MISSION LentiPlex Samlede shRNA Library Screening i pattedyrceller

Summary

Her bruker vi et menneske LentiPlex samlet bibliotek og tradisjonelle sekvensering metoder for å identifisere genet mål å fremme celle overlevelse. Vi viser hvordan du setter opp og deconvolute en LentiPlex skjermen og validere resultatene.

Abstract

RNA interferens (RNAi) er en iboende cellulær mekanisme for regulering av genuttrykk. Utnytte det medfødte kraft av dette systemet gjør oss i stand til å knockdown genuttrykk nivåer i tap av gen-funksjon studier.

Det er hovedsakelig to metoder for å utføre RNAi. Den første er bruken av små interfererende RNA (siRNAs) som er kjemisk syntetisert, og den andre benytter short-hårnål RNA (shRNAs) kodet innen plasmider ^1. Sistnevnte kan transfektert inn i celler direkte eller pakket inn replikering inkompetent lentiviral partikler. De viktigste fordelene med å bruke lentiviral shRNAs er enkel innføring i en rekke celletyper, deres evne til å stabilt integrert i genomet for langsiktig genet knockdown og utvalg, og deres effekt i å gjennomføre high-throughput tap av funksjon skjermer. For å lette dette har vi skapt LentiPlex samlet shRNA bibliotek.

MISSION LentiPlex Menneskelig shRNA Samlet Library er et genom-wide lentiviral pool produsert ved hjelp av en egenutviklet prosess. Biblioteket består av over 75 000 shRNA konstruerer fra TRC kolleksjon rettet mot 15000 + menneskelige gener ^2. Hver biblioteket er testet for shRNA representasjon før produktet lanseres for å sikre robuste bibliotek dekning. Biblioteket er gitt i en ferdig til bruk lentiviral format ved titere av minst 5 x 10 ⁸ TU / ml via p24 analysen og er pre-delt inn i ti subpools på ca 8000 shRNA konstruerer hver. Forsterkning og sekvensering primere tilbys også for nedstrøms mål identifisering.

Tidligere studier etablert en synergistisk antitumor aktivitet av TRAIL når det kombineres med paklitaxel i A549 celler, et menneske lungekarsinom cellelinje ^{3, 4.} I denne studien demonstrerer vi anvendelsen av en samlet LentiPlex shRNA biblioteket for å raskt gjennomføre en positiv utvelgelse skjerm for gener som er involvert i cytotoksisitet of A549 celler når de utsettes for TRAIL og Paclitaxel. En barriere ofte møtt med high-throughput skjermer er kostnaden og vanskeligheter i deconvolution, vi også detalj en kostnadseffektiv polyklonale tilnærming benytte tradisjonelle sekvensering.

Protocol

LentiPlex Samlet Screen Setup

Å identifisere shRNA sekvenser av interesse, er det avgjørende å sette opp skjermen slik at de fleste cellene mottar bare ett shRNA konstruere. Ved å bruke en lav MOI (mangfold av infeksjon), er sannsynligheten for flere integrants per celle sterkt redusert. Men transduksjon effektivitet, og derfor ønsket fuktighet, avhenger sterkt på målcellen type. Derfor er det viktig at fastsettelse av optimal MOI utføres før skjermen i en ny celle type.

