Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Bioengineering
Click here for the English version

Bioengineering

بناء منخفض الميزانية Axotomy نظام ليزر لدراسة التجديد في أكسون C. ايليجانس Published: November 15, 2011 doi: 10.3791/3331
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, University of Utah

Summary

الليزر axotomy تليها الوقت الفاصل بين التصوير هو وسيلة حساسة للفحص آثار الطفرات في

Abstract

الليزر axotomy تليها الوقت الفاصل بين المجهري هو الفحص عن الظواهر الحساسة التجدد محوار في C. ايليجانس 1. والصعوبة الرئيسية من هذا الاختبار هو التكلفة المتصورة (25 دولارا - 100K) والخبرات الفنية اللازمة لتنفيذ نظام ليزر 2،3 الاجتثاث. ومع ذلك ، يمكن ليزر الحالة الصلبة نبضة من التكاليف المتواضعة (<$ 10K) توفير الأداء القوي للالتذرية الليزر في التحضيرات شفافة حيث المحاور المستهدفة هي "قريبون" من سطح الأنسجة. ويمكن تحقيق المواءمة بين البناء ونظام في يوم واحد. المسار الضوئي التي تقدمها الضوء من المكثف تركيزا على الليزر التذرية يوفر دليلا محاذاة مريحة. يمكن أن تكون مكرسة وحدة وسيطة مع جميع بصريات الليزر لإزالة التذرية ، ويؤكد أن الحاجة لا يمكن نقل العناصر البصرية خلال الدورة الليزر التذرية. A مزدوج اللون في وحدة وسيطة يسمح التصوير في وقت واحد والتذرية الليزر. تركز شعاع الليزر رس الشعاع الصادر من عدسة المجهر المكثف تركيزا دلائل التوافق المبدئي للنظام. وتستخدم مجموعة متنوعة من العدسات لشرط وتوسيع شعاع الليزر لسد الفتحة الخلفية للعدسة الهدف الذي تم اختياره. يتم تنفيذ التوافق النهائي والاختبار مع جبهة الهدف معكوسة سطح شريحة زجاجية. يتم ضبط قوة الليزر لإعطاء الاجتثاث أدنى حجم البقعة (<1um). وتتركز بقعة الاجتثاث مع تعديلات دقيقة للمرآة الماضي شنت kinematically لعبور الشعر ثابتة في إطار التصوير. الليزر سوف تكون السلطة لaxotomy 10X تقريبا أعلى من اللازم لأدنى بقعة الاجتثاث على الشريحة المستهدفة (قد تختلف مع هذا الهدف الذي تستخدمه). يمكن أن يجمد الديدان لaxotomy الليزر والتصوير مرور الزمن من خلال تزايد على منصات agarose (أو في غرف ميكروفلويديك 4). تتم بسهولة مع منصات Agarose agarose 10 ٪ في المياه المالحة متوازنة ذابت في الميكروويف. يتم وضع قطرة من agarose المنصهر على شريحة زجاجية وسوت مع آخرشريحة زجاجية في لوحة (يتم استخدام طبقة واحدة من الوقت على الشريط الشرائح المتاخمة كفاصل) حوالي 200 ميكرون سميكة. ويستخدم "Sharpie" غطاء لقطع منصة دائرية قطرها النظامية من 13mm. تضاف مخدر (1ul Muscimol 20mM) والمجهرية (كريس فانغ الين اتصال شخصي) (2.65 ٪ 1ul البوليستيرين 0.1 ميكرون في الماء) إلى وسط لوحة تليها 3-5 الديدان الموجهة لذلك هم على جنوبهم اليسرى. ويطبق ساترة الزجاج ومن ثم يتم استخدام الفازلين لختم ساترة ومنع التبخر من العينة.

Protocol

1. بناء نظام الليزر التذرية

ارتداء نظارات السلامة الليزر واستخدام الممارسات الجيدة في السلامة الليزر خلال محاذاة الأولي. لا ننظر من خلال oculars عندما ليزر على.

