Summary
Nós estabelecemos um protocolo para indução de cardioblasts direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores cardíaca e funcional cardiovascular cardiomiócitos para reparação.
Abstract
Até o momento, a falta de uma fonte de células adequado cardíaco humano tem sido o grande revés na regeneração do miocárdio humano, seja por celular baseado em transplante cardíaco ou por engenharia tecidual 1-3. Cardiomiócitos se tornar terminalmente diferenciadas logo após o nascimento e perdem a capacidade de proliferar. Não há evidências de que haste / progenitor células derivadas de outras fontes, tais como a medula óssea ou do sangue do cordão umbilical, são capazes de dar origem a células musculares de contração do coração após o transplante para o coração 1-3. A necessidade de regenerar ou reparar o músculo cardíaco danificado não foi cumprido pela terapia de células-tronco adultas, seja endógena ou através da entrega de célula 1-3. O geneticamente estáveis células estaminais embrionárias humanas (hESCs) têm capacidade de expansão ilimitada e irrestrita plasticidade, proferindo um reservatório pluripotentes no derivação in vitro de grandes quantidades de células somáticas humanas que são restritos à linhagem em necessidadede reparo e regeneração 4,5. Devido à prevalência de doença cardiovascular em todo o mundo e aguda escassez de doadores de órgãos, existe grande interesse em terapias CTEh baseado em desenvolvimento como uma abordagem alternativa. No entanto, como canalizar o potencial de diferenciação gama de hESCs pluripotentes de forma eficiente e previsível para um fenótipo desejado tem sido um grande desafio tanto para estudo de desenvolvimento e tradução clínica. Abordagens convencionais dependem de multi-linhagem inclinação de células pluripotentes através da diferenciação espontânea germe de camada, resultando em ineficiência e incontrolável linhagem compromisso, que é muitas vezes seguido de heterogeneidade fenotípica e instabilidade, portanto, um risco elevado de tumorigenicidade 6-8 (ver um esquema em fig. 1A). Além disso, indefinido estrangeiros / animal suplementos biológicos e / ou alimentadores que tenham sido tipicamente usadas para o isolamento, expansão e diferenciação de hESCs pode fazer uso direto de tais células-specialized enxertos em pacientes problemáticos 9-11. Para superar esses obstáculos, temos resolvido os elementos de um sistema de cultura definidas necessárias e suficientes para sustentar o epiblasto pluripotence de hESCs, servindo como uma plataforma para a derivação de novo de hESCs clinicamente adequado e eficaz direcionando hESCs tais uniformemente para linhagens clinicamente relevante por pequenas moléculas 12 (ver um diagrama esquemático na fig. 1B). Após a triagem de uma variedade de pequenas moléculas e fatores de crescimento, verificou-se que tais condições definidas prestados nicotinamida (NAM) suficiente para induzir a especificação de cardiomesoderm direta de hESCs pluripotentes que mais progrediu para cardioblasts que gerou humana cardiomiócitos batendo com alta eficiência (Fig. 2 ). Nós definimos as condições para a indução de cardioblasts direta de hESCs pluripotentes sem uma intervenção multi-estágio corpo linhagem embrióides, permitindo bem controlados derivação eficiente de umgrande oferta de células cardíacas humanas em todo o espectro de estágios de desenvolvimento para a célula-base terapêutica.
Protocol
1. Solução e Mídia Preparação
- Solução de revestimento de gelatina: 0,1% (w / v) de gelatina em DDH 2 O, autoclavado e armazenar a 4 ° C.
- Matrigel soluções de revestimento. Solução estoque: lento degelo Matrigel (10 ml) a 4 ° C durante a noite, adicionar 10 ml gelada DMEM ou DMEM/F12, misture bem e alíquota de 1 ml / tubo sob capô de cultura de tecidos esterilizados, armazenar a -20 ° C. Solução de trabalho: descongele lenta 1 ml alíquota Matrigel a 4 ° C por 1-2 horas a transferência, a 14 ml ou refrigerados DMEM DMEM/F12 e misture bem debaixo capa de cultura de tecidos esterilizados imediatamente antes de revestimento.
- Solução de revestimento laminina humana: diluir 1 ml de solução de laminina humana (0,5 mg / ml em Tris Buffered NaCl, armazenar a -80 ° C, degelo lento a 4 ° C por 1-2 horas) com gelado DMEM ou DMEM/F12 para 12,5 ml de solução de trabalho (40 mcg / ml) por baixo capota de cultura de tecidos esterilizados imediatamente antes de revestimento.