1. Transduksjon i målcellene med Mission LentiPlex Samlet shRNA Library

1. Selve MOI som brukes vil variere for ulike celletyper. Hvis gjentak er ønsket deretter antall plater må økes tilsvarende. I tillegg, typisk det ikke vil være en fordel å kombinere de ulike subpools. Holde subpools separate vil hjelpemiddel i deconvolution prosessen. Sikre proper merking av hver vev kultur tallerken med subpool tallet som er brukt under transduksjon. En lav MOI er rådet til å redusere sannsynligheten for flere integrants per celle.
2. Dag 1 - Seed riktig antall 60-mm retter med nok celler til å få ~ 70% confluency på følgende dag (10 bassenger i alt, hver utført i tre eksemplarer = 30 retter totalt). For vår studie var 60 mm retter seeded med 6 x 105 A549 celler for å oppnå en confluency på 70% før transduksjon. Dette sikrer at cellene fortsatt er i den eksponentielle vekstfasen. Vekstrater vil variere etter celletype og må bestemmes før start skjermen.
3. La cellene å følge med incubating over natten ved 37 ° C i en fuktet inkubator i en atmosfære av 5% CO _2.
4. (Valgfritt) Inkluder to ekstra 60-mm retter for transduksjon med negativ kontroll shRNAs. Etikett rettene "Control A" for SHC001H og "Control B" for SHC002H.
5. Dag 2 - Transduce the celler med LentiPlex viruspartikler. På dagen for transduksjon, tine lentiviral partikler på is.
6. Overfør tint partiklene til en laminær hette og holde på is hvis det ikke brukes umiddelbart.
7. Beregn hvor mye av hver enkelt viral sub-bassenget for å legge til cellene for å få MOI av 1 over alle cellekultur retter.
   1. Eksempel: 1 x 10 ⁶ celler / kar, Viral titer = 5 x 10 ⁸ TU / ml; en ønsket MOI av 1. I.) 1 x 10 ⁶ celler / parabol x (MOI av 1) = 1 x 10 ⁶ transducing enheter (TU) som trengs ii.) 1 x 10 ⁶ TU / (5,0 x 10 ⁸ TU / ml) hentet fra C A = 2 mL av lentiviral stamløsningen bør legges til den aktuelle parabolen. Fortynn den beregnede mengden av virus i 100-300 mL av komplette media for å sikre bedre fordeling av viruset da lagt til cellekultur parabolen.
8. Fjern utskriftsmateriale fra pre-seeded celler. Legg komplett media Containing hexadimethrine bromide løsning til hver rett. Den anbefalte endelig konsentrasjon på hexadimethrine bromide i media er 8 mikrogram / ml. Bruk mindre hexadimethrine bromide hvis du synes det å være giftig for din målcellene.
9. Legg shRNA lentiviral partikler til passende retter i samsvar med forutbestemte eksperimentell design. Forsiktig virvel platene til jevnt distribuere virus på tvers av cellene.
10. Inkuber 18-20 timer ved 37 ° C i en fuktet inkubator i en atmosfære av 5% CO _2.
11. (Valgfritt) Gjenta 3-8 ved identisk MOI med SHC001H (tom vektor shRNA Control) i Kontroll Dish A og SHC002H (eggerøre shRNA kontroll) i Kontroll Dish B. Unn disse rettene identisk til den eksperimentelle retter hele forsøket.
12. Dag 3 - Endre media. Aspirer virus som inneholder media og tilsett frisk komplett media (uten hexadimethrine bromide). Inkuber cellene ved 37 ° C over natten.

2. Unn belagtceller med terapeutiske komponent / reagens

1. Dag 4 - Aspirer media fra brønner og legge frisk medier som inneholder terapeutiske komponent ved optimal konsentrasjon. Som med kultur vilkår, vil behandlinger varierer og riktig konsentrasjon og varigheter bør bestemmes på forhånd. I vår studie, brukte vi 100 ng / ml av TRAIL og 1 mM av Paclitaxel. Celler ble behandlet i 48 timer.
2. Surviving celler bør re-seeded inn T75 kolber og lov til å utvide til nesten 100% confluent.
3. (Valgfritt) På slutten av utvalget, inspisere Kontroll Dish A og kontroll Dish B. Dish A og oppvask B bør hver ha færre kolonier enn minst ett av de samlede bibliotek retter. Hvis det er et uventet høyt antall kolonier i Dish A, enn enten transduksjon prosessen har påvirket en vei relatert til ønsket fenotype eller selektive trykket ikke er tilstrekkelig sterkt og re-optimalisering av analysen kan være nødvendig. Hvis Dish B inneholder for mange kolonier, Deretter uttrykk for shRNA og engasjement av RNAi veien kan ha en effekt på fenotypen av interesse. Hvis dette er tilfelle gjenta med SHC001H, for å sikre at effekten ikke er spesifikke for SHC002H.

