Summary
우리는 심혈관 수리를 위해 인간의 심장 progenitors 및 기능 cardiomyocytes의 큰 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 cardioblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.
Abstract
날짜하려면 적합한 인간 심장 세포 소스의 부족 중 세포 기반 이식이나 심장 조직 공학 1-3으로 재생 인간 myocardium의 주요 좌절되었습니다. Cardiomyocytes은 출생 직후 말기 - 차별되고 세포 분열 따위에 의해 번식하는 능력을 잃게됩니다. 같은 골수 또는 탯줄 혈액 등 다른 소스에서 파생된 줄기 / 전구 세포가, 1-3 심장에 이식 다음과 수축성 심장 근육 세포에 야기할 수있는 증거는 없습니다. 손상된 심장 근육을 재생 또는 수리 필요는 성인 줄기 세포 치료, 중 내생 또는 1-3 셀 전송을 통해 충족되지 않았습니다. 유전자 안정적인 인간의 배아 줄기 세포 (hESCs)가 필요 혈통에 제한 인간의 체세포의 대형 공급의 체외의 유도에 대한 pluripotent 저수지를 proffering, 무제한 확장 능력과 무제한 소성을 가지고수리 및 재생 4,5니다. 기증 장기의 부족과 세계적으로 급성 심장 혈관 질환의 유행으로 인해, 다른 접근 방법으로 개발 hESC 기반 요법에 강렬한 관심이 있습니다. 그러나, 원하는 표현형에 효율적이고 예측할 수 pluripotent hESCs의 다양한 차별의 가능성을 채널하는 방법을 개발 연구와 임상 번역 모두에 큰 도전을했습니다. 종래의 접근 방식은 종종 phenotypic 이질과 불안정, 따라서, tumorigenicity 6-8의 높은 위험 (에 회로도를 참조하여 다음입니다 비효율적과 지나치게 혈통 - 노력의 결과로, 자연 배아 계층 분화를 통해 pluripotent 세포의 멀티 혈통 기울기에 의존 그림. 1A). 또한, 정의되지 않은 외국인 / 동물 생물 학적 보조 및 / 또는 일반적으로 격리, 확장, 그리고 hESCs의 분화에 사용되었습니다 모이통는 세포 speciali 직접 사용 할 수 있습니다9-11 문제 환자에 이식 제드 자형의 것. 이러한 장애물을 극복하기 위해, 우리는 임상 - 적합한 hESCs의 드 노보 유도를위한 플랫폼으로 제공, 필요한 hESCs의 epiblast pluripotence를 유지하기에 충분 정의된 문화 시스템의 요소를 해결하고 효과적으로 임상 - 관련 lineages 방향으로 균일하게 같은 hESCs를 지시하고있다 작은 분자로 12 (그림 설계도를 참조하십시오. 1B). 작은 분자와 성장 요인의 다양한 상영 후, 우리는 이러한 정의 조건이 있습니다 (그림 2 더 높은 효율과 인간의 박동 cardiomyocytes을 생성 cardioblasts로 진행 pluripotent의 hESCs에서 직접 cardiomesoderm의 사양을 유발하는 니코틴 (NAM)가 충분한 렌더링 발견 ). 우리는 잘 제어 효율적인 파생을 가능하게 개입 멀티 혈통 embryoid 바디 단계없이 pluripotent hESCs에서 직접 cardioblasts의 유도에 대한 조건을 정의세포 기반 치료제에 대한 개발 단계의 스펙트럼에 걸쳐 인간의 심장 세포의 대형 공급하고 있습니다.
Protocol
1. 솔루션 및 미디어 준비
- 젤라틴 코팅 솔루션 : 4 0.1 % (W / V) ddH 2 O, autoclaved에 젤라틴 및 저장 ° C.