- Soluções estoque de fator de crescimento (500-1000x): dissolver o fator de crescimento de 10 mg/ Ml em tampão esterilizado (0,5% BSA, 1,0 mM DTT, glicerol 10%, 1XPBS) e armazenar como 50-100 mL / tubo de alíquotas a -80 ° C.
- Media células estaminais embrionárias humanas: DMEM/F12 ou KO-DMEM (80%), KO substituição de soro (20%), L-alanil-L-gln ou L-gln (2 mM), MEM aminoácidos não essenciais (MNAA, 1X), e β-mercaptoetanol (100 mM), filtrado e armazenar a 4 ° C, suplementado com 20 ng / ml bFGF antes de usar. Ou substituição de "KO substituição do soro" com componentes definidos: DMEM/F12 ou KO-DMEM (100%), L-alanil-L-gln ou L-gln (2 mM), MNAA (1X), MEM aminoácidos essenciais (MEAA , 1X), e β-mercaptoetanol (100 mM), filtrado e armazenar a 4 ° C, suplementado com bFGF (20 ng / ml), a insulina humana (20 mcg / ml), ácido ascórbico (50 mg / ml), humanos ativina A (50 ng / ml), albumina humana Albumax / (10 mg / ml), e transferrina humana (8 mcg / ml) antes de usar.
- Media células estaminais embrionárias humanas cardíaca diferenciação: DMEM/F12 (90%), FBS definida (10%), e L-alanil-L-gln ou L-gln (2 mM).
- Mídia contendo nicotinamida (NAM): adicionar NAM células estaminais embrionárias humanas para a mídia ou a mídia células estaminais embrionárias humanas cardíaca diferenciação para concentração final de 10 mM, filtrado loja, a 4 ° C e usar dentro de 2 semanas de preparação.
2. Revestimento placa
- Placas de revestimento com gelatina: adicionar 2,5 ml / poço de solução de gelatina a 6 placas bem e incubar durante a noite em uma incubadora de 37 ° C umidificado.
- Placas de revestimento com laminina: frio de gelatina revestidos e remover placas de gelatina, adicione 2,5 ml / solução de revestimento bem Matrigel ou humano laminina trabalhando para pré-gelatinizado refrigerados 6-bem placas e incubar a 4 ° C durante a noite.
3. Passaging e propagação hESCs indiferenciado sob condições definidas
- Permitir colônias CTEh crescer até 5-7 dias de idade, e ter placa de cultura CTEh para microscópio de dissecação (pré-aquecido dissecar palco para 37 ° C) por baixo de dissecação capô esterilizados.
- Selecione colônias CTEh a ser dividido. Morfologicamente, essas colônias devem ter> 75% hESCs indiferenciada (smtodas as células compactas), geralmente um pouco opaco (não-brancos empilhados células não diferenciadas células claras) com borda definida sob o microscópio de dissecação. Cuidadosamente delinear as colônias selecionadas e remover camada de fibroblastos diferenciados em torno da colônia e todas as partes diferenciadas (se houver) da colônia com a borda da P2 ponteira estéril ou puxado capilar de vidro.
- Remover a velha mídia contendo flutuante destacada células diferenciadas por aspiração. Lavar com media hESC (sem bFGF) uma vez. Adicionar 3 ml / media CTEh bem fresco contendo 20 ng / ml bFGF.
- Cortar as colônias CTEh indiferenciado em pequenos pedaços, e retire com ponteira estéril ou vidro puxado capilar.
- Piscina a mídia que contém peças colônia separada juntos em um tubo de 50 ml. Lave a placa uma vez com 1 ml / media CTEh bem contendo 20 ng / ml bFGF e piscina juntos.
- Aspirar o Matrigel ou solução laminina humana, desde as placas revestidas fresco. Alíquota de 4 ml / h bemESC mídia contendo peças colônia para uma placa de seis poços. Suavemente transferir a placa para incubadora, sem agitação e permitir semente peças colônia durante a noite sem perturbar em um umidificado 37 ° C incubadora com uma atmosfera de 5% de CO 2.
4. Indução cardíaca de hESCs em Sistema Cultura Definido com Nicotinamida
- No dia 3 após a semeadura, remover a maior parte velha mídia de cada poço da placa e deixe a mídia o suficiente para permitir colônias CTEh a ser submersa (nunca permitir hESCs a secar). Substituir com 4 ml / media CTEh bem fresco contendo 20 ng / ml bFGF e 10 mM nicotinamida (NAM).