3. Deconvolution fra en polyklonale celle befolkning

1. Høste heterogen populasjon av celler fra hver subpool og isolere genomisk DNA. I studien vår, ble cellene vasket kort i PBS og trypsinized før genomisk DNA ble isolert med GenElute pattedyr Genomisk Miniprep kit og levert protokoll (Sigma-Aldrich, G1N70). Alternativt kan andre genomisk rensing kits som er tilgjengelig på markedet brukes til DNA isolasjon. Det er viktig å følge protokoll anbefalinger for start mengden av dyrkede celler.
2. PCR forsterkning av mål. Den shRNA Malen recovery prosedyren muliggjør forsterkning av hele pool av shRNA innstikk fra den valgte cellen befolkningen, eller henting av indidual shRNA maler fra koloniene som ble individuelt plukket og utvidet. Etter forsterking av shRNA innstikk fra kontroll og utvalgte målcellene, kan PCR produktene være sekvensert.
3. Denne PCR amplifisering skritt var optimalisert ved hjelp av Sigma ReadyMix, Catalog No P2893. Andre reagenser kan brukes til forsterkning, men sykling forhold og / eller magnesium konsentrasjon må endres for vellykket forsterkning. Forsterkning primere på konsentrasjon 20 mm følger med LentiPlex kit.
4. Sett opp PCR reaksjonen som beskrevet i Tabell 1. Legg komponentene i den rekkefølgen de står. De beskrevne mengder er for en 50 mL reaksjon. For flere reaksjoner, skalere mesteren bland komponenter med ønsket antall reaksjoner og inkluderer 10% overskudd. Mengden DNA mal anbefales er 50-100 ng.
5. Det anbefales sterkt at for en reaksjon malen består av MISSION shRNA Menneskelig positiv kontroll Vector fortynnet til approprIate konsentrasjon. Vellykket forsterkning med denne malen indikerer at PCR analysen komponenter og sykling forholdene er tilstrekkelig. MERK: For å hindre carryover forurensing av eksperimentelle prøver og reagenser, er det foreslått at den positive kontroll fortynnes i et eget sted hvor etterfølgende PCR reaksjoner er satt opp.
6. Lagre PCR program listet i tabell 2 i thermocycler din.
7. For hver prøve, kombinere 3 mL PCR reaksjon med 1 mL av fargestoff og electrophorese sammen 5 mL av DirectLoad ™ PCR 100 bp Low Stige, Catalog Number D3687 på 1% agarose gel for å bekrefte tilstedeværelsen av en 309 bp amplicon.
8. Subcloning av PCR amplicons: PCR produkter ble Topo klonet med Topo-TA kloning kit, etter produsentens protokoll (Invitrogen, K4575-01). Resultatet er at man PCR produktet finnes i hver vektor.
9. 250 Individuell bakterie kolonier (hver inneholder en individuell PCR amplicon) ble isolert og voksen i 2 mL kulturer av LB med 100 mg / ml ampicillin. Plasmid DNA ble så ekstrahert med GenElute Plasmid Miniprep kit (Sigma-Aldrich, PLN70).
10. Renset plasmid DNA ble fordøyd med EcoRI og electrophoresed å bekrefte tilstedeværelse av innsatsen.
11. Plasmid DNA-prøvene ble deretter sekvensert og shRNA sett identifiseres ved hjelp av LentiPlex shRNA Sequence Søk database følger med LentiPlex biblioteket.

Fire. Target Identifisering og validering

1. Den shRNA Sekvensen starter med 5'-GAAACACCGG-3 '. Skriv inn minst de neste 10, men mindre enn 21 nukleotider som spørringen sekvens i søkeboksen på vedlagte shRNA Sequence Søk Access database form.
2. Velg arter av den samlede shRNA. Du kan også velge den subpool som sekvensen ble funnet.
3. Klikk nå på "Finn Potensielle Hits"-knappen for å utføre søket. Dette bør identifisere tilsvarende TRC shRNA sekvens (s) som passer the sekvensering data. Mer informasjon om TRC shRNA sekvens (s) identifisert og tilsvarende genet målene lett kan finnes på Sigma-Aldrich er din favoritt Gene: http://www.sigma.com/yfg
4. Identifiserte mål gener skal valideres ved å gjenta den opprinnelige screening analysen med den opprinnelige TRC klone pluss minst to ekstra shRNAs at målet det samme genet ved hjelp av en en shRNA til 1-brønnen format. Ekte treff vil vise det samme fenotypen i et flertall av brønner.

5. Representant Resultater

Et eksempel på en LentiPlex samlet skjerm arbeidsflyt er beskrevet i figur 1. Transduced celler som proliferated i nærvær av TRAIL og Paclitaxel fikk lov til å utvide til kolber var confluent. Genomisk DNA ble høstet og utsatt for PCR amplifisering og kloning som illustrert i figur 1 A, før de ble sendt for sekvensering og shRNA identifikasjon som beskrevet i Figure 1 C. 250 kloner ble sekvensert, av disse 25 var representert ved flere kloner og de resterende 225 var representert med bare en klone og ble ikke fulgt på dette tidspunktet.

Som vist i figur 2, ble flere kandidat gener inkludert TBX3, PPP2CA, og AKT2 representert ved flere kloner. T-box transkripsjonsfaktor, dukket TBX3 i totalt fire kloner og har vært innblandet i tumor migrasjon ^5. PPP2CA downregulation har vist seg å opprettholde veksten av LNCaP celler dyrket i androgen mangelfulle forhold ved lindrende androgen-deprivasjon-indusert celle-syklus arrest og hindre apoptose ^6. AKT2 er en RAC-beta serin / treonin-protein kinase og mulige onkogen demonstrert til å spille flere roller i kreft ^{syv utvikling, 8.}

* Endelig konsentrasjonen av Mg ^{2 +} i løsningen vil være 3 mm;1,5 mm er bidratt fra Taq ReadyMix og 1,5 mm fra Magnesiumklorid løsningen.
Tabell 1. Lentiplex PCR reaksjon betingelser

Tabell 2. Lentiplex PCR Amplification Program

Figur 1. (A) LentiPlex samlet skjerm, (B) polyklonale deconvolution arbeidsflyt, og (C) identifikasjon av shRNA mål.