- Matrigel 코팅 솔루션을 제공합니다. 증권 솔루션 : ° C 야간 10 ML 얼음처럼 차가운 DMEM이나 DMEM/F12를 추가, 잘 섞어 나누어지는 1 ML / 소독 조직 문화 후드 아래 튜브, -20에 저장 ° C. 4 느린 해동 Matrigel (10 ML) 작업 솔루션 : 천천히 녹여 4 일 ML Matrigel의 나누어지는 ° C DMEM이나 DMEM/F12를 차게 14 ML에 1-2위한 시간, 전송 및 코팅하기 전에 즉시 소독 조직 문화 후드 아래에 잘 섞는다.
- 인간 laminin 코팅 솔루션 : 희석 한 ML 인간 laminin 솔루션 얼음처럼 차가운 DMEM 또는 DMEM/F12 함께 (트리스의 0.5 MG / ML -80에서 저장, NaCl을 버퍼 ° C, 1-2 시간 동안 4 ° C에서 느린 해동) 12.5 ML 작업 솔루션 (40 μg / ML) 소독 조직 문화 후드 아래에 바로 코팅하기 전에.
- 성장 인자의 재고 솔루션 (500 1000X)는 10 μg의 성장 요인을 풀다멸균 버퍼 / ML (0.5 % BSA, 1.0 MM DTT, 10 % 글리세롤, 1XPBS)와 -80에서 50-100 μl / 튜브 aliquots로 저장 ° C.
- HESC 미디어 : DMEM/F12 또는 KO - DMEM (80 %), KO 혈청 교체 (20 %), L - alanyl - L - gln 또는 L - gln (2 ㎜), 가상 불필요한 아미노산 (MNAA, 1X) 및 β - 메르 캅 토 에탄올 (100 μm의), 필터링 및 4 저장 ° 사용하기 전에 20 NG / ML bFGF와 함께 보충 C,. 또는 정의된 구성 요소 "KO 혈청 교체"대체 : DMEM/F12 또는 KO - DMEM (100 %), L - alanyl - L - gln 또는 L - gln (2 ㎜), MNAA (1X), 가상 필수 아미노산 (MEAA을 , 1X) 및 β - 메르 캅 토 에탄올 (100 μm의), 필터링 및 4 저장 bFGF (20 NG / ML)와 보충 ° C, 인간 인슐린 (20 μg / ML), 아스코르비 산 (50 μg / ML), 인간 activin (50 NG / ML), 인간 / 알부민 Albumax (10 MG / ML), 그리고 인간의 트랜스페린 (8 μg / ML)을 사용하기 전에.
- HESC 심장 차별화 미디어 : DMEM/F12 (90 %), 정의 FBS (10 %), 그리고 L - alanyl - L - gln 또는 L - gln (2 ㎜).
- 미디어가 들어있는 니코틴 (NAM) : 시간을 추가하십시오 N10 mm의 최종 농도, 4 필터링, 저장 ° C와 준비 2 주 이내에 사용합니다.하는 HESC 미디어 또는 HESC 심장 차별화 미디어 오전
2. 플레이트 코팅
- 와 코트 판 젤라틴 : 시간을 추가하십시오 ML / 물론 6 자 접시에 젤라틴 용액의 2.5 37 ° C 배양기에서 하룻밤 humidified 품어.
- 코트 laminin과 접시 : 냉기 젤라틴 - 코팅 접시와 젤라틴 제거는, 2.5 ML 추가 / 미리 냉장에 잘 Matrigel 또는 인간의 laminin 코팅 작업 솔루션은 4 ° C 하루에 6 접시와 잘 부화를 gelatinized.
3. 정의된 조건 하에서 Undifferentiated hESCs를 Passaging 및 심는
- hESC의 식민지가 5~7일 나이로 성장할 수 있도록하고, 해부 현미경 (사전 따뜻한 37 단계를 해부 ° C) 소독 후드를 해부 아래에 hESC 문화 플레이트 가져가라.
- hESC의 식민지가 분할을 선택합니다. Morphologically이 식민지 (SM> 75% undifferentiated hESCs이 있어야합니다해부 현미경 아래에 뚜렷한 모서리와 함께 일반적으로 약간 불투명한 모든 소형 전지), (하지 하얀 쌓여 업 세포가 아닌 명백한 차별화된 세포). 신중하게 선택한 식민지 개요 및 P2 멸균 피펫 팁의 가장자리와 식민지이나 유리 모세관 뽑아 (있을 경우)은 식민지를 둘러싼 차별 fibroblast 계층과 모든 차별화된 부분을 제거합니다.
