Härledning av anrikat Oligodendrocyte kulturer och Oligodendrocyte / Neuron Myelinating Co-kulturer från Postnatal Murine vävnader

Summary

Den här artikeln beskriver metoder för att beräkna berikad populationer av murina oligodendrocyte föregångare celler (OPC) i primär kultur, som skiljer för att producera mogna oligodendrocyter (OLS). Dessutom beskrivs i rapporten tekniker för att producera murina myelinating co-kulturer med sådd musen OPCs på en neurite bädd av musen dorsal nervceller rot ganglion (DRGNs).

Abstract

Identifiera de molekylära mekanismerna bakom OL utveckling är inte bara avgörande för att främja vår kunskap om OL biologi, men har även betydelse för att förstå patogenesen vid demyeliniserande sjukdomar som multipel skleros (MS). Mobil utveckling är ofta studeras med primär modeller cellkultur. Primära cellkulturer underlättar utvärderingen av en viss celltyp genom att erbjuda en kontrollerad miljö, fri från främmande variabler som finns in vivo. Medan OL kulturer från råttor har gett en stor mängd insikter i OL biologi, har liknande försök till upprättandet OL kulturer från möss mötts med stora hinder. Utveckla metoder för att kulturen murina primära Ols är absolut nödvändigt för att kunna dra nytta av den tillgängliga transgen mus linjer.

Flera metoder för utvinning av OPCs från gnagare vävnad har beskrivits, från neurosphere härledning, differential vidhäftning rening och immunopurification ^1-3. Medan många metoder ger framgång, de flesta kräver omfattande kultur gånger och / eller dyr utrustning / reagenser. För att kringgå detta är rena OPCs från murina vävnad med en anpassning av den metod som ursprungligen beskrevs av McCarthy & de Vellis ² att föredra. Metoden innebär att fysiskt separera OPCs från en blandad gliaceller kultur härstammar från neonatal gnagare cortex. Resultatet är en renad OPC befolkning som kan delas in i en OL-berikad kultur. Detta tillvägagångssätt är tilltalande på grund av dess relativt korta kultur tid och onödiga krav på tillväxtfaktorer eller immunopanning antikroppar.

Och samtidigt undersöka mekanismerna för OL utveckling i ett renat kultur är informativ, ger den inte den mest fysiologiskt relevanta miljö för att bedöma myelinskidan bildas. Co-odling OLS med nervceller skulle låna insikt i de molekylära grunderna som reglerar OL-medierad myelination av axoner. För många OL / neuron co-kultur studier har dorsala ganglion neuron (DRGNs) visat sig vara den neuron typ av val. De är idealiska för co-kultur med OLS på grund av deras enkla utvinning, minimalt förorenande celler, och bildandet av tät neurite bäddar. Även studier med råtta / mus myelinating xenocultures har publicerats ^4-6, OL / DRGN en metod för härledning av dessa myelinating co-kulturer från postnatal murin vävnad inte har beskrivits. Här presenterar vi detaljerade metoder för att effektivt kunna producera sådana kulturer, tillsammans med exempel på förväntade resultat. Dessa metoder är användbara för att hantera frågor som rör OL utveckling / myelinating funktion och som är användbara verktyg inom området neurovetenskap.

Protocol

Etik Statement

De möss som används i detta arbete vårdades enligt kanadensiska rådet om Djurvård (CCAC) riktlinjer. Etiskt godkännande för utfört experiment erhölls från University of Ottawa Djurvård kommittén enligt protokoll nummer OGH-119.

1. Dissection - neonatal musen cortex för OPC utvinning

1. Offra P0-P2 mus enligt institutionens riktlinjer.
2. Dissekera hjärnan och placera i en petriskål med iskall MEM (antibiotika-fri).
3. Överför skålen en dissektion mikroskop.
4. Med hjälp av en skalpell med hjärnan ryggsidan upp, göra ett grunt snitt sagittally längs den mediala kanten av varje cortex (Fig 1a). Detta snitt bör endast passera meningeal lagret för att underlätta dess avlägsnande.
5. Använd fin tippade pincett för att dra av hjärnhinnorna i en lateral sätt. Om det görs noggrant, kan detta lager tas bort i ett stycke. Under detta steg, ta bort lukt glödlampor.
6. Med hjärnan ventrala sidan upp, göra en djup sagittal snitt där hjärnbarken möter ventrala delen av diencephalon (Fig 1b).
7. Med hjärnan ryggsidan upp, separera cortex från mellanhjärnan genom att bända vävnaden i ett medialt till lateralt mode (Fig 1c, c '). Ta bort eventuella rester av hjärnhinnorna i detta steg.
8. Dice varje cortex i ca 4 bitar och försiktigt över till ett 15 ml koniskt rör som innehåller 350 mikroliter av MEM per mus hjärnan. Håll röret på is tills alla möss har bearbetats.
9. Upprepa steg 1,1-1,8 för kvarvarande möss.