  1. ترتيب المكونات على اللوح كما هو مبين في الشكل. 1 (انظر أيضا مثال 2). الترباس أسفل الليزر (مع لوحة الناهض إذا لزم الأمر) ، آخر بيريسكوب ، وتدعم السكك الحديدية مرتفعة.
  2. موقف المجهر الخاص لتتماشى مع محور السكك الحديدية. محاذاة مع شعاع الضوء المرسل من عدسة المجهر المكثف. محاذاة ارتفاع السكك الحديدية (استخدام مستوى) وموقف مع فتحة عدسة قابل للتعديل أو الملصقة على السكك الحديدية. يجب أن تكون محاذاة فتحة العدسة أو على طرفي السكة إلى شعاع المكثف. يمكن أن تساعد المختبر الرافعات التكيف مع ارتفاع السكك الحديدية.
  3. محاذاة المستقطب Glan طومسون ونصف موجة لوحة لشعاع الليزر. لا تحتاج ليزر على القيام بذلك المحاذاة. وبEAM يحتاج فقط إلى كل من يمر من دون ضرب حوافها. تدوير المستقطب لتوفير التوجيه مريحة وموقف لتفريغ شعاع (fig.1). وسوف تقوم بتدوير لوحة موجة نصف لضبط قوة الليزر. تأمين المكونات إلى اللوح.
  4. بدوره على الليزر ، وضبط وتيرة نبض إلى 100 ، وطريقة مستمرة ، وتقليل استهلاك الطاقة إلى الحد الأدنى باستخدام لوحة نصف الموجة. استخدام مذكرة بعد ورقة أو عدسة لتصور شعاع الليزر.
  5. تعديل وإصلاح المرايا التي شنت kinematically في تسلسل من الليزر لجعل شعاع يصل الى المرآة التي شنت على نهاية السكك الحديدية مرتفعة. يجب أن تكون محاذاة شعاع الليزر تقريبا وسط المرايا. وينبغي أن يكون موجها المرايا تقريبا 45 درجة على محور شعاع الليزر (fig.1).
  6. ضبط خشنا المرآة kinematically شنت على الجزء العلوي من منظار وعلى السكك الحديدية إلى نهاية محاذاة شعاع الليزر لمركز شعاع الضوء المرسل من المجهر. كلا من شعاع ليزر و tأحال شعاع الضوء من مجهر يمكن تصور واحد عن طريق إدخال الورق في مسار الشعاع. تأكد من أية فلاتر ND والفتحات الموجودة في وحدة وسيطة خارج أو مفتوحة بالكامل.
  7. محاذاة شعاع الليزر بدقة إلى مركز شعاع ضوء التعديلات التي تنتقل مع غرامة على أعلى بيريسكوب والمرايا السكك الحديدية. الاستمرار على ورقة بالقرب من السكك الحديدية ومرآة محاذاة شعاع الليزر لمركز شعاع الضوء المرسل مع مرآة المنظار العلوي. الاستمرار على ورقة قرب ميناء المجهر ومحاذاة شعاع الليزر لمركز شعاع ضوء التعديلات التي تنتقل مع مرآة السكك الحديدية (fig.2).
  8. الموقف بعد أن لاحظ في مسار الشعاع بين العدسة المكثف الانحياز وبرج موضوعية مفتوحة. سترى شعاع الضوء المرسل مع شعاع ليزر صغيرة بالقرب من المركز. استخدام التعديلات غرامة على المرآة السكك الحديدية إلى مركز شعاع ليزر. إصلاح المجهر في مكان مع المشابك.

الخطوات من 10،9-1،12 اختيارية ، ولكنها سهلة ومفيدة لتقييم المواءمة والتذرية الليزر قبل إضافة العدسات شعاع التوسع.