- aspirating로 부동 분리된 차별화된 세포를 포함하는 기존의 미디어를 제거합니다. 한번 hESC 미디어 (bFGF없이)로 씻으십시오. 3 ML 추가 / 20 NG / ML bFGF를 포함하는 잘 신선한 hESC 미디어.
- 작은 조각으로 undifferentiated hESC의 식민지 잘라하고, 멸균 피펫 팁 또는 모세관 뽑아 유리 분리합니다.
- 50 ML 원뿔 튜브에서 함께 분리 식민지 조각을 포함하는 미디어 풀. 1 ML / 함께 20 NG / ML bFGF와 수영장을 포함하는 잘 hESC 미디어와 함께 한 접시를 씻으십시오.
- 코팅 신선한 접시에서 Matrigel 또는 인간의 laminin 솔루션을 기음. 나누어지는 4 ML / 잘 HESC 미디어는 6 잘 판에 식민지 조각을 포함하는. 부드럽게 떨지 않고 배양기에 플레이트를 전송하고 5 % CO 2 분위기 humidified 37 ° C 배양기에서 방해없이 식민지 조각의 씨앗이 하룻밤 수 있습니다.
4. 니코틴과 정의 문화 체제에서 hESCs의 심장 유도
- 시딩 후 3 일에, 접시 각 우물에서 이전 미디어의 대부분을 제거하고 hESC의 식민지 (hESCs가 건조 절대로 용납할) 빠져들 수 있도록 충분한 미디어를 두십시오. 20 NG / ML bFGF와 10 MM의 니코틴 (NAM)이있는 4 ML / 물론 신선한 hESC 미디어로 바꿉니다.
- 20 NG / ML bFGF와 10 MM NAM 매일을 포함하는 신선한 hESC 매체와 오래된 미디어를 교체하고, 심장 유발 hESC의 식민지 일 8-10에 성장 수 있습니다. NAM에 노출되면, 식민지 내의 모든 세포가 번식에 계속 큰 차별화된 세포 형태 변화를 받아야합니다. 식민지는, 크기, 그리고 하루 8-10 증가합니다D 세포는 식민지의 일부 지역에서 무더기로 쌓이기 시작합니다.
5. 서스펜션 문화 평생 심장 차별화
- 멸균 후드를 해부 아래 현미경 (미리 따뜻한 37 단계를 해부 ° C) 해부에 hESC 문화 플레이트를 가져가라. 조심스럽게 식민지 개요 및 P2 멸균 피펫 팁의 가장자리와 식민지를 둘러싼 fibroblast 층 (차별화된 세포 식민지 밖으로 마이 그 레이션)을 제거하거나 유리 모세관 뽑았.
- aspirating로 부동 분리 fibroblast 세포를 포함하는 기존의 미디어를 제거합니다. 한번 hESC 미디어 (bFGF없이)로 씻으십시오. 3 ML / 물론 신선한 hESC 미디어 (bFGF없이) 추가합니다.
- 작은 조각으로 심장병 유발 hESC의 식민지 잘라하고, 멸균 피펫 팁 또는 모세관 뽑아 유리 분리합니다.
- 50 ML 원뿔 튜브에서 함께 분리 식민지 조각을 포함하는 미디어 풀. 함께 한 ML / 잘 hESC 미디어 (bFGF 제외) 수영장과 함께 한 접시를 씻으십시오.
- 나누어지는 4m37 6 잘 ultralow 첨부 플레이트와 부화 식민지 조각을 포함하는 L / 잘 혈청 무료 hESC 미디어 ° C 배양기가 떠있는 세포 클러스터 (cardioblasts)가 4-5일에 대한 양식 수 있도록 humidified.