A. LentiPlex sammenslåtte skjermen. Først Seed celler, deretter legge shRNA subpools, (10 bassenger i alt, hver utført i tre eksemplarer, for 30 retter totalt). Neste, behandle med terapeutiske komponent / reagens (i vårt tilfelle, TRAIL og Paclitaxel, henholdsvis). Deretter reseed overlevende celler i kolber og tillate å utvide. Høste heterogen populasjon av celler fra hver subpool og isolere genomisk DNA.

B. polyklonale deconvolution. Utfør PCR å forsterke DNA inneholder shRNA innsatsen. PCR-produktet er ensartet i størrelse, men polyklonale i rekkefølge ettersom malen gDNA ble også polyklonale. PCR produkt er klonet inn i vektor og deretter forvandlet til kompetente bakterier.

C. Identifikasjon av shRNA mål. Enkelte kolonier er isolert og plasmid DNA blir ekstrahert. Hver klone inneholder kloning vektor med ett individ PCR fragment. Plasmid DNA er fordøyd å bekrefte tilstedeværelsen av innsatsen og sekvensert. Den shRNA setter er identifisert ved hjelp av LentiPlex shRNA Sequence Søk database.

Figur 2. Identifiserte Candidate Gener. 25 kandidat gener ble identifisert som hadde flere hits. 225 kandidat gener hadde bare en hit og ble ikke forfulgt. Se Utfyllende tabell 1 for en oversikt over de enkelte kloner per kandidat genet.

Utfyllende Tabell 1. Individuelle TRC Library kloner identifisert fra polyklonale Sekvensering Gene ID Treff Detected kloner.

Discussion

I denne studien presenterer vi et genom-wide skjermen for å identifisere gener involvert i cytotoksisitet av A549 celler følgende paklitaksel / TRAIL behandling. Bruken av en samlet tilnærming i et genom-wide skjerm reduserer tid, kostnad og utstyr investering som vanligvis forbindes med konvensjonelle kledd skjermer. Kritisk til suksessen av skjermen er optimalisering eksperimenter utført på forhånd. Transduksjon forhold og MOI skal være empirisk bestemmes.

Valget Metoden bør tillate for robust utvalg av celler som viser ønsket fenotypen (f.eks, overlevelse, overflate protein uttrykk, etc). Optimalisering av disse parametrene vil redusere antall falske positiver oppdaget.

Her ble gDNA høstet fra bulk populasjon av utvalgte celler og deretter Topo klonet å identifisere individuelle shRNA inserts. En mulig forbedring for dette eksperimentet ville vært å velge for levende celler ved hjelp FACS å sikreat bare levende celler samles. De identifiserte målene vil bli validert ved transduksjon med target-spesifikke shRNAs i en screening analysen. Ekte treff vil vise fenotypen i et flertall av brønner.

Den LentiPlex Samlede Library er fleksibel i sin søknad. Den er kompatibel med et bredt utvalg av downstream applikasjoner og kan brukes med enten positiv eller negativ seleksjon strategier. Avhengig av screening forhold, deconvolution av shRNA innstikk gjøres via PCR / kloning, microarray, eller neste generasjons ^{9 sekvensering, 10.} Mens kraften og hastigheten på disse teknikkene til deconvolute RNAi skjermene er godt etablert, en bekymring med mikromatriser og neste generasjons sekvensering metoder er tilgjengeligheten av bioinformatikk ressurser og kunnskap som trengs for å riktig analysere og tolke eksperimentelle resultater. Kostnadene forbundet med disse teknikkene kan ofte være en barriere for foretaket av genomet brede skjermer. APCR / kloning tilnærming, mens ikke så kraftig som microarrays og neste generasjons sekvensering er en effektiv og rimeligere alternativ.

Agilent tilbyr nå en tilpasset array basert på TRC shRNA biblioteket til videre hjelp i LentiPlex skjermer. Disse valgene tillate forskere å bruke LentiPlex å studere en rekke ulike cellulære funksjoner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
LentiPlex Pooled Array	Sigma-Aldrich	SHPH01
A549 Cells	ATCC	CCL-185
TRAIL	Sigma-Aldrich	T5694
Paclitaxel	Sigma-Aldrich	T7402
Topo TA Cloning Kit	Invitrogen	K4575-01
JumpStart Taq ReadyMix	Sigma-Aldrich	P2893
GenElute Plasmid Miniprep kit	Sigma-Aldrich	PLN70
EcoR1	New England Biolabs	R0101
hexadimethrine bromide	Sigma-Aldrich	H9268