Bilaminar Co-kultur Primary Rat kortikale nevroner og gliaceller

Summary

Her tilbyr vi en protokoll for dyrking rotte kortikale nevroner i nærvær av en glial mater lag. Den dyrkede nerveceller etablere polaritet og skape synapser, og kan skilles fra gliaceller for bruk i ulike programmer, som elektrofysiologi, kalsium bildebehandling, celle overlevelse analyser, immunocytochemistry, og RNA / DNA / protein isolasjon.

Abstract

Denne videoen vil guide deg gjennom prosessen med dyrking rotte kortikale nevroner i nærvær av en glial mater lag, et system kjent som en bilaminar eller co-kulturen modell. Dette systemet er egnet for en rekke eksperimentelle behov som krever enten et glass eller plast vekst substrat, og kan også brukes til kultur for andre typer nerveceller.

Rat kortikale nevroner hentet fra slutten av fosterstadiet (E17) er belagt på glass Dekkglass eller vev kultur retter overfor en mater lag av gliaceller vokst på oppvasken eller plast Dekkglass (kjent som Thermanox), henholdsvis. Valget mellom de to konfigurasjoner avhenger av den aktuelle eksperimentelle teknikken som brukes, noe som kan kreve, eller ikke, er at nervecellene vokst på glass (f.eks kalsium bildebehandling versus Western blot). Den glial mater lag, en astroglia-beriket sekundære kultur blandet gliaceller, er separat forberedt fra cortices av nyfødte rotteunger (P2-4) før neuronaldisseksjon.

En stor fordel med denne kulturen system i forhold til en kultur av nerveceller er bare støtte av neuronal vekst, overlevelse, og differensiering leveres av trofiske faktorer skilles fra glial mater laget, som mer nøyaktig ligner hjernen miljøet in vivo. Videre kan co-kulturen brukes til å studere neuronal-glial interaksjoner ^1.

Samtidig er gliaceller forurensning i nevronale lag hindres av ulike virkemidler (low density kultur, tillegg av mitotisk hemmere, mangel på serum og bruk av optimalisert kultur medium) fører til en nesten ren nevrale lag, kan sammenlignes med andre etablerte metoder ^{1 -3.} Nevroner kan lett skilles fra glial lag når som helst under kultur og brukes til ulike eksperimentelle applikasjoner som spenner fra ⁴ elektrofysiologi, cellulær og molekylær biologi ^5-8, biokjemi ^5, bildebehandling og microscopy ^4,6,7,9,10. Den primære nevroner utvide axoner og dendritter å danne funksjonelle synapser ^11, en ​​prosess som ikke er observert i neuronal cellelinjer, selv om noen cellelinjer gjør utvide prosesser.

En detaljert protokoll av dyrkning rotte hippocampus nevroner bruker denne co-kulturen system har blitt beskrevet tidligere ^4,12,13. Her har vi detalj en modifisert protokoll egnet for kortikale nevroner. Som omtrent 20x10 ⁶ celler er gjenvunnet fra hver rotte embryo, er denne metoden spesielt nyttig for eksperimenter som krever et stort antall nevroner (men ikke bekymret for en svært homogen neuronal befolkningen). Utarbeidelse av nevroner og gliaceller må planlegges i en tid-spesifikk måte. Vi vil gi trinn-for-steg protokoll for dyrking rotte kortikale nevroner samt dyrking gliaceller å støtte nervecellene.

Protocol

1. Gliaceller Dissection (~ 2 uker før plating nevroner)

1. Å forberede seg til disseksjon sted sterile verktøy i 70% etanol, tilsett 4 mL kaldt disseksjon medium til 60 mm retter (ett fat per hjernen), og plassere 2,5% trypsin og DNase på is for å tine (se detaljer om kirurgisk verktøy i tabell VI ).
2. Bruk stor saks til å halshogge 2-4 dager gamle valper og sted hoder i en 100 mm steril parabolen.
3. Bruk medium saks å lage en midtlinje skjære gjennom huden og trekke tilbake huden å avsløre skallen. Bruk buet saks å lage en midtlinjen kutt og to laterale skjærer gjennom skallen, uten å skade hjernevevet under. Fjern den øverste hodeskallen å avsløre hjernen.
4. Pakk hjernen og plassere den på sin egen 60 mm parabol inneholder 4 ml kald disseksjon medium (se tabell jeg for sammensetning). Sett fatet under en stereomikroskop (Leica 2000 ZOOM, zoom-kontroll: 70-30) og bruk No.5 tang til å skille halvkuler, fjerne midthjernen, og skrelle off hjernehinnene.
5. Samle alle dissekert cerebral cortices i en frisk 60 mm tallerken med kaldt disseksjon medium, og hakke vevet med buet saks.
6. Overfør hakket vevet til et sterilt 15 ml tube. Ta med volumet til 4,5 ml med kaldt disseksjon medium og tilsett 500 mL 2,5% trypsin. Pakk røret i Parafilm og flyter den i en 37 ° C vannbad i 15 minutter, blanding av inversjon hvert 5. minutt.

