शाही सेना के अलगाव के लिए एक विश्वसनीय विधि<em> Pseudomonas aeruginosa</em> Murine cecums से बरामद वर्णित है. बरामद शाही सेना और बाद qPCR, प्रतिलेखन रूपरेखा, और आरएनए Seq प्रयोगों के लिए पर्याप्त मात्रा और गुणवत्ता की है. इस तकनीक को अन्य आंत्र रोगाणुओं की शाही सेना के अलगाव के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Pseudomonas aeruginosa (PA) महत्वपूर्ण समझौता लेकिमिया के साथ रोगियों, गंभीर जला घाव, या अंग प्रत्यारोपण के एक जैसे प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ मेजबान में रुग्णता और मृत्यु दर में संक्रमण परिणाम. फिलीस्तीनी अथॉरिटी खून में संक्रमण के विकास के लिए उच्च जोखिम में रोगियों में जठरांत्र संबंधी मार्ग (GI) 2 उपनिवेशण के लिए मुख्य जलाशय है, लेकिन तंत्र है जिसके द्वारा एक स्पर्शोन्मुख बस्तियां सूक्ष्म जीव से एक आक्रामक है, और अक्सर घातक पीए संक्रमण, रोगज़नक़ स्पष्ट नहीं कर रहे हैं. इससे पहले, हम पीए mRNA बैक्टीरियल कोशिकाओं के cecums में रहने से ठीक 3 चूहों उपनिवेश क्रम में मेजबान प्रतिरक्षा स्थिति के लिए परिवर्तन के दौरान जीवाणु जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन की पहचान के द्वारा vivo में प्रतिलेखन रूपरेखा प्रयोगों में प्रदर्शन किया.
किसी भी प्रतिलेखन रूपरेखा के साथ प्रयोग के रूप में, उच्च गुणवत्ता mRNA की पर्याप्त मात्रा के अलगाव में कदम दर सीमित है. एंजाइमों, मलबे, खाद्य अवशेषों, और GI पथ में बात कण की बहुतायत को देखते हुए, शाही सेना के अलगाव की चुनौती कठिन है. यहाँ, हम murine GI पथ से बरामद बैक्टीरियल शाही सेना के विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य अलगाव के लिए एक विधि प्रस्तुत करते हैं. यह विधि एक अच्छी तरह से स्थापित पीए सैनिक उपनिवेशण और neutropenia प्रेरित 4 प्रसार के murine मॉडल का इस्तेमाल करता. फिलीस्तीनी अथॉरिटी के साथ एक बार सैनिक उपनिवेशण की पुष्टि की है, चूहों euthanized और cecal सामग्री बरामद फ़्लैश जमे हुए हैं. आरएनए तो व्यवधान यांत्रिक, उबलते, फिनोल / क्लोरोफॉर्म extractions, DNase उपचार, और आत्मीयता क्रोमैटोग्राफी का एक संयोजन का उपयोग कर निकाला है. मात्रा और शुद्धता spectrophotometry (Nanodrop टेक्नोलॉजीज) और bioanalyzer (Agilent टेक्नोलॉजीज) (चित्र 1) के द्वारा पुष्टि कर रहे हैं. सैनिक माइक्रोबियल आरएनए अलगाव का यह तरीका आसानी से अन्य जीवाणु और कवक के रूप में अच्छी तरह से अनुकूलित किया जा सकता है.
शाही सेना निष्कर्षण विधि यहाँ वर्णित उच्च गुणवत्ता Pseudomonas aeruginosa कुल murine GI पथ से काटा शाही सेना के लिए पर्याप्त मात्रा की वसूली के लिए अनुमति देता है . इस विधि के लिए पी. लिए आरक्षित नहीं है aeruginosa और संभावित अन्य जीवाणुओं के लिए लागू किया जा सकता है . आंत से पर्याप्त माइक्रोबियल जीवों की वसूली में काफी जीव से जीव के लिए अलग अलग होंगे. हमारे murine मॉडल, पी. aeruginosa आमतौर पर 5 10 x 7 से 5 x 10 / 8 cfu जी 4 मल के बीच murine स्तरों पर GI पथ colonizes . चूंकि cecal सामग्री बरामद 0.5 मोटे तौर पर ग्राम, पी. की अनुमानित संख्या दो cecums से बरामद aeruginosa 5 x 10 7 करने के लिए 5 x 8 10 cfu के बीच है . यदि अन्य सूक्ष्मजीवों का उपयोग किया जाता है, यह समझदारी सैनिक उपनिवेशण के स्तर को सत्यापित करने और फिर cfu की लक्षित संख्या ठीक करने की जरूरत cecums की संख्या की गणना होगा. यह भी महत्वपूर्ण है ध्यान दें कि जब इस विशेष murine मॉडल का उपयोग कर, एंटीबायोटिक इलाज फिलीस्तीनी अथॉरिटी के साथ नहीं संक्रमित चूहों शाही सेना का कोई quantifiable मात्रा उनके cecal सामग्री से अलग है.
