RNA提取的一种可靠的方法<em>绿脓杆菌</em从小鼠cecums恢复描述。回收的RNA是足够的数量和质量,为后续的qPCR,转录分析和RNA序列的实验。这种技术可以适用于RNA等肠道微生物的隔离。
铜绿假单胞菌 (PA)感染导致显著的发病率和死亡率与免疫系统受损,如白血病患者,严重的烧伤创面,或器官移植1,的主机。开发PA血液感染的高危患者,胃肠道(GI)的主要水库定植 2,但机制PA的转换,从无症状的殖民微生物侵入性,而且往往是致命的的,病原体也不清楚。在此之前,我们进行了恢复从细菌细胞中的cecums居住的PA mRNA的殖民小鼠3,以确定在宿主的免疫状态的改变细菌基因表达的变化在体内的转录分析实验。
任何转录分析实验,限速步骤是在足够数量的高质量的mRNA隔离。鉴于大量的酶,碎片,食物残渣,消化道颗粒物,RNA提取的挑战是艰巨的。在这里,我们提出了一个可靠和可重复性的方法从小鼠胃肠道细菌RNA的隔离。这种方法利用了PA胃肠道的定植和中性粒细胞减少症引起的传播 4的行之有效的小鼠模型。一旦胃肠与PA定植证实,老鼠是安乐死和盲肠内容是恢复和速冻。 RNA,然后采用机械破碎,沸点,酚/氯仿抽提,DNA酶处理,和亲和层析结合提取。数量和纯度均证实光度法(Nanodrop技术)和生物分析仪(安捷伦科技)(图1)。这对胃肠道微生物的RNA分离方法可以很容易地适应以及其他细菌和真菌。
这里描述的RNA提取方法,可以回收足够数量的高品质的绿脓杆菌总RNA从小鼠胃肠道的收获。这种方法不仅限于体育假单胞菌和有可能被应用到其他细菌。足够从肠道微生物的恢复会有所不同显著有机体。在我们的小鼠模型, 体育绿脓杆菌通常寄生水平的小鼠胃肠道5 × 10 7 5 × 10 8 CFU /克粪便 4 。由于回收的盲肠内容是大约0.5克,P的估计数目从两个cecums收回假单胞菌是5 × 10 7 5 × 10 8 CFU之间。如果使用其他微生物,这将是审慎的做法来验证消化道定植的水平,然后计算出需要恢复CFU针对性cecums的数量。同样重要的是要注意,当使用这个特殊的小鼠模型,与PA感染的抗生素治疗的老鼠有没有量化的数额从盲肠内容分离的RNA。
我们的小鼠模型绿脓杆菌胃肠道的定植和传播试图效仿 P的发病绿脓杆菌菌血症在癌症和干细胞移植的患者。在这个病患族群,共生菌群失调往往是耗尽继发抗生素或化疗治疗(如GI共生菌群的抗生素消耗),导致病原微生物的过度生长( 如单与绿脓杆菌),那么随后的传播后的免疫抑制。这个小鼠模型的优点和局限性已经得到解决以前4。目前的研究的目的是提供一种方法,从消化道隔离微生物总RNA。该协议可以很容易地适应其他小鼠模型,研究在胃肠道微生物的发病机制等方面(即共生菌群的相互作用,炎症性肠病等细菌的影响)。
这种方法的优点之一是多个裂解步骤,包括冻结/解冻,机械破碎(粉碎砂浆/杵,同质化),沸点,化学裂解(如SDS),注册成立。尽管众多的裂解步骤,一些微生物(特别是革兰氏阳性细菌和真菌/酵母菌)可能需要额外的机械破坏。热裂解/酸酚-氯仿孵化(步骤3.5),珠除了细菌,酵母和/或0.5-0.7毫米(0.1毫米)和随后珠 打一步后,应足以裂解这些生物体 9, 10。
由于小鼠盲肠,反复感冒acid-phenol/chloroform提取(3.7至3.9步)的回收材料的复杂性是绝对必要的,以达到可以接受的RNA的质量和完整性作进一步的下游反应。 3-5冷acid-phenol/chloroform拔牙前必须消除白色水相和有机相之间的界面。最后,双方的DNA酶处理(步骤4)的RNeasy清理协议(步骤5)相结合的方式,去除污染的DNA和小非的mRNA(5S和tRNA)是必不可少的。如前所述,利用该协议回收的RNA随后的转录分析,定量PCR(未出版),和RNA序列(未发表)实验的足够数量和质量。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是由国家卫生赠款AI62983研究院(AYK),AI22535(GPB)。
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
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Mortar and Pestle | Fisher | 12-947-1 |
Homogenizer | Omni | TM-125 |
Oak Ridge centrifuge tubes (50 ml) | Nalgene | 3119-0050 |
Acid Phenol/Chloroform | Ambion | AM9720 |
Chloroform | Sigma-Aldrich | C2432 |
Isoamyl Alcohol | Sigma-Aldrich | W205702 |
Isopropanol | Sigma-Aldrich | 190764 |
Diethyl pyrocarbonate (DEPC) | Sigma-Aldrich | 40718 |
DNase | Ambion | AM2238 |
RNeasy Kit | Qiagen | 74104 |
3M Sodium Acetate | Ambion | AM9740 |
100% Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 |