   (Merk: vi her beskrive protokollen vi generelt følge når jeg bruker inntil 5 hjerner, hvis flere unger blir brukt, kan volumene må justeres korrekt)

7. Overfør vev til en ny 15 ml tube, reduserer volumet av trypsin inneholder disseksjon medium båret over. Kok opp volumet til 4.8mL med fersk disseksjon medium og tilsett 200 mL DNase å nå en endelig konsentrasjon på 60 ug / ml (stamløsning: 3 mg av DNase og 5 mg MgSO4 i 2 mL av disseksjon medium). Triturate forsiktig ~ 20 ganger med en steril 5 mL pipettete, deretter legge til 10 mL av gliaceller plating medium (se tabell II for sammensetning).
8. Tillate store biter av vev til takke med 4-5 minutter, deretter overføre den øverste 80% av cellesuspensjon til en 50ml tube. Gjenta vev trituration med ytterligere 2-3 ml av gliaceller plating medium (og bruker en mindre pipette hvis nødvendig); igjen, la vevet å bosette seg, og legge den øverste 80% til den forrige samlingen. Ta det totale volumet til 20 ml med gliaceller plating medium og sentrifuger i 15 minutter ved 280 g (eller 1300 rpm i en IEC Centra CL2 sentrifuge).
9. Aspirer supernatanten og resuspender cellen pellet i gliaceller plating medium (omtrent bruke 5-7 ml avhengig av hvor mange unger som brukes), deretter legge til flere plating medium for å ha 10 ml for hver hjernen dissekert. Bland godt og plate 10 mL av cellesuspensjon i hver 75 cm ² kolben (dvs. en hjerne per kolbe).
10. Flytt kultur flasks til en inkubator innstilt på 37 ° C (5 til 10% CO2, proporsjonal med natrium bicarbonaTe innholdet i medium). Endre kultur medium etter 24-48 timer, deretter hver 3-4 dager.

2. Sekundær gliaceller (48 timer før plating nevroner)

1. Forbered thermanox Dekkglass (hvis nevronene vil bli belagt på oppvasken) ved å legge 3 små dråper av smeltet paraplast voks rundt omkretsen av hver vasket og autoklaveres thermanox. Celler vil bli belagt på denne siden av thermanox. Våre thermanox er håndlaget gjenbrukbare ~ 60 mm innstikk kuttet fra plast (se tabell VI av reagenser) med ~ 50 2 mm hull boret gjennom, selv kommersielt tilgjengelig kultur vel inserts kan brukes i stedet.
2. Vask primære gliaceller med PBS to ganger, kraftig risting hver kolbe til å fjerne ethvert fristilt celler. Hver flaske med confluent primære gliaceller vil gi om lag 10 millioner astroglia derfor vi bruker jevnlig 2-4 kolber per eksperiment.
3. Løsne cellene med 0,05% tryspin-EDTA (1 mL10X 0,5% trypsin-EDTA stamløsningen fortynnes i 9 mL PBS). Combine cellene fra 2 kolber i ett 50 ml konisk rør og legge like mye gliaceller plating medium (se tabell II av reagenser). Sentrifuger i 15 minutter ved 280 g. Aspirer supernatanten og oppløse gliaceller pellet i noen mL av gliaceller plating medium.
4. Telle cellene ved hjelp av en hematocytometer og fortynne cellesuspensjonen etter behov (~ 1x10 ⁶ celler / ml); plate cellene enten på 60mm retter (hvis nevronene vil bli belagt på Dekkglass), eller på thermanox Dekkglass (hvis nevronene vil bli belagt på 60 mm retter). Cellene skal være belagt med 500 000 celler per parabol eller thermanox bruker gliaceller plating medium. I tilfelle av thermanox Dekkglass, plate 600 mL av celler i en dropwise mote, så etter 2 timer flip thermanox og senk celler i gliaceller plating medium.
5. Hvis forbereder 60 mm retter av sekundære gliaceller for nevrale Dekkglass, endre medium til N2.1 kvelden før neuronal disseksjon.