- Substituir a velha mídia com a mídia CTEh fresco contendo 20 ng / ml e 10 mM bFGF NAM cada dois dias, e permitir que as colônias cardíaca induzida CTEh crescer para 10/08 dias. Após expor a NAM, todas as células dentro da colônia vai sofrer alterações morfologia de grandes células diferenciadas que continuarão a se multiplicar. As colónias aumentarão de tamanho, e por 8-10 dias, umcélulas d começará a se acumular em algumas áreas das colônias.
5. Continuando Diferenciação Cardíaca em Cultura Suspensão
- Tome placa CTEh cultura para dissecar microscópio (pré-aquecido dissecar palco para 37 ° C) por baixo de dissecação capô esterilizados. Cuidadosamente delinear as colônias e remover camada de fibroblastos ao redor da colônia (células diferenciadas migraram para fora da colônia) com a borda da ponta da pipeta estéril ou P2 puxado capilar de vidro.
- Remover a velha mídia contendo flutuante células de fibroblastos destacado por aspiração. Lavar com media hESC (sem bFGF) uma vez. Adicionar 3 ml / media CTEh bem fresco (sem bFGF).
- Cortar as colônias cardíaca induzida CTEh em pequenos pedaços, e retire com ponteira estéril ou vidro puxado capilar.
- Piscina a mídia que contém peças colônia separada juntos em um tubo de 50 ml. Lave a placa uma vez com 1 ml / media CTEh bem (sem bFGF) e piscina juntos.
- Alíquota de 4 ml / poço media sem soro CTEh contendo peças colônia para uma placa de fixação 6-ultralow bem e incubar a 37 ° C umidificado incubadora para permitir flutuante aglomerados celulares (cardioblasts) para formar por 4-5 dias.
6. Maturação batendo Fenótipo Cardiomyocyte em Cultura Adhesive
- Piscina a mídia que contém cardioblasts flutuando juntos em um tubo de 50 ml. Centrifugar a 1400 rpm por 5 min. Aspirar a velha mídia, tanto quanto você pode e adicionar uma quantidade igual de novo CTEh media diferenciação cardíaca contendo 10 mM NAM.
- Pipeta cima e para baixo para misturar cardioblasts flutuante e alíquota de 4 ml / poço a 6-lamelas. Transferir os pratos para a 37 ° C incubadora umidificada para permitir cardioblasts anexar durante a noite.
- Substituirá a mídia CTEh cardíaca diferenciação contendo 10 mM NAM em dias alternados.
- No dia 8, substitua com a mídia CTEh cardíaca diferenciação sem NAM, e continuam a substituir células estaminais embrionárias humanas cardíaca diferenciação de mídia edia muito outros. Cardiomiócitos batendo começarão a aparecer em cerca de 1-2 semanas de cultivo contínuo após a retirada do NAM e aumentar em número com o tempo, e poderia manter fortes contrações rítmicas e por mais de 3 meses.
7. Resultados representativos:
Nicotinamida (NAM) é processada suficiente para induzir hESCs mantido no sistema de cultura definida para a transição de pluripotência exclusivamente a um fenótipo cardiomesodermal (Fig. 2B). Após a exposição de hESCs indiferenciado para NAM, todas as células dentro da colônia vai sofrer alterações morfologia de grandes células diferenciadas que baixo-regulam a expressão de Oct-4 e começam a expressar o fator de transcrição cardíacas específicas (CSX) Nkx2.5 e α- actinina, consistente com um fenótipo cardiomesoderm (Fig. 2B). Estas células diferenciadas continuarão a se multiplicar e as colônias aumentam de tamanho. Aumento da intensidade das Nkx2.5 vaigeralmente ser observado nas áreas das colônias, onde as células começam a se acumular (Fig. 2B). Depois de separado, o hESCs NAM-tratados formarão flutuante aglomerados celulares (cardioblasts) em uma cultura de suspensão para continuar o processo de diferenciação cardíaca. Depois de permitir a cardioblasts para anexar e continuar a tratar com NAM por 1 semana, batendo cardiomiócitos começarão a aparecer em cerca de 1-2 semanas de cultivo contínuo após a retirada do NAM com um aumento drástico em termos de eficiência, em comparação com diferenciação multi-linhagem espontânea de hESCs sem tratamento sobre o mesmo período de tempo (Fig. 2C). Células dentro dos clusters vai bater cardiomiócitos expressam marcadores característicos de cardiomiócitos, incluindo Nkx2.5 e α-actinina (Fig. 2C). As contrações dos cardiomiócitos batendo foram confirmados por perfis elétricos para ser forte, rítmica, bem coordenada e bem arrastado, com impulsos regulares lembra do p-QRS-T-complexos de visto a partir de eletrodos de superfície do corpo em clínica eletrocardiogramas (Fig. 2C, também ver o vídeo). Os cardiomiócitos poderia manter a sua contratilidade forte por mais de 3 meses.