  1. إيقاف الليزر وإشراك مصراع السلامة الميكانيكية. تدوير مزدوج اللون من أصل 50 ٪ من مسار الشعاع. رغم عدم وجود ضوء الليزر مباشرة إلى سيمر oculars ، يمكن أن يكون الضوء المنعكس مكثفة للغاية. جبل الشريحة المستهدفة لمحاذاة الصورة مع الغرامة والهدف النفط 60X. التركيز على خدوش على الشريحة. وضعت في تصفية ND4 ND8 في وحدة وسيطة.
  2. صورة الشريحة المستهدفة مع CLSM الخاص ، القرص الغزل ، أو CCD نظام الكاميرا. تدوير 50 ٪ مزدوج اللون في طريق الليزر. من هذا المنطلق ، يجب أن لا ننظر من خلال oculars في حين أن الليزر التذرية على. بدوره على الليزر التذرية ، وضبط الوضع إلى التردد ، وأثار إلى 100 ، وعدد النبض إلى 10. تأكد من تعيين ما زالت القوة إلى الحد الأدنى مع لوحة نصف الموجة ومن ثم فتح مصراع السلامة الميكانيكية. يمكنك simultaneouصورة ماكرة واستخدام الليزر التذرية.
  3. بينما التصوير الشريحة المستهدفة ، وتحريك الليزر التذرية. التحقق من الشريحة المستهدفة لاجتثاث أم بقعة 10/01 في القطر. إزالة فلاتر ND بالتسلسل حتى ينظر بقعة الاجتثاث. ضبط بقعة الاجتثاث إلى مركز للصورة المرآة مع السكك الحديدية. هل تريد أن تضيف الوراء ND مرشح ليكون مجالا لزيادة قوة الليزر بدقة مع لوحة نصف موجة لإعطاء <الاجتثاث ام 1 بقعة. الصورة عند 0.2 ميكرون / بكسل أو أقل ، وضبط دقة البقعة الاجتثاث لمركز الصورة (256256 موقف 512X512 مع الصورة).
  4. تحقق من عمق التركيز ومحور شعاع الليزر. التركيز صعودا وهبوطا 1-2 أم والتحقق من موقف الاجتثاث والاستئصال حجم البقعة. إذا محاذاة محوريا لشعاع الليزر سوف بقعة الاجتثاث لم تتحرك. فإن شعاع الليزر دون شروط توزيع الطاقة على مدى عدة أم (حوالي 3-5 أم من أعلى إلى أسفل التركيز).

2. إضافة عدسات لتوسيع شعاع الليزر لملء الجزء الخلفي الهدفالفتحة والتقارب لضبط تركيز الرقابة

  1. يستخدم هذا النظام المزدوج الجليل شعاع المتوسع لتوسيع شعاع الليزر لسد الفتحة الخلفي من الهدف (10 ملم). تركيب العدسات 4 إلى الناقلين وإرفاقها السكك الحديدية (L1f1 + L2f2 وL3f1 '+ L4f2'). ضبط المواقف حتى يتسنى لجميع العدسات هي في نفس المحور البصري ومتعامد تماما مع شعاع ليزر (الشكل 2).
  2. بدوره على الليزر وتعديله الى السلطة ووضع الحد الأدنى المستمر. ضبط ما يقرب من محاذاة شعاع من خلال كل ورقة باستخدام عدسة لرؤية شعاع الليزر وتنتقل من شعاع ضوء مكثف المجهر. إيقاف مصراع والليزر.
  3. إزالة المشابك من جانب واحد من شريحة المجهر والمجهر للخروج من مسار شعاع الليزر. بدوره على الليزر وإزالة مصراع السلامة.
  4. لا يمكن أن يؤديها المحاذاة الدقيقة للعدسات وشعاع الليزر من خلال عرض موسع شعاع الليزر على حائط قريب. وينبغي توسيع وشعاع العقد متناظر عند جنيهيتم نقل nses. ضبط اثنين من المرايا التي شنت مشاركة kinematically لمحاذاة شعاع (fig.3).
  5. وينبغي أن ملف شعاع الانحياز وتوسيع تكون دائرية وسطوع موحد (fig.3). ويمكن الاطلاع على حجم والتوحيد من الحزم مع مرحلة ما بعد علما في الموضع المقدر للهدف فتحة الظهر.
  6. ينبغي تعديل شعاع من الصفر لتقارب الأنظمة البصرية اللانهاية. ويمكن تقدير مدى التقارب بملاحظة حجم شعاع التغييرات كما كنت في مرحلة ما بعد نقل علما أبعد من العدسات. إيقاف الليزر وإشراك مصراع الميكانيكية.
  7. شريحة المجهر مرة أخرى في مسار شعاع الليزر باستخدام المشابك الثابتة لتحديد المحاذاة الصحيحة. تحل محل المشابك على الجانب خالية من المجهر ، ولكن لا تشديد أسفل.
  8. بدوره على الليزر وإزالة مصراع السلامة. تدوير برج موضوعية لموقف فتح. بعد وضع علما على المسرح. سترى شعاع الليزر موسعة وموحدة تركز على ضوء المنقولة بEAM من المكثف (fig.4). قد تحتاج إلى مركز من قبل تخفيف المشابك المجهر وبايعاز بعناية المجهر.
  9. إشراك مصراع السلامة ، وتعيين ليزر لتحريك الوضع. تدوير الهدف 60X في مكان وصورة الخدوش السطحية على الشريحة المستهدفة.
  10. إزالة مصراع السلامة ، وتحريك الليزر التذرية ، وضبط قوة الليزر للبقعة الاجتثاث الحد الأدنى. يجب أن يكون الاجتثاث بقعة دائرية وداخل أم 50-10 من مركز الصورة.
  11. مركز البقعة الاجتثاث مع تعديلات غرامة مرآة السكك الحديدية التي شنت kinematically. سوف تحتاج إلى ضبط تكرارا على أعلى منصة السكك الحديدية ومرآة المنظار لكلا مركز البقعة الاجتثاث والحفاظ على الشخصية شعاع موحدة.
  12. تقييم التركيز Z ليزر عن طريق نقل التركيز بصورة منتظمة صعودا وهبوطا في الخطوات 1 أم واثار الليزر التذرية. ينبغي أن توسع شعاع ، الانحياز ، والتقارب تعديل الحد الأقصى يجتذ في التركيز على الصورة وضعيف أو ليس في كل أب وأم 1اوفه أو أقل تركيز (الشكل 5).
  13. ضبط التركيز Z من شعاع الموسع عن طريق تحريك العدسة L3 للتلسكوب الجليل (fig.2).