3. Neuronal Dissectionog kultur

1. Forbered glass Dekkglass (15 mm diameter) ved å legge 3 små dråper av smeltet paraplast voks rundt omkretsen av hver sterile dekkglass, for å fysisk skille cellelagene og forhindre celle skraping. Celler vil bli belagt på denne siden av dekkglass.
2. Coat plater eller Dekkglass med 0,5 mg / ml polylysine (enten poly-L-lysin eller poly-D-lysin oppløst i borat buffer, se tabell VI) i 2 timer eller over natten. Vask med sterilt vann 2-3 ganger og la det tørke helt. Merk: Dekkglass er plassert i en hydrofob petriskål for å unngå søl / spredning av løsningene under belegget med poly-lysin eller celle plating, som lett kan oppstå hvis Dekkglass er plassert i vevskultur retter.
3. Forberede seg til neuronal disseksjon som for gliaceller disseksjon (trinn 1.1). Avlive en 17-dagers gravid rotte, spray pelsen med 70% etanol, og kutte medialt gjennom huden for å avsløre livmor. Fjern alle fostre og plassere dem i ensterile 100 mm parabolen.
4. Raskt dissekere gratis og halshogge hvert foster, plassere hvert hode i sin egen 60 mm parabolen med kaldt disseksjon medium (4 ml). Vi vanligvis dissekere 4-5 fostre per eksperiment 20 millioner nevroner er utledet fra hver E17 fosteret. Hvis flere embryo er nødvendig, sørge for at hele prosedyren (fra trinn 03.04 til 03.12) ikke varer mer enn 90-100 minutter.
5. Ved hjelp av en stereomikroskop og No.1/No.5 tang isolere cerebral cortices ved å trekke åpne huden og hodeskallen, utpakking av hjernen, skille halvkuler, og fjerne midthjernen og hjernehinnene.
6. Samle alle dissekert cortices i en fersk 60 mm tallerken med kaldt disseksjon medium, og hakke vevet med buet saks inn ~ 1 mm stykker.
7. Overfør hakket vevet til et sterilt 15 ml tube. Ta med volumet til 4,5 ml med kaldt disseksjon medium og tilsett 500 mL 2,5% trypsin. Pakk røret i Parafilm og flyter den i en 36 ° C vannbad i 15 Minutes, blanding av inversjon hvert 5. minutt.
8. Overfør vev til en ny 15 ml tube, reduserer volumet av trypsin inneholder disseksjon medium båret over. Ta til 4,8 ml med fersk disseksjon medium og tilsett 200 mL DNase å nå en endelig konsentrasjon på 60 ug / ml. Triturate omtrent 10 ganger med en steril 5 eller 2 mL pipette, gjenta dette trinnet som nødvendig med en brann-polert (kald) Pasteur pipette å distansere de fleste vev. Så la resterende biter av vev (generelt svært få, om noen) å slå seg ned i 4-5 minutter.
9. Fjern den øverste encellede suspensjon mens etterlater slo stykker av vev, og plasser denne løsningen i en ny tube med et likt volum av nervecellen plating medium (se tabell III). Bland godt, men forsiktig, deretter telle cellene; plate på 15 mm Dekkglass (35.000 celler hver i 200 mL) eller 60 mm retter (1x10 ⁶ celler hver i 3 ml) etter behov. Overfør cellene til inkubatoren (36,5 ° C, 5-10% CO2).
10. Etter 3-4 timer kombineree nervecellen laget og den sekundære gliaceller som følger. For nevroner på 60 mm oppvasken, vaske cellene med varm DMEM, endre medium til 4ml av serum fritt medium (N2, se tabell IV), og legge til ett thermanox med gliaceller til hver plate (gliaceller skal vende nervecellene). For neuronal Dekkglass, transfer 3-5 Dekkglass til hver 60 mm rett av sekundær gliaceller, med nervecellene vendt nedover.
11. 24 timer etter plating nervecellene, tilsett 10 mM av cytosin-β-D-arabinofuranoside til hver rett, for å forhindre gliaceller spredning. Vi forbereder 4 mm lager løsninger, fortynnes 1:10 med N2 medium, og legge til 25 UL / ml fortynnet løsning til hver rett.
12. Cellene er vanligvis brukt til eksperimenter etter 7-10 dager i kultur, men eksakt tid avhenger ønsket differensiering scenen, de har blitt dyrket i opptil 4 uker uten en betydelig reduksjon i overlevelse. Etter den første uken, anbefales det at halvparten volum av media skiftes ut hver uke.

