Bilaminar Co-cultura de neurônios de rato Primária Cortical e Glia

Summary

Aqui nós fornecemos um protocolo para a cultura de neurônios corticais de ratos na presença de uma camada de alimentação glial. Os neurônios cultivados estabelecer polaridade e criar sinapses, e pode ser separada da glia para uso em diversas aplicações, tais como eletrofisiologia, imageamento de cálcio, ensaios de sobrevivência celular, imunocitoquímica e RNA / DNA / isolamento de proteínas.

Abstract

Este vídeo irá guiá-lo através do processo de neurônios corticais de ratos cultura na presença de uma camada glial alimentador, um sistema conhecido como um bilaminar ou co-cultura modelo. Este sistema é adequado para uma variedade de necessidades experimental exigindo um vidro de substrato de crescimento ou de plástico e também pode ser usado para a cultura de outros tipos de neurônios.

Neurônios de rato cortical obtidos a partir da fase tardia embrionário (E17) são semeadas em lamínulas ou pratos de cultura de tecidos de frente para uma camada de alimentador de glia cultivadas em pratos de plástico ou lamelas (conhecido como Thermanox), respectivamente. A escolha entre as duas configurações depende da técnica específica experimental usado, o que pode exigir, ou não, que os neurônios são cultivados em vidro (por exemplo, imagens de cálcio em relação Western blot). A camada glial alimentador, uma cultura astroglia enriquecido secundária de glia mista, é separado preparado a partir do córtex de filhotes de ratos recém-nascidos (P2-4) antes da neuronaldissecção.

Uma grande vantagem deste sistema de cultura em relação a uma cultura de neurônios é apenas o suporte de crescimento neuronal, sobrevivência e diferenciação proporcionada por factores tróficos secretados a partir da camada alimentador glial, que se assemelha mais precisão o ambiente do cérebro in vivo. Além disso, a co-cultura pode ser usado para estudar as interações neuronal ^glial-1.

Ao mesmo tempo, a contaminação glia na camada neuronal é impedido por diferentes meios (cultura de baixa densidade, além dos inibidores da mitose, a falta de soro e uso de meio de cultura otimizado), levando a uma camada praticamente pura neuronal, comparável a outros métodos estabelecidos ^{um -3.} Neurônios podem ser facilmente separados da camada glial a qualquer momento durante a cultura e utilizadas para diferentes aplicações experimentais que vão de eletrofisiologia ^4, biologia celular e molecular ^5-8, bioquímica ^5, de imagem e microfoneroscopy ^4,6,7,9,10. Os neurônios primários estender axônios e dendritos para formar sinapses funcionais ^11, um processo que não é observado em linhagens de células neuronais, embora algumas linhagens celulares se estendem processos.

Um protocolo detalhado de neurônios do hipocampo de ratos cultura usando este sistema de co-cultura tem sido descrito anteriormente ^4,12,13. Aqui detalhamos um protocolo modificado adequado para neurônios corticais. Como cerca de 20x10 ⁶ células são recuperados de cada embrião de rato, este método é particularmente útil para experimentos que requerem um grande número de neurônios (mas não preocupado com uma população altamente homogênea neuronal). A preparação de neurônios e células gliais precisa ser planejada de maneira tempo específico. Vamos fornecer o protocolo passo a passo para os neurônios corticais de ratos cultura, bem como a cultura de células gliais para apoiar os neurônios.

Protocol

1. Dissection glia (~ 2 semanas antes de neurônios plating)

1. Para se preparar para as ferramentas de dissecção lugar estéril em etanol 70%, adicione 4 mL de médio dissecção fria para 60 pratos mm (um prato por cérebro), e coloque 2,5% de tripsina e DNase no gelo a derreter (ver detalhes sobre instrumentos cirúrgicos na tabela VI ).
2. Use uma tesoura grande para decapitar 2-4 dias de idade os filhotes e as cabeças coloque num prato de 100 milímetros estéril.
3. Use uma tesoura média para fazer um corte na linha média através da pele e puxar a pele para expor o crânio. Use uma tesoura curva para fazer um corte na linha média e dois cortes laterais através do crânio, sem danificar o tecido cerebral por baixo. Remova a parte superior do crânio para expor o cérebro.
4. Extrair o cérebro e colocá-lo em seu prato milímetros própria 60 contendo 4 ml de meio de dissecação a frio (ver tabela I para composição). Coloque o prato sob um estereomicroscópio (Leica ZOOM 2000, zoom de controle: 7-30) e utilize uma pinça No.5 para separar os hemisférios, remova o mesencéfalo, e descasque off as meninges.
5. Recolher todos os córtices cerebral dissecado em um prato fresco 60 milímetros, com média dissecação fria, mince e do tecido com uma tesoura curva.
6. Transferência do tecido picada a um tubo mL estéreis 15. Obter um volume de 4,5 mL, com média dissecação fria e adicionar 500 mL de tripsina 2,5%. Enrole o tubo em Parafilm e flutuar em banho-maria a 37 ° C por 15 minutos, misturando por inversão a cada 5 minutos.

