साथ लगभग 10 बार, एक आग पॉलिश पाश्चर (ठंड) विंदुक ऊतक के सबसे अलग कर देना करने के लिए का उपयोग आवश्यक के रूप में इस कदम को दोहराना. फिर ऊतक के शेष टुकड़े (आमतौर पर बहुत कुछ है, यदि कोई हो) 4-5 मिनट के लिए व्यवस्थित करने की अनुमति.
- ऊपरी एकल कक्ष निलंबन निकालें जबकि ऊतक के बसे टुकड़े पीछे छोड़ने, और एक नया ट्यूब में न्यूरॉन चढ़ाना मध्यम के एक बराबर मात्रा (तालिका क्ष्क्ष्क्ष् देखें) के साथ इस समाधान जगह. अच्छी तरह मिक्स लेकिन धीरे, फिर कोशिकाओं की गिनती, 15 मिमी (200 μL में 35,000 कोशिकाओं प्रत्येक) coverslips या 60 मिमी व्यंजन (1x10 6 कोशिकाओं में प्रत्येक 3 एमएल) पर थाली के रूप में की जरूरत है. इनक्यूबेटर (36.5 डिग्री सेल्सियस, 5-10% सीओ 2) कोशिकाओं स्थानांतरण.
- 3-4 घंटे के COMBIN के बादई न्यूरॉन परत और माध्यमिक glia के रूप में निम्नानुसार है. 60 मिमी बर्तन पर न्यूरॉन्स के लिए, गर्म DMEM के साथ कोशिकाओं धोने, सीरम मुक्त माध्यम के 4mL (N2, तालिका चतुर्थ देखें) के माध्यम को बदलने, और प्रत्येक प्लेट (glial कोशिकाओं न्यूरॉन्स का सामना करना पड़ होना चाहिए) glia के साथ एक thermanox जोड़ने. Neuronal coverslips, नीचे का सामना करना पड़ रहा न्यूरॉन्स के साथ हस्तांतरण माध्यमिक glia के प्रत्येक 60 मिमी पकवान के लिए 3 से 5 coverslips.
- न्यूरॉन्स चढ़ाना के बाद 24 घंटे, प्रत्येक पकवान साइटोसिन β-डी - arabinofuranoside के 10 सुक्ष्ममापी जोड़ने के लिए, क्रम में glia प्रसार को रोकने. हम 4 मिमी स्टॉक समाधान तैयार हैं, N2 माध्यम से 1:10 पतला, और 25 / ul प्रत्येक पकवान पतला समाधान के एमएल जोड़ें.
- कक्ष संस्कृति में 7-10 दिनों के बाद प्रयोगों के लिए आम तौर पर उपयोग किया जाता है है, हालांकि सटीक समय वांछित भेदभाव मंच पर निर्भर करता है, वे के लिए किया गया हो गए हैं अस्तित्व में एक महत्वपूर्ण कमी के बिना 4 हफ्तों के लिए. पहले सप्ताह के बाद, यह सिफारिश की है कि मीडिया के एक आधा मात्रा हर हफ्ते प्रतिस्थापित किया.
कुछ घंटे के बाद न्यूरॉन्स सब्सट्रेट करने के लिए संलग्न है, वे lamelliopodia विस्तार शुरू करते हैं. प्रक्रियाओं (2A चित्र) बढ़ाना और संस्कृति में कई दिनों में फूट डालना जारी रखते हैं, और विस्तारित axons और dendrites स्पष्ट रूप से दिखाई (चित्र 2B, MAP2 धुंधला) कर रहे हैं. के रूप में न्यूरॉन्स परिपक्व वृक्ष के समान arbors अधिक विस्तृत हो गया है और वे synaptic संपर्कों को विकसित करने, कई वृक्ष के समान spines चढ़ाना के बाद के बारे में 2-3 सप्ताह 11 दृश्यमान ( चित्र 2C).
चित्रा 1 संवर्धन एक glial फीडर परत (माध्यमिक glia) के साथ चूहे cortical न्यूरॉन्स के लिए प्रक्रिया का प्रवाह चार्ट . सबसे पहले, neuronal विच्छेदन के पहले 11 दिनों, एक प्राथमिक glia संस्कृति नवजात चूहों (P2 4) से तैयार है. जब कोशिकाओं को मिला हुआ हैं (मोटे तौर पर नौ दिनों neuronal विच्छेदन पहले प्राथमिक glia और दो दिन चढ़ाना के बाद), astrocytes mech हैंanically oligodendrocyte अग्रदूत साबित कोशिकाओं और microglia और व्यंजन या thermanox पर चढ़ाया या तो (माध्यमिक glia) से अलग है . न्यूरॉन्स तो E17 भ्रूण और coverslips पर या तो या व्यंजन (पाली lysine के साथ लेपित) पर चढ़ाया cortices से प्राप्त कर रहे हैं. चढ़ाना के बाद चार घंटे, neuronal परत माध्यमिक glia में जोड़ा जाता है.