3. الليزر axotomy والوقت الفاصل بين المجهري للتجديد محوار

  1. الميكروويف Agarose 10 ٪ (الصف RPI البيولوجيا الجزيئية تكافؤ فرص العمل 0.1 A20090) في ملحي متوازن حتى ذابت تماما. تعيين على طبق ساخن لإبقائه ذاب خلال الاستخدام للتركيب.
  2. يتم وضع قطرة من agarose المنصهر على شريحة زجاجية وسوت مع شريحة أخرى في الزجاج لوحة (يتم استخدام طبقة واحدة من الوقت على الشريط الشرائح المتاخمة كفاصل) حوالي 200 ميكرون سميكة.
  3. ويستخدم "Sharpie" سقف علامة لقطع منصة دائرية قطرها النظامية من 13mm.
  4. مخدر (1ul Muscimol 20mM) والمجهرية (كريس فانغ الين الياباني ، والاتصالات الشخصية) (2.65 ٪ 1ul البوليستيرين 0.1 ميكرون في الماء) وتضاف إلى وسط لوحة تليها 3-5 الديدان الموجهة لذلك هم على جنوبهم اليسرى . ويطبق ساترة الزجاج وVasel ثمويستخدم المعهد الوطني للإحصاء لختم ساترة ومنع التبخر من العينة (fig.6).
  5. يتم محاذاة الليزر التذرية لمرمى ، كما هو موضح أعلاه ، في بداية كل دورة. إشراك مصراع سلامة الليزر.
  6. إزالة الهدف محاذاة الليزر والصور دودة الكبار مزودة علامة الفلورسنت مناسب في الخلايا العصبية المستهدفة. المحاوير صورة مماثلة في التكبير (0.2 ميكرون / بكسل أو أعلى التكبير) وموقف تحت مرمى (fig.7).
  7. فتح مصراع سلامة الليزر والليزر التذرية الزناد بينما التصوير. تقييم اثار محوار بعد الليزر وزيادة قوة الليزر ببطء حتى يتم قطع محور عصبي. ستحتاج حوالي 10X المزيد من السلطة ليزر لقطع محاور عصبية من أن تشكل بقعة الاجتثاث على محاذاة الشريحة المستهدفة (حوالي 1uJ / نبض نانوثانية). نقطع عادة مع 100 البقول بنسبة 2.5 كيلو هرتز والسلطة لتعيين حوالي 0.27mW (متوسط ​​القوة تقاس على عينة المتماسك مع السلطة متر FieldMaxII والليزر لتعيين مستمر في 2500 هرتز). الاجتثاثالليزر سوف تكون متسقة إعداد السلطة لقطع محاور في التجارب المستقبلية (fig.7).
  8. وهناك محور عصبي خفض بنجاح تظهر فاصل من حوالي 0،5-1 أم من دون خسارة في تاريخ سطوع قطع اثنين (fig.7). خسائر كبيرة في السطوع ، أو وجود فجوة كبيرة (20-10 ميكرون) يدل في كثير من الأحيان أضرار واسعة النطاق تتجاوز محوار بواسطة فقاعة التجويف. فإن القاصي والداني محاور منفصلة وشكل المصابيح تراجع خلال الدقائق ال 30 المقبلة (الشكل (8) والفيلم).
  9. يوازن الديدان الخاص مزودة المرحلة المجهر الخاص لمدة 30 دقيقة قبل بدء التسجيل الخاص بك مرور الوقت. وهذا تقليل الانجراف بسبب الاختلافات في درجات الحرارة وانكماش agarose.
  10. يتم تعيين) الوقت الفاصل بين التصوير المعلمات حتى باستخدام برنامج التصوير المرتبطة مع النظام. نحن عادة صورة 20/10 الخطوات Z (1um/step) في أم 0،1-0،2 / بكسل باستخدام كسب ، ذات الثقب ، ومعدل المسح الضوئي ، وإعدادات التصوير قوة الليزر التي تقلل من التعرض في حين يعطي القرار المطلوب المكانية. فترات أخذ العينات هي نموذجيةلاي 1-5 دقائق على مدى 15 ساعة اعتمادا على قرار الزمني المطلوب (الشكل (8) والفيلم).
  11. يتم تحويل بيانات الصورة في الوقت الفاصل بين الأفلام باستخدام عناصر أو ImageJ شيكل.