   (Nota: aqui descrevemos o protocolo que geralmente seguem ao usar até 5 cérebros, se os filhotes são mais usados, volumes podem precisar de ser ajustado adequadamente)

7. Transfira o tecido para um tubo novo mL 15, minimizando o volume de meio contendo tripsina dissecção transitadas. Obter um volume de 4.8mL com meio de dissecção frescos e adicionar 200 mL DNase para alcançar uma concentração final de 60 ug / mL (solução estoque: 3 mg de DNase e 5 mg MgSO4 em 2 mL de meio de dissecção). Triturar gentilmente ~ 20 vezes com uma pipeta estéril 5 mLte, em seguida, adicione 10 mL de meio de revestimento de glia (ver tabela II para a composição).
8. Permitir que grandes pedaços de tecido que se contentar com 4-5 minutos, em seguida, transferir os 80% superior da suspensão de células para um tubo de 50 ml. Repita a trituração do tecido com um adicional de 2-3 mL de médio plating glia (e usando uma pequena pipeta, se necessário); mais uma vez, permitir que o tecido para resolver, e adicionar os 80% superior à coleção anterior. Trazer o volume total de 20 mL com meio glia chapeamento e centrifugar por 15 minutos a 280 g (ou 1300 rpm em uma centrífuga IEC Centra CL2).
9. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em meio de revestimento de glia (cerca de 5-7 mL usando dependendo do número de filhotes usados); em seguida, adicione meio de revestimento adicional, a fim de ter 10 mL para cada cérebro dissecado. Misture bem e placa 10 mL de suspensão de células em cada frasco de 75 cm ² (ou seja, um cérebro por frasco).
10. Mova frascos de cultura a um conjunto de incubadora a 37 ° C (5% a 10 CO2; proporcional à bicarbona de sódiote conteúdo do meio). Alterar meio de cultura após 24-48 horas, depois a cada 3-4 dias.

2. Glia secundário (48 horas antes de neurônios plating)

1. Prepare thermanox lamínulas (se os neurônios serão semeadas em pratos) pela adição de 3 gotas de cera derretida paraplast em torno da circunferência de cada thermanox lavada e autoclavada. Células serão plaqueadas sobre este lado da thermanox. Nosso thermanox são feitas à mão insere reutilizáveis ​​~ 60 milímetros de corte de plástico (ver tabela VI de reagentes) com dois furos ~ 50 milímetros perfurado completamente, embora a cultura disponíveis comercialmente bem inserções podem ser usados ​​no lugar.
2. Lavar a glia primária com PBS duas vezes, agitando vigorosamente cada frasco para remover as células solto. Cada frasco com glia principal confluentes irá fornecer cerca de 10 milhões astroglia, por isso usam regularmente 2-4 frascos por experimento.
3. Separar as células com 0,05% tryspin-EDTA (1 mL10X solução estoque de 0,5% de tripsina-EDTA diluída em 9 mL de PBS). Combine as células de 2 frascos em um tubo de 50 mL cônico e adicionar uma quantidade igual de médio plating glia (ver tabela II de reagentes). Centrifugar por 15 minutos a 280 g. Aspirar o sobrenadante e dissolver o sedimento em glia alguns mililitros de meio de chapeamento glia.
4. Contar as células usando uma hematocytometer e diluir a suspensão de células necessárias (~ 1x10 ⁶ células / mL); placa as células tanto em pratos de 60 milímetros (se os neurônios serão semeadas em lamínulas), ou em lamínulas thermanox (se os neurônios serão semeadas em 60 pratos mm). As células devem ser banhado em 500.000 células por prato ou thermanox usando médio plating glia. No caso de thermanox lamínulas, 600 mL placa de células de uma forma gota a gota, em seguida, após 2 horas thermanox flip e células submergir em meio plating glia.
5. Se preparar 60 pratos mm de glia secundário para lamínulas neuronal, a mudança de médio a N2.1 na noite anterior à dissecção neuronal.