Et par timer etter nevroner har festet til underlaget, begynner de å utvide lamelliopodia. Prosesser fortsette å forlenge (fig 2A) og polariserer over flere dager i kultur, og utvidet axoner og dendritter er klart synlig (Fig. 2B; MAP2 flekker). Som nevronene modne blitt dendrittiske arbors mer forseggjort og utvikle de synaptiske kontakter, ca 2-3 uker etter plating mange dendritic spines er synlige (fig 2C) ^11.

Figur 1. Flow diagram av prosedyren for dyrking rotte kortikale nevroner sammen med en glial mater lag (sekundær gliaceller). Først 11 dager før neuronal disseksjon, er en primær gliaceller kultur forberedt fra neonatal rotter (P2-4). Når cellene er confluent (omtrent ni dager etter plating det primære gliaceller og to dager før neuronal disseksjon), astrocytes er mechanically adskilt fra oligodendrocyte forløperen celler og microglia og belagt enten på serviset eller thermanox (sekundær gliaceller). Nevronene blir deretter hentet fra cortices av E17 embryoer og belagt enten på Dekkglass eller retter (belagt med poly-lysin). Fire timer etter plating er neuronal lag lagt til den sekundære gliaceller.

Figur 2 Eksempler på kulturer i ulike faser (f.eks 5 timer, 12 DIV, 21 DIV).. Tallene er representative bilder av kortikale nevroner på Dekkglass ved ulike tidspunkt. Etter nevronene feste til underlaget nervecellene begynner å forlenge lamelliopodia. Fasekontrast Bildet viser noen få utvidet neurites fem timer etter plating (A). Bildet i midten (B, fra Cook et al. 2010, med tillatelse) viser 12 DIV kortikale nevroner fast og immunostained med neuronal dendrittiske markør MAP2. Hoechst farging ble brukt som counterstaiNing. Som nevroner modne dendrittiske spines også bli synlig (C). Scale barer: A, B = 25 mikrometer, C = 10 mikrometer.

Discussion

Denne protokollen gir en metode for dyrking rotte primære kortikale nevroner i nærvær av gliaceller celler, samtidig som nervecellene skal være lett isolert for eksperimentell analyse. Den gliaceller støtte utviklingen av en sunn neuronal fenotype, mens også modulerende nevrale responser til eksperimentelle behandlinger i en fysiologisk relevant måte. I tillegg, ved passaging den primære gliaceller før dyrking med nevroner denne cellen befolkning blir selektivt anriket i astrocytes, og dermed hindre inflammatorisk microglial stimulering. For visse typer eksperimenter, derimot, kan ulike andeler av gliaceller være ønsket, og dermed ekstra gliaceller kulturer kan utføres for å optimalisere denne cellulære komposisjon. Denne protokollen kan også være tilrettelagt for dyrking neuroner avledet fra andre områder av hjernen, som for eksempel hippocampus, for å passe spesielt eksperimentell krav

Major bekymringer av denne teknikken er å forebygge bakteriell fortsamination og forebygge glial spredning inn i nevronale lag. Dette systemet inkluderer ikke antibiotika agenter, og dermed sterile teknikker er spesielt viktig på alle trinn. Glial spredning hindres ved tilsetning av anti-mitotisk middel cytosine arabinofuranoside, den lave tettheten platekledning og serum-free kultur medium; etter denne protokoll astrocytes bør komponere ikke mer enn 3-5% av cellene i nevronale lag ^1,4 og mindre enn 1% microglia skulle bli oppdaget. Immunopanning eller andre teknikker kan brukes til å fjerne selv denne lave gliaceller forurensning ^fire.

Denne teknikken kan også endres for co-dyrking noen forskjellige tilhenger celletyper når isolere en enkelt type for analyse er ønskelig. For eksempel ble dette systemet vellykket tilpasset for å analysere effekten av osteoblaster på Ca ^{2 +} signalering i bein-metastaserende kreftceller ^14.