2. Dissociation av neonatal cortex och underhåll av blandade gliaceller kulturer

Anm: Införandet av bubblor i cellsuspension bör undvikas under alla följande steg.

1. Tillsätt 15 ml koniska röret med färska dissekeras hjärnor till 37 ° C vattenbad i 3 min.
2. Överför hjärnor till en steril vävnadskultur huva.
3. Försiktigt passerar tärnade cortex genom en P1000 pipettspets för att generera mindre fragment. Sluta pipettering gång finns det inga hjärnan bitar stora nog för att störa ett smidigt flöde av fjädring genom pipettspetsen.
4. Tillsätt 75 mikroliter av OPC papain lösning per hjärnan i den koniska röret. OPC papain lösningen måste förvärmas vid 37 ° C i 20 minuter före användning.
5. Inkubera i 37 ° C vattenbad i 20 min. Ungefär var 2 minuter, vänd försiktigt röret för att förhindra att vävnad aggregering. Under denna tid, tillsätt 5 ml av blandad gliaceller odlingssubstrat till varje poly-L-lysin (PLL) bestruket (1 mg / ml) T25 kolven (en kolv per mus hjärnan), och lägg i en 37 ° C vävnadskultur inkubator vid 8,5% CO _2.
6. Efter 20 min, tillbaka vävnaden suspensionen till den sterila huven och tillsätt 2 mL av blandad gliaceller odlingssubstrat per hjärnan till röret. Låt sitta i 10 min i rumstemperatur för att inaktivering av OPC papain lösningen.
7. Alikvotera vävnaden suspensionen i 5 rör mL plast. Antalet rör ska matcha antalet dissekerade hjärnor vilket resulterade i cirka 2,5 mL per rör.
8. Använd en steril eld-polerat glas pasteurpipett försiktigt mal sönder vävnaden i varje rör. Mal sönder först långsamt och gradvis öka hastigheten som bitar dissociera. Mal sönder ungefär 10-15 gånger, men detta antal kan variera beroende på effekten av matsmältningen.

Obs: Under-trituration ger dålig dissociation av vävnaden, medan över-trituration kommer att negativt påverka cellernas livskraft. Det är viktigt att inte införa bubblor i lösningen, eftersom detta kommer att få allvarliga konsekvenser cellernas livskraft.

9. När det inte finns några synliga vävnad klumpar kvar i suspension, överföring till en 50 ml koniska rör med 4 mL av blandad gliaceller odlingsmedia per hjärnan (dvs 4 hjärnor = 16 ml blandas gliaceller kultur media).
10. Vänd försiktigt 50 ml koniska rör och upprepa för de resterande 5 ml rör.
11. Alikvotera den poolade cellsuspension i 15 ml koniska rör (ca 6,5 ​​ml per 15 ml rör). Antalet 15 mL rör ska matcha antalet dissekeras hjärnor.
12. Centrifugera rören vid 1200 rpm (~ 300 g) för 5 min.
13. Försiktigt aspirera supernatanten och tillsätt 1 ml varmt blandade gliaceller närsubstrat till varje 15 ml koniska rör.
14. Sakta suspendera pelleten med en P1000 pipettspets, försiktigt så att inte införa bubblor. Lägg cellsuspensionen från varje rör till en pre-jämvikt PLL-belagda T25 kolv, vilket gör den totala volymen av den kultur media till 6 ml.
15. Placera kolvarna i en vävnad kultur inkubator i 3-4 timmar så att cellerna att fästa till PLL underlaget. Utför en komplett mediaspelare förändring genom att pipettera ut i media och lägga till 6 ml rent blandade gliaceller kultur media till kolvarna. Detta steg tar bort mycket av skräporsakas av trituration och främjar kultur livskraft. Om OL / DRGN co-kulturer önskas, se avsnitt 3 i detta protokoll.
16. Efter tre dagar av kultur, utför med 2 / 3 media förändring genom att ta bort 4 mL av media, och ersätta med 4 ml rent blandade stödjeceller kultur media. På denna punkt bör en astrocyternas cellslager att bildas på basen av kolvarna.
17. Dag 6, utför en annan 2 / 3 media ändra och komplettera kolvar med en slutlig koncentration på 5 mikrogram / ml insulin. På denna punkt bör en astrocyternas cellslager synas tydligt, ovanpå vilken OPCs kommer att frodas.

3. DRGN isolering

Notera: Att producera OL / DRGNs co-kulturer, bör DRGNs upprättas dagen efter blandad glial kultur generation. Både kultur typerna odlas oberoende av varandra, och kombinerade efter 9-10 dagar.