6. 접착제 문화 Cardiomyocyte 표현형의 성숙을 박동
- 50 ML 원뿔 튜브에 함께 떠 cardioblasts를 포함하는 미디어 풀. 5 분 1,400 rpm으로 원심 분리기. 당신이 할 수만큼 기존의 미디어를 대기음 10 MM NAM을 포함하는 신선한 hESC 심장 차별화 미디어의 동일한 금액을 추가합니다.
- 4 ML / 잘 6 잘 접시에 부동 cardioblasts과 나누어지는를 섞어 아래 피펫합니다. 37에 접시를 전송 ° C humidified 인큐베이터가 cardioblasts가 밤새 첨부할 수 있습니다.
- 매일 10 MM NAM을 포함 hESC 심장 차별 미디어를 교체합니다.
- 일 8시, NAM없이 hESC 심장 차별화 미디어로 교체하고, HESC 심장 차별화 미디어 E를 교체 계속아주 다른 일. 잔 cardiomyocytes는 NAM의 철수 이후 지속적으로 재배 1-2에 대한 주에 나타나는 시간과 수치가 증가하기 시작하며, 3 개월 이상 강한 리듬 수축을 유지 수 있습니다.
7. 대표 결과 :
니코틴은 (NAM) 전용 cardiomesodermal 표현형 (그림 2B)로 pluripotency에서 전환 정의된 문화 시스템에 유지 hESCs을 유발하기에 충분 렌더링됩니다. NAM에 undifferentiated hESCs의 노출시, 식민지 내의 모든 세포가 월 4의 표현을 다운 조절하고 심장 특정 전사 인자 (Csx) Nkx2.5과 α -을 표현하기 시작되는 큰 차별화된 세포 형태 변화를 받게 될 것이다 cardiomesoderm의 표현형 (그림 2B)과 일치 actinin. 이러한 차별화된 세포는 번식이 계속되고 식민지의 크기가 증가합니다. Nkx2.5의 증가 강도됩니다보통 세포 (그림 2B)가 무더기로 쌓이기 시작 식민지의 영역에서 관찰됩니다. 분리된 후, 남구 처리 hESCs는 심장 차별화 과정을 계속하기 위해 서스펜션 문화에 떠있는 세포 클러스터 (cardioblasts) 양식을 것입니다. cardioblasts이 첨부 허락하고 1 주일 NAM과 함께 치료를 계속하면, 박동 cardiomyocytes은 자연의 여러 혈통 분화에 비해 효율의 대폭 증가와 NAM의 철수 이후 지속적으로 재배 약 1-2 주후에 나타나기 시작합니다 같은 기간 (그림 2C) 이상 치료를하지 않고 hESCs. 박동 cardiomyocyte 클러스터 내의 세포는 Nkx2.5과 α - actinin (그림 2C)를 포함 cardiomyocytes의 특성 마커를 표현합니다. 박동 cardiomyocytes의 수축은 P 연상 정기 충동과 강한 리듬, 잘 조율된, 그리고 잘 개입하는 전기 프로필에 의해 확인되었다- QRS - T - 단지 임상 electrocardiograms의 신체 표면 전극에서 본 (그림 2C, 또한 비디오 참조). cardiomyocytes은 3 개월 이상 자신의 강력한 수축성을 유지 수 있습니다.
그림 1. 전문 기능성 세포 향한 인간의 pluripotent 줄기 세포의 차별 화를위한 작은 분자 유도 방식 간의 기존 접근 방식의 전체 구조. 자연 배아 계층 분화를 통해 인간의 pluripotent 줄기 세포의 멀티 혈통 경사를 사용하여 종래의 접근 방식 (A) 설계도. 독점적으로 작은 분자의 간단한 규정에 의한 특정 임상 - 관련 혈통에 인간의 pluripotent 줄기 세포의 잘 제어 효율 유도의 (B) 설계도.