3. Dissection neuronale Cultura

1. Prepare lamínulas de vidro (15 mm de diâmetro) pela adição de 3 gotas de cera derretida paraplast em torno da circunferência de cada lamela estéril, a fim de separar fisicamente as camadas de células e prevenir a raspagem de células. Células serão plaqueadas sobre este lado da lamela.
2. Revestir as placas ou lamelas com 0,5 mg / mL polilisina (ou poli-L-lisina ou poli-D-lisina dissolvido em tampão borato; ver tabela VI) por 2 horas ou durante a noite. Lavar com água estéril 2-3 vezes e deixe secar completamente. Nota: lamínulas são colocados numa placa de Petri hidrofóbicos para evitar o derramamento / disseminação das soluções durante o revestimento com revestimento de poli-lisina ou célula, que pode facilmente ocorrer se as lamelas são colocadas em placas de cultura de tecidos.
3. Prepare-se para a dissecção neuronal como para a dissecção glia (passo 1.1). Euthanize um rato de 17 dias de gravidez, pulverizar a pele com álcool 70%, e corte medialmente através da pele para expor o útero. Remover todos os fetos e colocá-los em umprato milímetros estéril 100.
4. Rapidamente dissecar livre e decapitar cada feto, colocando cada cabeça em seu prato milímetros própria 60 com média dissecação fria (4 mL). Nós normalmente dissecar fetos 4-5 por experiência como aproximadamente 20 milhões de neurônios são derivados de cada feto E17. Se os embriões são necessários mais, certifique-se que todo o procedimento (a partir do passo 3,4-3,12) não duram mais de 9-10 minutos.
5. Usando um microscópio estereoscópico e No.1/No.5 forceps isolar o córtex cerebral, puxando abrir a pele e crânio, extrair o cérebro, separando os hemisférios, e remoção do mesencéfalo e meninges.
6. Recolher todos os córtices dissecada em um prato fresco 60 milímetros, com média dissecação fria, mince e do tecido com tesoura curva em pedaços ~ 1 mm.
7. Transferência do tecido picada a um tubo mL estéreis 15. Obter um volume de 4,5 mL, com média dissecação fria e adicionar 500 mL de tripsina 2,5%. Enrole o tubo em Parafilm e flutuar em um banho de água 36 ° C por 15 minutes, misturando por inversão a cada 5 minutos.
8. Transfira o tecido para um tubo novo mL 15, minimizando o volume de meio contendo tripsina dissecção transitadas. Trazer para 4,8 mL com meio dissecção frescos e adicionar 200 mL DNase para alcançar uma concentração final de 60 ug / mL. Triturar cerca de 10 vezes com uma pipeta estéril de 5 ml ou 2; repita esta etapa, se necessário usando um fogo-polido (frio) pipeta Pasteur para dissociar a maior parte do tecido. Então permitir que os pedaços de tecido (em geral, muito poucos, se houver) para resolver por 4-5 minutos.
9. Remover a suspensão de uma única célula superior, deixando para trás pedaços de tecido resolvido, e colocar essa solução em um novo tubo com igual volume de meio neurônio chapeamento (ver tabela III). Misture bem, mas com cuidado, em seguida, contar as células; placa em 15 lamínulas mm (35.000 células em 200 mL cada) ou 60 pratos mm (1x10 ⁶ células em cada 3 mL), conforme necessário. Transferência de células para a incubadora (36,5 ° C, 5-10% CO2).
10. Depois de 3-4 horas combine da camada de neurônio ea glia secundário como se segue. Para os neurônios em 60 pratos mm, lavar as células com DMEM quente, mudar a médio e 4 ml de meio livre de soro (N2, veja a tabela IV), e adicionar um thermanox com glia para cada placa (células gliais deve estar voltado para os neurônios). Para lamínulas neuronal, transferência 3-5 lamínulas para cada prato 60 milímetros de glia secundário, com os neurônios voltado para baixo.
11. 24 horas após o plaqueamento os neurônios, adicionar 10 mM de citosina-β-D-arabinofuranoside para cada prato, a fim de evitar a proliferação da glia. Preparamos quatro soluções estoque mM, diluir 1:10 com o meio N2, e adicionar 25 uL / ​​mL da solução diluída para cada prato.
12. As células são geralmente utilizados para experimentos após 7-10 dias em cultura, embora o tempo exato depende estágio de diferenciação desejado, pois eles têm sido cultivados por até 4 semanas sem uma redução significativa na sobrevida. Após a primeira semana, recomenda-se que a metade do volume de meios de ser substituído a cada semana.