1. Offra P5-P10 mus enligt institutionens riktlinjer.
2. Utdrag ryggraden, och överför till en ren petriskål.
3. Klipp bort så mycket muskler och ben från ryggraden som möjligt (Fig 1d, d '), eftersom detta kommer att underlätta dissekering av dorsalrotsganglier (DRG).
4. Överför trimmade ryggraden till en ny petriskål ventralsidan upp. Använda dissektion sax och börjar caudally, skär medialt genom ryggraden i ett längsgående sätt.
5. Med hjälp av två par pincett, försiktigt bända upp ryggraden att exponera ryggmärgen.
6. DRG kan hittas under och i sidled till ryggmärgen. Använda fint tippade pincett och ta försiktigt bort DRG samtidigt undvika skador på ganglierna (Fig. 1e).
7. Överför bort DRG att iskallt Hanks buffrad saltlösning (HBSS, antibiotika-free) i en ny petriskål. Det DISSEKTOR bör syfta till att utvinna 40 DRG per mus (Fig 1f).
8. När DRG har utvunnits, trimma DRG av alltför långa rötter (Fig. 1 g, g) för att minimera införandet av förorena celler i kultur (gliaceller, fibroblaster).
9. Överför DRG till ett 1,5 ml centrifugrör innehåller 500 mikroliter av iskall HBSS.
10. Centrifugera vid 1200 rpm (~ 300 g) för 5 min vid 4 ° C till pellets i DRG.
11. Överför centrifugrör till en steril vävnadsodling huva och ta bort HBSS från rören.
12. Tillsätt 500 mikroliter av förvärmda (20 min vid 37 ° C) DRG papain lösning och inkubera rören i ett 37 ° C vattenbad i 10 min. Vänd rören var 2 min för att förhindra att vävnad aggregering.
13. Upprepa steg 3,10.
14. Ta bort DRG papain lösning och tillsätt 500 mikroliter av förvärmda (20 min vid 37 ° C) kollagenas en lösning. Inkubera i 37 ° C vattenbad i 10 min, vända varje 2 min.
15. Upprepa steg 3,10.
16. Avlägsna supernatanten och tillsätt 1 ml DRGN medier. Invertera röret flera gånger.
17. Upprepa steg 3,10.
18. Upprepa steg 3,16.
19. Coat en steril eld-polerat glas pasteurpipett med bovint serumalbumin (BSA) genom att pipettera en lösning av 0,25% BSA i HBSS flera gånger. Beläggningen med BSA-lösning kommer att hindra DRG från att fastna i väggarna i glaspipett.
20. Mal sönder DRG med BSA-belagda pipett försiktigt i början, och med ökande intensitet gång klumpar börjar isär. Mal sönder ungefär 10-15 gånger, men detta antal är beroende på graden av matsmältning, och antalet DRG per rör.
21. När dissociation uppnås, passera suspensionen genom ett 50 ìm filter till en steril petriskål innehåller 7 ml DRGN medier. Filtrering kommer att eliminera mycket av skräp från cellsuspension, även om detta steg är inte kritisk.
22. Inkubera petriskål på 8,5% CO ₂ för cirka 1,25 timmar.
23. Coat flera 12 mm täckglas med LN2 (10 mikrogram / ml i PBS) i en 24-bra maträtt under denna inkubationstid.
24. När inkubationen är klar, observera petriskål under starkt fält. DRGNs identifieras som stora arbetsföra, fas mörka celler. Snurra petriskål försiktigt lyfta någon följas DRGNs.

Obs! Många förorenar celler har starkt anslutit sig till petriskål, vilket berikar din cell, suspension DRGNs.

25. Överför cellsuspension till ett 15 ml koniskt rör. Försiktigt skölj skålen med 4 mL DRGN medier för att samla in eventuella kvarstående DRGNs. Överför ytterligare 4 ml till det koniska röret.
26. Centrifugera i 5 min vid 1200 rpm (~ 300 g).
27. Aspirera supernatanten och suspendera pelleten i 500 mikroliter av färska DRGN medier.
28. Beräkna antalet gav DRGNs med en hemocytometer. Var noga med att bara räkna DRGNs, och inte andra celltyper. DRGNs kan identifieras genom deras stora sfäriska cell organ.
29. Seed 30,000-50,000 DRGNs varje LN2-belagda täckglas i 1 ml DRGN medier, och lägg i en 37 ° C vävnadsodling inkubator vid 8,5% CO ₂ över en natt.
30. Nästa morgon, en fullständig media förändring genom att ersätta DRGNmedia med OL media (minus CNTF) med en slutlig koncentration av 1% Pen / STREP och 10 mikrometer FuDR.
31. Dag 3 och 5, utför en 3 / 4 medier förändras med samma media som i steg 3,30.
32. Dag 7, utföra en fullständig media förändring med OL media (minus CNTF, Pen / Strep, FuDR).
33. Dag 9 borde DRGNs har bildat en omfattande neurite säng, och är nu redo att co-odlade med OPC.