그림 2. 니코틴은 정의된 조건과 cardiomyocytes를 치고 향해 진행에 따라 pluripotency의 직접적인 심장 혈통 사양을 유도. (A) 도식은 hESCs의 지시 심장 분화의 프로토콜 시간 라인 묘사. (B) 정의된 문화 시스템에 따라 니코틴 (NAM)에 undifferentiated hESCs의 노출되면 큰 차별 월 4 식민지 이내 (적색) 부정적인 세포로 제어로 모의 - 대우 (DMSO) hESCs에 비해 등장하기 시작했다. 남구 유발 월 4 부정적인 세포는 초기에 심장 차별화와 일치하는 표현 Nkx2.5 (녹색)과 α - actinin (빨간색), 시작했다. Nkx2.5의 점진적 증가 강도는 일반적으로 세포가 무더기로 쌓이기 시작 식민지의 영역에서 관찰되었다. 모든 세포들은 핵의 DAPI의 얼룩 (파란색)으로 표시됩니다. (C) 남구 유도된 심장 - 헌신 hESCs는 세포 clus에 의해 평가, 효율성의 급격한 증가와 함께 뛰는 cardiomyocytes이 나왔고리듬 수축 (electrophysiological 프로필과 동영상을 참조), Nkx2.5 (녹색)과 α - actinin (적색)에 대한 immunopositive 표시 ters. 심장 근육을 수축 대표의 대표적인 대형 구타 cardiomyocyte 클러스터 및 높은 전력 이미지의 위상 이미지 (또한 해당 동영상 참조) 표시됩니다. 화살표는 electrophysiological 레코딩에 사용되는 대형 박동의 cardiomyocyte 클러스터를 나타냅니다. 박동 cardiomyocytes의 Electrophysiological 프로필 임상 electrocardiograms에서 본 P - QRS - T - 단지 연상 정기적으로 개입, 리듬 충동을 보여줍니다. 스케일 바 : 0.1 mm.
비디오 : 남구 유도 hESCs에서 차별 cardiomyocytes을 계약. 비디오 1, 2 쇼 대표 대용량 첨부 파일이 후 약 1, 3 달 cardiomyocyte 클러스터 박동. 비디오 3 높은 전력으로 심장 근육을 계약 4보기 담당자가. 비디오 5 typica을 보여줍니다리터 작은 구타 cardiomyocyte 클러스터는 저절로 제어로 NAM 치료없이 hESCs에서 차별.
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Discussion
발달 연구와 임상 번역 모두의 주요 과제 중 하나는 효율적이고 예측할 원하는 표현형에 pluripotent 인간 줄기 세포의 광범위한 차별 잠재력을 채널로하는 방법되었습니다. 이러한 세포에 여러 혈통 골재 단계를 통해 이동하여 모든 세균 레이어의 세포로 체외에서 자발적으로 구별 수 있지만 hESC - 파생 전용 멀티 혈통 집계 (embryoid 기관), 세포의 매우 작은 분수 (<2 %) 자발적 cardiomyocytes 13-15 (그림 1A)로 구분. 다음 immunoselection, cardiomyocytes의 풍부한 인구가 동물 모델 13 마음에 분사 다음과 같은 기계적 및 전자 손상된 myocardium의 기능을 구조하기 위해 생물 학적 맥박 조정기와 같은 기능을 수있었습니다. 설치류 infarcted 모델, engrafted hESC - 파생 심장 progenies 살 및 12 주가 성숙 수 있었던, 그리고 부분적으로 remuscular부상자 마음을는 어때하고 수축성 기능 14,15을 향상시킵니다. 그러나, 다중 혈통 pluripotent 세포의 분화 및 tumorigenicity 다음 이식의 높은 위험을 통해 인간의 심장 - 최선을 다하고 세포를 생성하는 비효율 추가 임상 번역을 방해했습니다. 심장 표현형에 독점적으로하고 예측할 수 pluripotent hESCs의 다양한 차별의 가능성을 채널 전략을 개발하는 것은 harnessing 심장 분야에서 hESC 생물학의 능력에 매우 중요합니다. 특정 혈통에 인간의 pluripotent 줄기 세포의 일정한 변환을 달성하기 위해, 우리는 임상 - 관련 혈통 특정에 독점적으로 pluripotent의 hESCs의 잘 제어 효율 유도 조건을 식별하는 undifferentiated hESCs의 확산을 할려고 수있는 정의된 문화 시스템을 채용 작은 분자의 단순한 제공 (그림의 1B)에 의해. 