चित्रा 2 संस्कृतियों के विभिन्न चरणों में उदाहरण (उदाहरण के 5 घंटे, 12 DIV, 21 DIV).. आंकड़े अलग समय बिंदुओं पर coverslips पर cortical न्यूरॉन्स के प्रतिनिधि छवियाँ हैं. बाद न्यूरॉन्स के लिए देते हैं सब्सट्रेट न्यूरॉन्स lamelliopodia विस्तार शुरू. चरण विपरीत छवि चढ़ाना पांच घंटे के बाद कुछ विस्तारित neurites (ए) से पता चलता है. बीच में छवि (बी, कुक एट अल. 2010 से अनुमति के साथ) 12 DIV cortical neuronal वृक्ष के समान MAP2 मार्कर के साथ तय की और immunostained न्यूरॉन्स से पता चलता है. Hoechst धुंधला हो जाना एक counterstai के रूप में इस्तेमाल किया गया थाning. के रूप में न्यूरॉन्स वृक्ष के समान spines परिपक्व भी दिखाई देने लगते हैं (सी). स्केल सलाखों: ए, बी = 25 सुक्ष्ममापी, सी = 10 सुक्ष्ममापी.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल glia कोशिकाओं की उपस्थिति में संवर्धन चूहे प्राथमिक cortical न्यूरॉन्स के लिए एक तरीका प्रदान करता है, जबकि न्यूरॉन्स आसानी से प्रयोगात्मक विश्लेषण के लिए पृथक की अनुमति. एक स्वस्थ neuronal phenotype के glia समर्थन विकास, जबकि physiologically प्रासंगिक तरीके में प्रयोगात्मक उपचार के लिए भी modulating neuronal प्रतिक्रियाओं. इसके अतिरिक्त, न्यूरॉन्स इस सेल की आबादी चुनिंदा astrocytes में समृद्ध हो जाता है के साथ संवर्धन पहले प्राथमिक glia passaging, जिससे सूजन microglial उत्तेजना को रोकने के द्वारा. प्रयोगों के कुछ प्रकार के लिए, तथापि, glial कोशिकाओं के विभिन्न अनुपात, वांछित हो सकता है इस प्रकार अतिरिक्त glia संस्कृतियों इस सेलुलर संरचना का अनुकूलन करने के लिए किया जा सकता है है. इस प्रोटोकॉल भी अन्य मस्तिष्क क्षेत्रों से प्राप्त संवर्धन, जैसे हिप्पोकैम्पस न्यूरॉन्स, के लिए अनुकूलित किया जा सकता है है के लिए विशेष रूप से प्रयोगात्मक मांगों फिट
इस तकनीक का प्रमुख चिंताओं बैक्टीरियल cont को रोकने में शामिलamination और neuronal परत में glial प्रसार को रोकने. इस प्रणाली के एंटीबायोटिक एजेंट शामिल नहीं करता, इस प्रकार बाँझ तकनीक सभी स्तरों पर विशेष रूप से महत्वपूर्ण हैं. Glial प्रसार विरोधी mitotic एजेंट साइटोसिन arabinofuranoside, कम घनत्व चढ़ाना और सीरम मुक्त मध्यम संस्कृति के अलावा से रोका है, इस प्रोटोकॉल astrocytes निम्नलिखित neuronal परत 1,4 में कक्षों की कोई 3-5% से रचना चाहिए और कम से कम 1% microglia पता होना चाहिए. Immunopanning या अन्य तकनीकों के लिए यह भी कम glia 4 संदूषण को निकालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
इस तकनीक को भी सह संवर्धन पक्षपाती सेल प्रकार के किसी भी किस्म के लिए संशोधित किया जा सकता है जब विश्लेषण के लिए एक एकल प्रकार अलग वांछनीय है. उदाहरण के लिए, इस प्रणाली को सफलतापूर्वक 2 Ca पर अस्थिकोरक के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया गया + हड्डी metastatic कैंसर कोशिकाओं 14 में संकेत.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
लेखकों पिछले प्रयोगशाला के सदस्यों को जो इस प्रोटोकॉल का शोधन और पिछले कुछ वर्षों में समर्थन के लिए NIH (DA19808 और DA15014 ओम) योगदान धन्यवाद. अन्ना 1 Abt "अंतःविषय और translational neuroAIDS में अनुसंधान और प्रशिक्षण" (T32 MH078795) के एक साथी है, इस प्रकार, इस काम के हिस्से में रुथ एल Kirschstein राष्ट्रीय अनुसंधान सेवा 5T32MH079785 पुरस्कार के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान के द्वारा समर्थित किया गया था.
References
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