4. Rening av OPCs från blandade gliaceller kulturer för etablering av OL-berikade kulturer eller OL / DRGN co-kulturer

1. Dag 9 i blandade gliaceller kulturen, överföring kolvarna till en skakapparat i en 5% CO ₂ vävnadskultur inkubator. Placera kolvarna på toppen av tomma T25 flaskor för att förhindra att värmen från skakapparat påverkas negativt av blandade glial kulturer. Låt kulturerna till jämvikt till denna nya inkubator i 1 timme.
2. När kolvarna har jämvikt, skaka kolvar vid 50 rpm i 45 min. Syftet med denna skaka är att ta bort löst vidhäftande förorenar celler från monolager.
3. Flytta celler till en vävnadskultur huva och ta bort alla media från kolvarna. Ersätt med 4 ml rent blandade gliaceller närsubstrat kompletteras med 5 mikrogram / ml insulin.
4. Placera kolvarna tillbaka på shaker och låt jämvikta i ca 3 timmar.
5. När kolvarna bringas till jämvikt, fast dem ordentligt i skakapparat och skaka kolvarna i cirka 16 timmar vid 220 rpm (över natten).
6. Nästa morgon, om OLS skall odlas i avsaknad av DRGNs (dvs OL-berikade kultur), jacka flera sterila 12 mm täckglas med LN2 (10 mikrogram / ​​ml i PBS) i 1 timme. Överför täckglas till 24-bra mat, tvätta med PBS följt av en OL media tvätt. Tillsätt 1 mL OL media till varje brunn och utjämna till 8,5% CO _2.
7. Jämvikta 10 cm rätter vävnadsodling med 5% CO ₂ i 30 min. En maträtt kommer att krävas för varje 2 kolvar. Dessa kommer att användas för differential vidhäftning-vinst för suspenderade OPCs.
8. När 30 min jämviktstiden period har passerat, överföra material från skakas flaskor till disken. Varje rätt bör få media från 2 kolvar, motsvarande cirka 8 ml cellsuspension per 10 cm maträtt.
9. Inkubera rätter på 5% CO ₂ för 30 min, samtidigt som den ger en mild knuff i 15 min märket. Detta knuffa förhindrar OPCs från att fastna i 10 cm skålen.
10. När inkubationen är klar undersöka disken under ljusa fältet. OPCs identifieras som småcellig klumpar, vanligtvis av 3-5 celler, men ibland bildar stora aggregat som liknar neurospheres. Många icke-OL härstamning celler bör vara fast anslutit sig till botten av plattan. Snurra försiktigt plattorna för att lossa några löst följs OPCs, och överför cellsuspensionen från varje platta i en 15 ml konisk tub.
11. Centrifugera vid 1200 rpm (~ 300 g) för 5 min.
12. Återsuspendera pelleten i 1 ml OL media med en P1000 pipettspets, följt av resuspension med en P200 pipettspetsen.
13. Räkna celler med en hemocytometer.
14. För berikat-OL kulturer, frö 25.000 - 50.000 OPCs till varje 12 mm LN2-belagda täckglas i en slutlig volym på 1 ml OL medier.
15. För OL / DRGN co-kulturer, en fullständig OL media (minus CNTF) förändring på DRGNs från avsnitt [3], och försiktigt lägga 50 tusen celler från OPC-berikade cellsuspension. Var noga med att inte störa sängen DRGN neurite under tillsättningen av OPC.
16. Placera kulturer i en 37 ° C inkubator vid 8,5% CO _2, och undvika att ta bort tills fixering. Murina OPCs är känsliga för förändringar i pH, och borttagande från inkubatorn kommer att ändra pH-värdet i OL media. Lägg också märke till, kommer tillägget av dH ₂ O på den tomma brunnar som omger cellkulturer förhindra avdunstning av kulturen medierna, vilket minimerar fluktuationer i koncentrationer lösta ämnen inom OL media. Detta kommer att ge en mer enhetlig miljö för OPC.

5. Behandling av kulturer immunofluorescensmikroskopi

1. Fix kulturer med 100% metanol vid -20 ° C i 10 min, eller 3% paraformaldehyd i rumstemperatur i 15 min.
2. Permeabilize täckglas med 0,1% Triton-X-100 i 10 min, skölj med fosfatbuffrad-saltlösning (PBS) och block i 1 timme i 10% get serum.
3. Inkubera täckglas med primära antikroppar spätts i blockerande lösningen över natten vid 4 ° C.
4. Tvätta täckglas 3 gånger med PBS och inkubera med Alexa-fluor konjugerade sekundära antikroppar (Invitrogen) spätts i blockerande lösningen för 45 min.
5. Motfärga med 4 ',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) och tvätta täckglas flera gånger med PBS.
6. Mount täckglas i DAKO fluorescerande monteringsmedel.
7. Analysera bilderna via immunofluorescens mikroskopi. I detta protokoll har bilderna analyserats med antingen ett Zeiss Axiovert 200M inverterad fluorescensmikroskop eller en Zeiss LSM 510 META laserskanning konfokalmikroskop.

