Een betrouwbare methode voor het RNA isolatie van<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Hersteld van muizen cecums wordt beschreven. Teruggevorderde RNA is van voldoende kwantiteit en kwaliteit voor de daaropvolgende qPCR, transcriptie profilering, en RNA-Seq experimenten. Deze techniek kan worden aangepast voor RNA-isolatie van andere intestinale micro-organismen.
Pseudomonas aeruginosa (PA) infecties leiden tot aanzienlijke morbiditeit en mortaliteit bij gastheren met een verminderde immuunsysteem, zoals patiënten met leukemie, ernstige brandwonden, of orgaantransplantaties 1. Bij patiënten met een hoog risico voor het ontwikkelen van PA infecties in het bloed, de gastro-intestinale (GI) stelsel is het belangrijkste reservoir voor kolonisatie 2, maar de mechanismen waarmee PA overgangen van een asymptomatische kolonisatie microbe tot een invasieve, en vaak dodelijk, pathogeen zijn onduidelijk. Eerder hebben we in vivo transcriptie profilering experimenten door herstellende PA mRNA van bacteriële cellen die woonachtig zijn in de cecums van gekoloniseerde muizen 3 om veranderingen in de bacteriële genexpressie identificeren bij wijzigingen in het immuunsysteem van de gastheer status.
Zoals bij elke transcriptie profilering experiment, de snelheidsbeperkende stap is in de isolatie van voldoende hoeveelheden van hoge kwaliteit mRNA. Gezien de overvloed van enzymen, vuil, etensresten, en fijn stof in het spijsverteringskanaal, de uitdaging van RNA-isolatie is een hele uitdaging. Hier presenteren we een methode voor een betrouwbare en reproduceerbare isolatie van bacteriële RNA hersteld van de muizen maag-darmkanaal. Deze methode maakt gebruik van een gerenommeerde muizenmodel van PA GI kolonisatie en neutropenie-geïnduceerde verspreiding van 4. Eenmaal GI kolonisatie met PA is bevestigd, muizen zijn gedood en cecal inhoud wordt hersteld en flash bevroren. RNA is vervolgens geëxtraheerd met behulp van een combinatie van mechanische verstoring, koken, fenol / chloroform extractie, DNase behandeling en affiniteitschromatografie. De hoeveelheid en zuiverheid worden bevestigd door middel van spectrofotometrie (Nanodrop Technologies) en bioanalyzer (Agilent Technologies) (afb. 1). Deze methode van gastro-intestinale microbiële RNA isolatie kan gemakkelijk worden aangepast aan andere bacteriën en schimmels ook.
De RNA-extractie hier beschreven methode maakt het mogelijk herstel van voldoende hoeveelheden van hoge kwaliteit Pseudomonas aeruginosa totaal RNA geoogst uit de muizen maag-darmkanaal. Deze methode is niet beperkt tot P. aeruginosa en kan eventueel worden toegepast op andere bacteriën. Het herstel van voldoende micro-organismen uit de darm zal aanzienlijk verschillen van organisme tot organisme. In ons muismodel, P. aeruginosa koloniseert meestal de muizen maagdarmkanaal op een niveau tussen 5 x 10 7 tot 5 x 10 8 kve / g feces 4. Sinds de herstelde cecal inhoud zijn ongeveer 0,5 gram, het geschatte aantal van P. aeruginosa hersteld van twee cecums is tussen de 5 x 10 7 tot 5 x 10 8 kve. Als er andere micro-organismen worden gebruikt, zou het verstandig zijn om GI kolonisatie niveaus te controleren en vervolgens het aantal cecums nodig is om het beoogde aantal kve terug te berekenen. Het is ook belangrijk op te merken dat bij het gebruik van dit muismodel, antibiotica-behandelde muizen niet besmet met PA geen meetbare hoeveelheden RNA geïsoleerd van hun cecal inhoud hebben.
Onze muizenmodel van Pseudomonas aeruginosa gastro-intestinale kolonisatie en verspreiding pogingen om de pathogenese van P. emuleren aeruginosa bacteriëmie bij kanker en stamcel transplantatie patiënten. In deze patiëntengroep, is commensale flora vaak uitgeput secundair aan antibiotica of chemotherapeutische behandeling (bijvoorbeeld het antibioticum uitputting van de GI commensale flora), resulterend in overgroei van pathogene micro-organismen (bijvoorbeeld mono-associatie met P. aeruginosa) en de daaropvolgende verspreiding na het immuunsysteem onderdrukken. De voordelen en beperkingen van dit muismodel zijn al eerder vier aangepakt. Het doel van deze huidige studie is een methode te bieden voor het isoleren van microbiële totaal RNA uit het spijsverteringskanaal. Dit protocol kan eenvoudig aangepast worden aan andere muismodellen dat andere aspecten van microbiële pathogenese in het maagdarmkanaal (dat wil zeggen commensale flora interacties, bacteriële effecten op inflammatoire darmziekte, etc.) te bestuderen.
Een voordeel van deze methode is het opnemen van meerdere lysis stappen waaronder vries / dooi, mechanische verstoring (verpulveren met mortel / stamper, homogeniseren), koken, en chemische lysis (bijv. SDS). Ondanks de veelheid aan lysis stappen, kunnen sommige micro-organismen (met name Gram-positieve bacteriën en schimmels / gisten) extra mechanische storing. Na de hete lysis / zuur fenol-chloroform incubatie (Stap 3.5), de toevoeging van parels (0,1 mm voor bacteriën en / of 0.5-0.7 mm voor gist) en een volgende kraal-beating stap moet voldoende zijn om deze organismen 9 lyseren, 10.
Gezien de complexe aard van de materialen hersteld van de muizen blindedarm, de herhaalde koude acid-phenol/chloroform extracties (Stap 3,7 tot 3,9), zijn absoluut nodig om acceptabele RNA kwaliteit en integriteit voor verder stroomafwaarts reacties te bereiken. Tussen 3-5 koude acid-phenol/chloroform extracties kan nodig zijn voordat de witte interface tussen de waterige en organische fasen wordt geëlimineerd. Ten slotte is de combinatie van zowel de DNase behandeling (stap 4) en RNeasy Cleanup Protocol (stap 5) zijn essentieel voor het verwijderen van vervuilende DNA en kleine, niet-mRNA (5s en tRNA). Zoals eerder vermeld, de RNA-teruggewonnen door gebruik te maken van dit protocol is van voldoende kwantiteit en kwaliteit voor latere transcriptie profilering 3, qPCR (niet gepubliceerd), en RNA Seq (niet gepubliceerd) experimenten.
The authors have nothing to disclose.
Dit werk werd gefinancierd door de National Institutes of Health beurzen AI62983 (AYK), AI22535 (GPB).
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
---|---|---|
Mortar and Pestle | Fisher | 12-947-1 |
Homogenizer | Omni | TM-125 |
Oak Ridge centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050 |
Acid Phenol/Chloroform | Ambion | AM9720 |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 |
Isoamyl Alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 |
DNase | Ambion | AM2238 |
RNeasy Kit | Qiagen | 74104 |
3M Sodium Acetate | Ambion | AM9740 |
100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 |