हमारे Pseudomonas aeruginosa जठरांत्र उपनिवेशण और प्रसार पी. के रोगजनन का अनुकरण करने का प्रयास की murine मॉडल कैंसर और स्टेम सेल प्रत्यारोपण के रोगियों में bacteremia aeruginosa. इस रोगी जनसंख्या में, खानेवाला वनस्पति अक्सर एंटीबायोटिक या chemotherapeutic (उदाहरण के लिए सैनिक खानेवाला वनस्पति के एंटीबायोटिक रिक्तीकरण) उपचार रोगजनक रोगाणुओं के अतिवृद्धि (जैसे मोनो पी. aeruginosa के साथ संघ) में जिसके परिणामस्वरूप के लिए माध्यमिक समाप्त हो गया है और प्रतिरक्षा दमन के बाद फिर बाद के प्रसार. इस murine मॉडल के फायदे और सीमाएं पहले से ही 4 पहले से संबोधित किया गया है . इस वर्तमान अध्ययन के उद्देश्य से GI पथ से माइक्रोबियल कुल शाही सेना को अलग करने के लिए एक पद्धति प्रदान की है. इस प्रोटोकॉल को आसानी से अन्य murine मॉडल है कि GI पथ (यानी खानेवाला वनस्पति बातचीत, सूजन आंत्र रोग, आदि पर बैक्टीरिया प्रभाव) में माइक्रोबियल रोगजनन के अन्य पहलुओं का अध्ययन करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
इस पद्धति का एक लाभ यह फ्रीज / पिघलना, यांत्रिक (/ मोर्टार और मूसल homogenization के साथ pulverizing) विघटन, उबलते, और रासायनिक lysis (जैसे एसडीएस) सहित कई lysis चरणों का समावेश है. Lysis चरणों की भीड़ के बावजूद, कुछ सूक्ष्मजीवों (विशेषकर ग्राम पॉजिटिव बैक्टीरिया और कवक खमीर /) अतिरिक्त यांत्रिक विघटन की आवश्यकता हो सकती है. गर्म lysis / एसिड phenol के क्लोरोफॉर्म ऊष्मायन (3.5 चरण), मोती (बैक्टीरिया और खमीर के लिए / या 0.5-0.7 मिमी लिए 0.1 मिमी) के अलावा और बाद में एक कदम मनका पिटाई के बाद इन 9 जीवों lyse करने के लिए पर्याप्त होना चाहिए, 10.
Murine अंधान्त्र, दोहराया ठंड acid-phenol/chloroform extractions (3.7 करने के लिए 3,9 चरण) से बरामद माल की जटिल प्रकृति को देखते हुए बिल्कुल क्रम में स्वीकार्य शाही सेना और आगे डाउनस्ट्रीम प्रतिक्रियाओं के लिए गुणवत्ता और अखंडता को प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं. 3-5 ठंड acid-phenol/chloroform extractions के बीच जलीय और जैविक चरणों के बीच सफेद अंतरफलक से पहले की आवश्यकता हो सकती है सफाया. अंत में, दोनों DNase (4 चरण) उपचार और RNeasy सफाई प्रोटोकॉल (कदम 5) के संयोजन डीएनए contaminating और छोटे गैर – mRNA (5s और tRNA) को हटाने के लिए आवश्यक हैं. जैसा कि पहले कहा, इस प्रोटोकॉल का उपयोग करके बरामद शाही सेना और बाद प्रतिलेखन रूपरेखा 3 qPCR (अप्रकाशित) और आरएनए Seq प्रयोगों (अप्रकाशित) के लिए पर्याप्त मात्रा और गुणवत्ता की है .
The authors have nothing to disclose.
यह काम स्वास्थ्य अनुदान AI62983 के राष्ट्रीय संस्थान (AYK), AI22535 (GPB) द्वारा वित्त पोषित किया गया था.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
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Mortar and Pestle | Fisher | 12-947-1 |
Homogenizer | Omni | TM-125 |
Oak Ridge centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050 |
Acid Phenol/Chloroform | Ambion | AM9720 |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 |
Isoamyl Alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 |
DNase | Ambion | AM2238 |
RNeasy Kit | Qiagen | 74104 |
3M Sodium Acetate | Ambion | AM9740 |
100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 |