6. Hela cellprotein utvinning från OL-berikade kulturer

1. Ta bort 24-såväl kulturer från inkubatorn och svalt på is i 3 min.
2. Ta försiktigt bort media och lägga 10-20 mikroliter av lyseringsbuffert (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% SDS, 0,5% natriumdeoxikolat, 1% Triton-X-100, med 0,1% pepstatin, aprotinin, PMSF, leupeptin, natrium orthovanadate) till varje brunn (Minst 8 brunnar per prov föreslås).
3. Skrapa brunnarna med ett brett bar P1000 pipettspetsen och överföra lysat till ett 1,5 ml centrifugrör.
4. Passera lysat genom en 30 ½-gauge spruta ca 15 gånger och kyla på is i 30 min.
5. Centrifugera rören vid 14.000 rpm (~ 20 tusen g) i 15 minuter vid 4 ° C.
6. Överför supernatanten till nya centrifugrör och förvara vid -80 ° C.

7. SDS-PAGE analys berikat-OL kultur protein

1. Lös 30 mikrogram protein per prov för att minska buffert genom SDS-PAGE på standard 12% poly-akrylamid geler.
2. Halvtorr överföra geler på PVDF membran.
3. Block membran för 1 timme i 5% skummjölkspulver i TBST (10 mM Tris-HCl pH 8,0, 150 mM NaCl, 0,1% Tween-20).
4. Inkubera membran med primära antikroppar spätts i blockerande lösningen i 1 timme.
5. Tvätta membran 3 gånger med TBST i 10 min.
6. Inkubera membran med HRP-konjugerade sekundära antikroppar i 45 minuter i blockerande lösningen.
7. Tvätta membran flera gånger med TBST och inkubera med Amersham ECL Plus Western blotting upptäckt reagens (GE Healthcare) i 5 minuter.
8. Identifiera protein band med standard vetenskaplig avbildning film.

8. Representativa resultat:

I detta protokoll är OPCs utvidgas på ett astrocyternas cellslager inom en blandad glial kultur. Detta blandade gliaceller kulturen härstammar från P0-P2 neonatal mus cortex. Dag 1 in vitro (DIV1), innehåller den blandade gliaceller kulturen celler med varierande morfologier sedda av faskontrast mikroskopi (Fig 2a). På DIV3 börjar en astrocyternas cellslager bildas på basen av kolven, och på DIV8 kan OPCs tydligt observeras på monolager ytan. På DIV9 har frodas OPCs nått tillräcklig densitet är renat genom natten med hög hastighet orbital skakning. När reningsprocessen är klar, är resultatet en OPC-berikad cellpopulation. Vid DIV1-post rening, OPCs har enkla morfologi, som sträcker sig några processer (Fig. 2b). På DIV3 efter rening, har celler förlängd en komplex meshwork av processer, som påminner om omogna Ols. På DIV6 efter rening, har renat Ols tillplattade och förväntade broschyr-liknande membran strukturer. Denna morfologiska utveckling är typiskt för in vitro-mognad Ols.

Immunofluorescensmikroskopi visar det renade celler är av OL-härstamning (Fig. 3a). Seedade OPCs inledningsvis uttrycka kondroitinsulfat proteoglycan (NG2), och utvecklas till myelin-associerad glykoprotein (MAG) positiva omogna OLS inom tre dagar efter sådd (figur 3b). På DIV6 många Ols uttrycka myelin grundläggande protein (MBP), och har typiska mogna OL morfologi. Procent OL-härstamning celler kvantifieras vid olika tidpunkter för att fastställa renheten i OL-berikade kulturer (Fig. 3c). På DIV1 efter rening, kulturer är 50 ± 14% NG2 ^{+ ve} OPCs, utan MAG ^{+ ve} eller MBP ^{+ ve} Ols. Detta indikerar den renade OL-härstamning celler är i förstadiet till seedning tid med försumbar antal differentierade Ols. På DIV3 har många Ols differentieras till MAG ^{+ ve} celler (24 ± 5,9%) medan några behåller föregångaren fenotypen, och förblir NG2 + (13 ± 8,0%). På DIV3, är en liten del av MAG ^{+ ve} celler (3,2 1,2%) som uttrycker också MBP. På DIV6, 20 ± 5,9% av OLS är MAG ^{+ ve} medan 12 ± 7,3% kvarstår som NG2 ^{+ ve} OPCs. Dessutom, 21 ± 9,3% av celler i kultur MBP ^{+ ve} Ols vid denna tidpunkt. SDS-PAGE analys visar den sorterade uttryck för 2'3'-cyklisk-nukleotid 3'-fosfodiesteras (CNP) och MBP över 6 dagar kulturen period, vilket också visar förmåga OPCs i kultur för att dödligt differentiera till mogna OLS (Fig. 3d ). Tillsammans etablerar dessa data denna metod som ett sätt att producera en OL-berikad kultur som är lämpligt för studier av OL mognad från OPC.