Figura 1. Esquemas geral da abordagem convencional versus abordagem de pequena molécula de indução de diferenciação de células-tronco humanas pluripotentes para células especializadas funcional. (A) Um esquema de abordagem convencional, usando multi-linhagem inclinação de células-tronco humanas pluripotentes através da diferenciação espontânea germe de camada. (B) Um esquema de bem-controlados de indução eficiente de células-tronco pluripotentes humanas exclusivamente a uma linhagem particular clinicamente relevante pelo simples fornecimento de pequenas moléculas.
Figura 2. Nicotinamida induz especificação linhagem cardíaca direta de pluripotência em condições definidas e progressão para bater cardiomiócitos. (A) Esquema mostrando a linha do tempo de protocolo de diferenciação dirigida cardíaca de hESCs. (B) Após a exposição de hESCs indiferenciada a nicotinamida (NAM), sob o sistema de cultura definido, grande diferenciados Oct-4 (vermelho) células negativas dentro da colônia começaram a surgir, em comparação com o mock-tratados (DMSO) hESCs como controle. NAM induzida por células Oct-4-negativos começaram a expressar Nkx2.5 (verde) e α-actinina (vermelho), de acordo com a diferenciação cardíaca precoce. Intensidade progressivamente aumentado de Nkx2.5 era normalmente observada em áreas da colônia onde as células começaram a se acumular. Todas as células são indicados por DAPI coloração de seus núcleos (azul). (C) NAM-cardíaca induzida comprometido hESCs rendeu cardiomiócitos batendo com um aumento drástico em termos de eficiência, avaliada pela clus celularters que mostrava contrações rítmicas (ver perfil eletrofisiológicos e vídeos), e imunopositivas para Nkx2.5 (verde) e α-actinina (vermelho). Imagens da fase de grupos representativos de bater grandes cardiomiócitos e imagens de maior poder de representante contrair músculos cardíacos são mostrados (veja também vídeos correspondente). As setas indicam o cluster cardiomiócitos grande batendo utilizado para a gravação eletrofisiológico. Perfil eletrofisiológico dos cardiomiócitos bater mostra regular, arrastado, impulsos rítmicos reminiscência da p-QRS-T-complexos visto em eletrocardiogramas clínicos. Barras de escala: 0,1 mm.
Vídeos: Entidade cardiomiócitos diferenciados NAM induzida hESCs. Vídeos 1 e 2 mostram representante vídeo batendo grandes aglomerados de cardiomiócitos em cerca de 1 e 3 meses após a fixação. Video 3 e 4 mostram representante contraindo os músculos cardíacos com maior poder. 5 mostra uma typical aglomerado de cardiomiócitos pequenos batendo espontaneamente diferenciado de hESCs NAM sem tratamento como controle.
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Discussion
Um dos grandes desafios tanto para estudos de desenvolvimento e tradução clínica tem sido a forma de canalizar o potencial de diferenciação gama de células-tronco pluripotentes humanas a um fenótipo desejado de forma eficiente e previsível. Apesar de tais células podem se diferenciar espontaneamente in vitro em células de todas as camadas germinativas, passando por uma fase agregado multi-linhagem, em CTEh derivados multi-linhagem agregados (corpos embrióides), apenas uma fração muito pequena de células (<2%) espontaneamente diferenciar em cardiomiócitos 13-15 (Fig. 1A). Immunoselection seguintes, a população enriquecida de cardiomiócitos foram capazes de funcionar como marca-passos biológicos para resgatar a função de um miocárdio danificado mecanicamente e eletronicamente após a injeção no coração de modelos animais 13. Em modelos de roedores infartada, enxertada CTEh progênies derivadas cardíacos foram capazes de sobreviver e amadurecer até 12 semanas, e parcialmente remuscularize o coração ferido e melhorar a função contrátil 14,15. No entanto, a ineficiência na geração cardíaco humano comprometido células através de multi-linhagem diferenciação de células pluripotentes e alto risco de transplante tumorigenicidade seguintes têm impedido de nova tradução clínica. Desenvolvimento de estratégias para canalizar o potencial de diferenciação gama de hESCs pluripotentes exclusiva e previsivelmente a um fenótipo cardíaco é vital para aproveitar o poder da biologia CTEh no campo do coração. A fim de alcançar uniformemente conversão de células pluripotentes estaminais humanas a uma linhagem especial, empregamos um sistema de