4. ممثل النتائج :

axotomy الليزر التي تستخدم هذا النظام هو موثوق بها والروتينية. النتائج المبينة في الشكل 7 نموذجية. الوقت الفاصل بين التصوير التجدد محور عصبي قوي جدا باستخدام هذا البروتوكول. نقطع بشكل روتيني والصور تصل إلى 5 في 5 محاور مختلفة الديدان على شريحة واحدة باستخدام مرحلة الآلية. والقيد الوحيد هو الوقت الذي يستغرقه لجمع الصور من كل محور عصبي ، على سبيل المثال ، إذا كان يستغرق 20 ثانية لجمع كومة لالمحوار ثم يمكنك في معظم عينة المحاوير 9 (9 المداخن) إذا كنت أخذ العينات كل ثانية 180. المثال المعروض في أرقام 8 و 9 هو نتيجة ممثل جيد. حوالي 10 ٪ من التجارب تعطي نتائج من هذه النوعية. التجارب المتبقية توفير بيانات جيدة على النمط الظاهري التجدد ، ولكن unappeal جمالياجي بسبب الحركات الصغيرة النرفزة من الدودة التي تبدأ عادة بعد 5-8 ساعات من الشلل.

الشكل 1
الشكل 1 نظام ليزر تذرية. ياج ليزر هي التي شنت على لوحة الناهض للوصول بها إلى ذروة من المكونات الأخرى ، واندفع إلى اللوح : وبدون تاريخ نانومتر 532. (المعزل البصرية هو اختياري وربما لا حاجة). تستخدم المستقطب Glan طومسون ونصف موجة لوحة التحكم بدقة قوة الليزر. وهم في يتصاعد التناوب معايرة ناعما. رعاية الإعداد تفريغ شعاع. المرآة الزاوية توجه شعاع الليزر على مرآة المنظار السفلي. مرآة المنظار العلوي يوجه شعاع للمرآة السكك الحديدية. السكك الحديدية هي التي شنت على منصات قضيب الدولتين ساندتا. وترد العدسات الجليل يتصاعد السكك الحديدية المزدوجة لانزلاق. وأضاف لاحظت وحدة وسيطة مكرسة ليزر الاجتثاث. يمكن جعل نظام أكثر إحكاما من خلال إزالة إيزولا البصريةتور ومرآة الزاوية ، وتغيير وضعيتها ليزر ، المستقطب Glan طومسون ، وصفيحة نصف موجة إلى الحافة الخلفية من اللوح.