Poucas horas depois de neurônios ter anexado ao substrato, eles começam a estender lamelliopodia. Processos de continuar a alongar (Fig 2A) e polarizar longo de vários dias em cultura, e os axônios e dendritos estendida são claramente visíveis (Fig 2B; MAP2 coloração). Neurônios maduros como os mandris dendríticas tornam-se mais elaboradas e desenvolvem contatos sinápticos, cerca de 2-3 semanas após o plaqueamento muitas espinhas dendríticas são visíveis (Fig 2C) ^11.

Figura 1. Fluxograma do procedimento para os neurônios de rato cultura cortical junto com uma camada de alimentação glial (células gliais secundário). Em primeiro lugar, 11 dias antes da dissecção neuronal, uma cultura de glia principal é preparado a partir de ratos recém-nascidos (P2-4). Quando as células são confluentes (cerca de nove dias após o plaqueamento da glia primário e dois dias antes da dissecção neuronal), os astrócitos são mechanically separados a partir de células precursoras de oligodendrócitos e microglia e banhado tanto em pratos ou thermanox (glia secundário). Neurônios são então obtidos a partir do córtex de embriões E17 e banhado quer em lamelas ou em pratos (revestidas com poli-lisina). Quatro horas após o plaqueamento, a camada neuronal é adicionado à glia secundário.

Figura 2 Exemplos de culturas em várias fases (por exemplo, 5 horas, 12 DIV, 21 DIV).. Números são imagens representativas de neurônios corticais em lamínulas em momentos diferentes. Depois de neurônios anexar ao substrato neurônios começam a estender lamelliopodia. Imagem de contraste de fase mostra uma neurites poucos estendida cinco horas após o plaqueamento (A). A imagem no meio (B, de Cook et al. 2010, com permissão) mostra 12 neurônios corticais DIV fixa e histoquímica com o marcador neuronal MAP2 dendríticas. Coloração Hoechst foi usado como um counterstaining. Como neurônios maduros espinhas dendríticas também se tornam visíveis (C). Barras de escala: A, B = 25 mm; C = 10 mM.

Discussion

Este protocolo fornece um método para cultura primária de neurônios corticais de ratos na presença de células da glia, permitindo que os neurônios para ser facilmente isolado para análise experimental. O apoio ao desenvolvimento glia de um fenótipo neuronal saudáveis, ao mesmo tempo, modulando respostas neuronal para tratamentos experimentais de forma fisiologicamente relevantes. Além disso, por passaging da glia primária antes de cultura com os neurônios desta população de células torna-se seletivamente enriquecido em astrócitos, evitando assim a estimulação microglial inflamatórias. Para certos tipos de experimentos, no entanto, diferentes proporções de células gliais pode ser desejado, assim, culturas glia adicionais podem ser realizados para otimizar essa composição celular. Este protocolo também pode ser adaptado para os neurônios cultura derivada de outras regiões do cérebro, tais como o hipocampo, para atender demandas particulares experimental

Principais preocupações desta técnica incluem a prevenção cont bacterianaaminação e prevenir a proliferação glial na camada neuronal. Este sistema não inclui antibióticos, assim, técnicas estéreis são especialmente crítico em todas as fases. Proliferação glial é impedido pela adição do agente anti-mitótico citosina arabinofuranoside, o revestimento de baixa densidade e o meio de cultura sem soro; seguindo este protocolo astrócitos devem compor não mais do que 3-5% de células na camada de ^1,4 neuronal e menos de 1% microglia devem ser detectados. Immunopanning ou outras técnicas podem ser usadas para remover até mesmo essa contaminação glia baixo ^4.

Essa técnica também pode ser modificado para cultivar a variedade de tipos de células de qualquer aderente ao isolar um único tipo de análise é desejável. Por exemplo, este sistema foi adaptado com sucesso para analisar os efeitos de osteoblastos em Ca ^{2 +} de sinalização em células ósseas, câncer metastático ^14.