Detta protokoll beskriver också metoder för att upprätta OL / DRGN co-kulturer med hjälp av mus-only vävnad källor. Men för att producera det samarbete kulturen måste DRGNs först odlas enbart för att producera en adekvat neurite nätverk. Dessa postnatala murin neuron kulturer som odlas för 9 dagar i låga serum media med 10 mikroM FuDR tillskott för att förhindra spridning av förorenande fibroblaster och GL IAL celler. Under nio dagar in vitro, isolerad DRGNs producera en tät neurite säng (Fig. 4a). Detta neurite säng är immunopositive för neuronala markörer neurofilament 200 (NF) och Tuj1 (Fig. 4b). Vid denna punkt kan renas OPCs läggas till neurite sängar, och odlade i ytterligare sex dagar att få fram myelinating co-kulturer.

Vid DIV6 av OL / DRGN co-kultur, ⁺ många MBP ^har OLS kan konstateras vara bland de NF ^{+ ve} DRGN neurites (Fig 5a). Vid närmare granskning, är OLS framgår att få kontakt med många DRGN neurites, ofta ensheathing dem med en MBP ^{+ ve} membran (Fig 5b, c).

Figur 1. Dissektion mikroskop bilder av särskilda aspekter av neonatal mus cortex och DRG isolering. (A) ryggfenan bild av en nyligen utvunna neonatal musen hjärnan. De streckade linjerna anger det område där snitt skall göras för att underlätta avlägsnandet av meningeal lager. (B) ventralsidan av hjärnan, streckade linjerna anger det område där hjärnbarken möter ventrala diencephalon. Djupa snitt skall göras längs de streckade linjerna till stöd för isolering av cortex. (C-c) Visuell skildring av hur man ska bända hjärnbarken bort från resten av hjärnan. (D) En nyligen isolerade P5-P10 mus ryggraden före trimning bort överflödigt muskler och ben (d '). (e) Placering av DRG i ryggraden. (f) ungefärligt antal DRG som bör isoleras från en mus. (g) Ett DRG med långa rötter som kräver putsning innan enzymatisk spjälkning. Den streckade linjen visar den region där rötterna ska putsas. (G ') DRG efter root-trimning.

Figur 2. OPCs utvidgas inom en blandad gliaceller kultur, renas och därefter differentieras som en OL-berikad kultur. (A) fas kontrastrika bilder av blandad gliaceller kulturer i olika stadier av utveckling. På DIV1, celler visas runt med några tillplattade celler. Stratifiering av blandade gliaceller kulturen börjar på DIV3 där astrocyter bildar en enhetlig monolager vid basen av kolven, på vilken OPCs föröka sig. Många OPCs ses vid DIV8 (pilar) anslutit sig till ytan av astrocyternas monolager. (B) När renas från de blandade gliaceller kulturen har DIV1 OPCs förlängs endast ett fåtal processer. På DIV3 har celler utökade många processer, som påminner om mellanliggande steg Ols. På DIV6, tillplattad OLS (asterisk) verkar ha producerat membranös ark (streckad linje). Skala barer, 50 ìm.

Figur 3. Karakterisering av OL-berikad kultur. (A) Confocal bilder av isolerade OLS i olika stadier av utveckling. NG2 ^{+ ve} OPCs har enkla morfologi, medan MAG ^{+ ve} OLS har flera arborous processer. MBP ^{+ ve} OLS har förlängt membranös myelin-liknande blad. Skala Bar, 50 ìm. (B) Renat OL-härstamning celler ursprung som OPC, och differentierar till MAG ^{+ ve,} MBP ^{+ ve} OLS över 6 DIV. På DIV1, alla OPCs är NG2 ^{+ ve,} medan ingen är MAG ^{+ ve} eller MBP ^{+ ve.} På DIV3, MAG ^{+ ve} och få MBP ^{+ ve} Ols är nu uppenbar. Majoriteten av OLS är MAG och MBP ^{+ ve} på DIV6, med få kvarvarande NG2 ^{+ ve} OPCs. Skala bar, 100 ìm. (C) Medelvärden ± SD i procent OL-härstamning celler i olika skeden av utvecklingen över 6 DIV. På DIV1, alla OL-härstamning cellerna NG2 ^{+ ve} och står för 50 ± 14% av det totala celler i kulturen. Vid DIV3 och DIV6, OL-härstamning celler respektive står för 36 ± 6,8% och 32 ± 8,4% av det totala celler, som består av olika proportioner av NG2 ^{+ ve,} MAG ^{+ ve} och MBP ^{+ ve} Ols. (D) SDS-PAGE utförda på protein från berikad OL-kulturer visar den sorterade uttryck för OL-markörer CNP och MBP över 6 DIV kulturen period.