cultura definido capaz de segurar a proliferação de hESCs indiferenciado para identificar as condições para o bem-controlados de indução eficiente de hESCs pluripotentes exclusivamente para uma determinada linhagem clinicamente relevante pelo simples fornecimento de pequenas moléculas (Fig. 1B). Descobrimos que a nicotinamida induzida comprometimento cardíaco de linhagem direta de phESCs luripotent sob cultura definido que mais progrediu para bater cardiomiócitos com alta eficiência (Fig. 2). Nkx2.5 é um fator de transcrição evolutivamente conservada homeobox indispensável para o desenvolvimento cardíaca normal e mutações do gene são associadas à doença cardíaca humana congênitas (CC), o defeito de nascimento mais comuns humana 16. Expressão de Nkx2.5 é o primeiro marcador de células precursoras de coração em todos os vertebrados, até agora examinado e é essencial para a septação cardíaca adequada e formação / amadurecimento do sistema de condução elétrica 16. Nos vertebrados, o início eo padrão de expressão Nkx2.5 início cerca de coincidir com o calendário e área de especificação na embriogênese cardíaca precoce, e Nkx2.5 gene continua a ser expressa através do desenvolvimento no coração 16. Em nosso modelo CTEh, NAM apareceu para acionar a indução direta de hESCs cardíaca pluripotentes através da promoção da expressão de cardíacas específicas transcriNkx2.5 PÇÃO fator em um processo que pode emular a especificação de cardiomesoderm do epiblasto pluripotentes em cardiogenesis embrionárias humanas. Futuros estudos revelarão moléculas controle genéticas e epigenéticas no desenvolvimento coração humano como alternativas, que podem pavimentar o caminho para o controle de molécula pequena mediada direta e modulação do destino pluripotentes CTEh quando derivar linhagens clinicamente relevantes para terapias regenerativas. Sem tratamento NAM, <hESCs 2% passarão por diferenciação espontânea em bater cardiomiócitos 12-15. Com o tratamento NAM, temos sido capazes de gerar> 95% embrionárias precursores cardíacos e cardiomiócitos batendo> 50% de hESCs mantido sob uma cultura define em um processo que pode emular o desenvolvimento embrionário do coração humano 12. Recentemente, conhecido destino cardíacas genes determinantes têm sido usados para transdifferentiate fibroblastos de rato em pós-natal cardiomiócitos batendo com uma baixa eficiência de <0,5% 17, 18 </ Sup>. No entanto, as células somáticas reprogramadas têm sido historicamente associada com a expressão do gene anormal e senescência acelerada com utilidade terapêutica prejudicada 19-21. Finalmente, o protocolo que estabelecemos aqui é limitado a hESCs pluripotentes derivadas da massa celular interna (ICM) ou epiblasto do blastocisto humano 4,5, pode não se aplicar a outras células pluripotentes, incluindo animais originou-CES, CES derivado de mórula anterior (oito células) em estágio embriões 22, e as células reprogramadas artificialmente 23.
Disclosures
Os autores declaram interesses conflitantes. XHP é o fundador da Xcelthera. XHP e EYS têm propriedades intelectuais relacionadas com hESCs.
Acknowledgments
XHP foi apoiado pelo National Institute of Health (NIH) doações do National Institute on Aging (NIHK01AG024496) e A Eunice Kennedy Shriver National Institute of Child Health e Desenvolvimento Humano (NIHR21HD056530).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 356231 | Growth factor reduced |
| Human laminin | Sigma-Aldrich | L6274 | |
| Nicotinamide | Sigma-Aldrich | N0636 | |
| DMEM/F12 | Invitrogen | 10565042 | |
| DMEM | Invitrogen | 31053036 | |
| DMEM-KO | Invitrogen | 10829018 | |
| Knock-out serum replacement | Invitrogen | 10828028 | |
| MEM nonessential amino acid solution (MNAA, 100X) | Invitrogen | 11140050 | |
| MEM amino acids solution(MEAA, 100X) | Invitrogen | 11130050 | |
| β-Mercapt–thanol | Invitrogen | 21985023 | |
| Albumax | Invitrogen | 11020021 | |
| Ascorbic acid | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| Human transferrin | Sigma-Aldrich | T8158 | |
| Human bFGF | PeproTech Inc | AF-100-18B | |
| Human insulin | Invitrogen | 12585014 | |
| Human activin A | PeproTech Inc | 120-14E | |
| Defined FBS | Hyclone | SH30073-03 | |
| 6-well ultralow attachment plate | Corning | 3471 | |
| 6-well plate | Corning | 3516 |
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