우리는 직접 P로부터 유도된 심장 니코틴 - 혈통 노력을 발견더 높은 효율 (그림 2)와 함께 cardiomyocytes을 치고으로 진행되고 정의 문화에 따라 luripotent hESCs. Nkx2.5은 인간의 선천성 심장 질환 (CHD), 가장 일반적인 인간의 선천성 16과 관련된 유전자의 정상적인 심장 개발 및 돌연변이에 대한 필수 evolutionally 보존 homeobox의 전사 인자이다. Nkx2.5 표현까지 모든 척추 동물에서 검사 심장 전구체 세포에 대한 최초의 표지이며 적절한 심장 septation 및 형성 / 전기 전도 시스템 16 성숙을 위해 필수적입니다. 척추 동물에서 초기 Nkx2.5 표현의 증상과 패턴은 대략 초기 embryogenesis의 심장 사양의 타이밍 지역과 일치하고, Nkx2.5 유전자는 심장 16 개발을 통해 표현되고 있습니다. 우리 hESC 모델에서 NAM은 심장 특정 transcri의 표현을 장려하여 pluripotent hESCs에서 직접 심장병 유도를 실행하는 데 등장인간의 배아 cardiogenesis에 pluripotent epiblast에서 cardiomesoderm의 사양을 에뮬레이트 수 과정에 ption 팩터 Nkx2.5. 미래 연구는 재생 요법에 대한 임상 - 관련 lineages를 파생하면 hESC의 pluripotent 운명의 작은 분자 중재 직접 제어 및 모듈 레이션을위한 방법을 포장 수있는, 대안으로 인간 심장 개발 유전 및 epigenetic 조절 분자를 보여줄 것입니다. NAM 처리하지 않고, <2 % hESCs가 cardiomyocytes 12-15을 치고으로 자발적인 차별을 받아야합니다. NAM 치료와 함께, 우리는 인간의 배아 심장 개발에 12 에뮬레이트 수도 과정에서 정의하는 문화에 따라 유지 hESCs에서> 95% 배아 심장 엽 성의 전구 물질과> 50 % 구타 cardiomyocytes를 생성할 수있게되었습니다. 최근 알려진 심장 - 운명 결정하는 유전자는 <0.5 % 17, 18의 낮은 효율성 포스트 산후 박동 cardiomyocytes에 마우스 섬유아 세포를 transdifferentiate하는 데 사용되었습니다 </>를 한모금. 그러나, 다시 프로그램 체세포 역사적으로 비정상적인 유전자 발현 및 장애 치료 유틸리티를 19-21로 가속 노화와 관련된되었습니다. 마지막으로, 우리가 여기 설립 프로토콜은 내부 세포 덩어리 (ICM) 또는 4,5 인간 blastocyst의 epiblast에서 파생된 pluripotent hESCs로 제한됩니다 이전 morula에서 파생된 동물 - 기원 ESCs, ESCs 등 다른 pluripotent 세포에 적용되지 않을 수도 있습니다 (8 셀) - 무대 배아 22, 그리고 인위적으로 다시 프로그램 세포 23.
Disclosures
저자는 경쟁 이익을 선언합니다. XHP는 Xcelthera의 창시자이다. XHP 및 EYS는 hESCs에 관련된 지적 재산권을 가지고.
Acknowledgments
XHP은 노화에 국립 연구소 (NIHK01AG024496)와 아동 건강 및 인간 발달의 유니스 케네디 Shriver 국립 연구소 (NIHR21HD056530)에서 건강 (NIH) 보조금의 국립 연구소에 의해 지원되었습니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356231 | Growth factor reduced |
| Human laminin | Sigma-Aldrich | L6274 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 10565042 | |
| DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
| DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
| Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
| MEM amino acids solution(MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | |
| Human bFGF | PeproTech Inc | AF-100-18B | |
| Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
| Human activin A | PeproTech Inc | 120-14E | |
| Defined FBS | Hyclone | SH30073-03 | |
| 6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 |
References
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