Figur 4. Karakterisering av DRGN kulturen före OPC sådd. (A) fas kontrast bilder av DRGNs över 9 DIV kultur perioden före OPC sådd. DRGNs ursprung som stora arbetsföra celler med få processer och producera en alltmer komplex neurite nätverk. Skala bar, 100 ìm. (B) Confocal bilder av DRGN kulturer fastställts till DIV9 (före OPC seeding) och färgas för neuron-specifika markörer Tuj1 och NF200. DRGNs har tagit fram en neurite nätverk på vilken OPCs kan seedas att producera OL / DRGN myelinating co-kulturer. Skala Bar, 50 ìm.

ENT ">
Figur 5. OLS co-odlade med DRGNs resultera i OL-medierad inslagning av DRGN neurites med MBP ^{+ ve} membran. (A) En 4-fält konfokala bild montage av en DIV6 OL / DRGN co-kultur. Många MBP ⁺ kan ^ve OLS ses interagera med det underliggande DRGN neurite säng. Skala bar, 100 ìm. (B) En förstorad konfokala syn på MBP ^{+ ve} OLS inslagning flera DRGN neurites. Skala Bar, 50 ìm. (C) digital förstoring av regionen betecknas i (b) Om en DRGN neurite är lindade med OL membran. Skala Bar, 25 ìm.

Discussion

Denna rapport beskriver en metod för att isolera murina OPCs för differentiering i OL-berikade kulturer eller OL / DRGN co-kulturer. När odlade Enbart OPCs differentiera till MBP ^{+ ve} Ols, som producerar myelin-liknande membranös ark. När läggs till DRGN neurite sängar, OLS HÖLJA IN den DRGN neurites med MBP ^{+ ve} membran. Denna modell fördelar undersökningen av de komplexa underbyggnaden för OL-medierad axonal ensheathment.

Medan av stort värde, är inrättandet av sådana kulturer tekniskt utmanande. Särskilt krävande aspekter inkluderar effektiva vävnad matsmältning / dissociation, underhåll av balanserade odlingsmedia pH och DRGN medier förändringar. Det är viktigt att tänka på att längden på matsmältningen, är mycket vävnad smält och mängden trituration påverkar effekten och slutresultatet av vävnadsdissociering. Det är inte ovanligt för erfarna forskare att få låga cellulära avkastningen från dissocierade nervsystemet vävnader. Dessutom murina OPCs tenderar att vara känsliga för förändringar i pH-värdet i kultur medierna, särskilt under alkaliska förhållanden. Underhållet av kulturer på 8,5% CO ₂ syftar till att förebygga detta, eftersom OPCs verkar bättre tolerera något sura förhållanden över grundläggande. När det gäller utfodring DRGNs, måste medierna förändringar ske snabbt för att inte uttorka nervceller måste dock vara försiktig så att inte störa den utvecklingen neurite sängen. Plötsliga medier förändringar kan lösgöra neurite sängen från underlaget, och sannolikt leda till dess fullständiga avståndstagande från täckglas.

Den potentiella förtjänsten av detta modellsystem överskuggar kraftigt den tekniskt krävande natur. En fördel med detta system är att använda postnatala möss i cellodling härledning kringgå behovet av att offra avelshonor att skörda embryonal vävnad. En annan fördel är avsaknaden av krav på tillväxtfaktorer (GFS) för utbyggnaden av OPC. Blandade gliaceller kulturer tillhandahålla en miljö som stödjer spridning av OPCs, förmodligen beroende på att förekomsten av astrocyternas-derived trofiska faktorer. Andra metoder, såsom härledning via neurospheres ^7,8, lita på mitogena egenskaper GF t.ex. grundläggande fibroblast tillväxtfaktor (bFGF), epidermal tillväxtfaktor (EGF) och platelet-derived growth factor (PDGF) för OPC expansion. Likaså att använda efter födsel (P5-10) möss DRGNs undviker kravet att komplettera den kultur media med nervtillväxtfaktor (NGF), en neurotropa faktor som krävs för in vitro-överlevnad embryonala DRGNs ^{9, 10.} Det är av intresse att undvika att använda NGF som negativt påverkar myelinating kapacitet OLS vid odling med DRGNs ^4. Undvika användning av GF-kompletterats media har också ekonomiska fördelar, eftersom dessa reagenser blir dyra när de används på stor skala.

Den kanske viktigaste fördelen med denna kultur-modellen är dess härledning från mus med enbart vävnader, vilket ger möjligheter att härleda både OPCs och DRGNs från det breda utbudet av transgen mus linjer. Detta möjliggör studier av både DRGN och / eller OPC-specifika egenskaper som styr myelination. Detta kommer att vara särskilt viktigt för att belysa den receptor / ligand interaktioner som reglerar OL-medierad myelination av axoner. Sammantaget är denna teknik av stort värde med hänsyn till neurovetenskaplig forskning på grund av dess tillämpningar att förstå de molekylära signaler underliggande myelination.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Multicell	319-005-CL
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS)	Invitrogen	14170-112
Minimum Essential Media (MEM)	GIBCO, by Life Technologies	12360-038
Fetal Bovine Serum (FBS)	GIBCO, by Life Technologies	10091-148
Penicillin-Streptomycin (Pen/Strep)	GIBCO, by Life Technologies	15140-122
GlutaMAX	Invitrogen	35050-061
Poly-l-lysine	Sigma-Aldrich	P2636
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4503
Human merosin purified protein (LN2)	EMD Millipore	CC085
Recombinant rat ciliary neurotrophic factor (CNTF)	PeproTech Inc	450-50
L-thyroxine	Biochemika	89430
Holo-transferrin	Sigma-Aldrich	T0665
B27 supplement	GIBCO, by Life Technologies	0080085-SA
Bovine insulin	Sigma-Aldrich	I6634
3,3',5-Triiodo-L-thyronine	Sigma-Aldrich	I6634
Progesterone	Sigma-Aldrich	P8783
Putrescine	Sigma-Aldrich	P7505
Sodium Selenite	Sigma-Aldrich	S5261
5-Fluoro-2'-deoxyuridine (FuDR)	Sigma-Aldrich	F0503
Papain solution	Worthington Biochemical	LS003126
DNaseI	Roche Group	1010159001
L-cysteine	Sigma-Aldrich	C7352
24-well tissue culture dishes	Cellstar	662-160
T25-tissue culture flasks with vent cap	Corning	430639
10 cm tissue culture dishes	Corning	430167
10 cm petri dish	Fisher Scientific	0875713
Collagenase A	Roche Group	103578
CellTrics 50 μm filter (optional)	PARTEC	04-004-2327
Myelin Basic Protein (MBP) Antibody	AbD Serotec	MCA409S
NG2 antibody	EMD Millipore	AB5320
Myelin-Associated Glycoprotein (MAG) antibody	EMD Millipore	MAB1567
2',3'-Cyclic-nucleotide 3'-phosphodiesterase (CNP) antibody	Covance	SMI-91R-100
Actin pan Ab-5 antibody	Fitzgerald	10R-A106AX
Neurofilament-200 (NF) antibody	Sigma-Aldrich	N4142
Tubulin beta-3 chain (Tuj1) antibody	EMD Millipore	MAB5544
Alexa Fluor 488 goat anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A11008
Alexa Fluor 555 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A21422
Alexa Fluor 647 goat anti-rat (IgG) (H+L) secondary antibody	Invitrogen	A21247
Goat anti-mouse IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody	Bio-Rad	170-6516
Goat anti-rat IgG (H+L)-HRP conjugated secondary antibody	Santa Cruz Biotechnology, Inc.	SC-2065
4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI)	Sigma-Aldrich	D9542
Media Recipes 100X OL-Supplement* Ingredient Amount to add DMEM 100 mL BSA 1.02 g Progesterone 0.6 mg Putrescine 161 mg Sodium Selenite 0.05 mg 3,3',5-Triiodo-L-thyronine 4 mg *Store at -80 °C in 250 μL aliquots OL media Ingredient Amount to add DMEM 23.75 mL 100X OL-Supplement 250 μL Bovine insulin (from 1 mg/mL stock) 125 μL GlutaMAX 250 μL Holo-transferrin (from 33 mg/mL stock) 37.5 μL B27 Supplement 500 μL FBS 125 μL CNTF (from 50 ng/μL stock) 25 μL Mixed glial culture media (made up in DMEM) Ingredient Final concentration FBS 10% Pen/Strep (0.33% from stock) 33 units/mL Penicillin and 33 μg/mL Streptomycin GlutaMAX 1% DRGN media (made up in DMEM) Ingredient Final concentration FBS 10% Pen/Strep (1% from stock) 100 units/mL Penicillin and 100 μg/mL Streptomycin Digestion Solution Recipes: OPC papain solution (made up in MEM) Ingredient Final concentration Papain solution 1.54 mg/mL L-cysteine 360 μg/mL DNaseI 60 μg/mL DRG papain solution (made up in HBSS) Ingredient Final concentration Papain 1.54 mg/mL L-cysteine 360 μg/mL DRG Collagenase A solution (made up in HBSS) Ingredient Final concentration Collagenase A 4 mg/mL