الشكل 2
وتستخدم العدسات المزدوجة الشكل 2 تكييف الجليل لتوسيع 300 شعاع ليزر TEMoo أم إلى موحدة تقارب الصفر حجم 10 ملم. وقال جاك يتم وضع مختبر تحت واحدة من منصات عقد السكك الحديدية. هذا يساعد في ضبط ارتفاع السكك الحديدية خلال الخطوات المحاذاة. ضبط بفجاجة ارتفاع السكك الحديدية من قبل تركيب العدسة L1 إلى السكك الحديدية وباستخدام شعاع مكثف باعتباره دليلا المحاذاة. ضبط السكك الحديدية بحيث شعاع مكثف محاذاة إلى مركز للعدسة على طرفي السكة الحديد. وهذا هو ضمان مواءمة السكك الحديدية موازية للمحور البصري للالمجهر. قد تحتاج إلى تعديل أولا المجهر لتتناسب مع المحور البصري للسكك الحديدية. استخدام مشابك لتثبيت موقف المجهر (انظر الشكل 1). إزالة اله السكك الحديدية محمولة على العدسة. الآن محاذاة شعاع الليزر لمركز شعاع مكثف على طرفي السكة الحديد. ورقة في مسار الشعاع هو وسيلة مريحة لرؤية كل من الحزم في وقت واحد. استخدام المرآة بيريسكوب أعلى لمحاذاة شعاع الليزر على شعاع مكثف على مقربة من المرآة السكك الحديدية المركبة. استخدام السكك الحديدية التي شنت مرآة لمحاذاة شعاع الليزر شعاع مكثف في نهاية بكثير من السكك الحديدية (الأقرب إلى المجهر). الآن تحميل جميع العدسات الأربع إلى السكك الحديدية كما هو مبين في الشكل. وعلى طول السكك الحديدية ، والبعد البؤري للعدسات ، والترتيبات عدسة المجهر تختلف تبعا الخاص بك وتعيين المادية حتى. معلمات حرجة هي قطر شعاع الليزر وحجم الفتحة الخلفي من الهدف الذي تم اختياره. وسوف تركز اللانهاية النظم البصرية مواز تماما شعاع الليزر (صفر التقارب). وينبغي أن المسافة بين L1 و L2 يكون مجموع أطوال التنسيق العدسات ، F1 + F2 ، والمسافة بين L3 L4 وينبغي في المقابل F1 '+ F2. المسافة بين اله المزدوج أزواج الجليل ليست حرجة. ويمكن تعديل موقف L3 بدقة للسيطرة على التقارب شعاع ، وسوف تكون هناك حاجة <تعديلات 1mm إلى ضبط تركيز الليزر للتركيز الصورة. يجب التأكد من إزالة جميع العدسات والفلاتر وفتحات ، وما إلى ذلك من وحدة الوسيطة التي قد تكون في مسار شعاع (أو تكون على علم بما يفعلونه ، وضبط النظام الخاص بك وفقا لذلك).

الشكل 3
الشكل 3 محاذاة شعاع الليزر من خلال العدسات المزدوجة الجليل. إزالة المشابك المجهر من جانب واحد من المجهر بحيث يمكن نقل المجهر للخروج من مسار الشعاع ، ولكن تبقى المشابك سيسمح المجهر أعادت على وجه التحديد. فكر سلامة الليزر. تأكد من تعديل قوة الليزر إلى أدنى حد ممكن مع المستقطب Glan طومسون. بدوره على الليزر وعرض نمط شعاع الليزر على الحائط. قد تجد ورقة ملصقة على الجدار يساعد على عرض ليزرالبقعة. ضبط منهجي مواقف العدسات لالتعود على ما يقومون به لحجم الحزم والمظهر. يجب أن تشاهد شيئا يشبه لوحة A ، حيث يقع لامركزي بقعة مكثفة في التشكيل باهتة. شنت استخدام المرآة السكك الحديدية المركبة لضبط بقعة مكثفة لمركز كما هو مبين في لوحة باء الآن استخدام المنظار العلوي مرآة لاعطاء لمحة موحدة الطرفية. إذا تم كل شيء بشكل صحيح محاذاة يجب أن تجد الآن أن تحريك العدسات يؤدي شعاع لتوسيع والعقد متناظر. تحريك العدسات إلى مناصب ابتداء كما هو مبين في الشكل 2. اعتراض شعاع الآن على مسافة والهدف فتحة الظهر. يجب أن تكون دائرية ، على الأقل كبيرة بما يكفي لملء الفتحة ظهرك ، وسطوع موحد. فلا بأس إذا كان أكبر ، ما دام لديك ما يكفي من الطاقة ليزر لablations الخاص. تقييم التقارب بمقارنة شعاع قطره على مسافة والهدف فتحة الظهر والجدار. شعاع قطره ينبغييكون مطابقا لشعاع تقارب الصفر. شريط المقياس 10MM.

الشكل 4
الشكل 4 محاذاة للتوسع شعاع الليزر إلى شعاع المكثف. مصراع الليزر ونقل المجهر مرة أخرى في مسار شعاع الليزر باستخدام المشابك ويتوقف المحاذاة. تشغيل ، تؤيد ، وتركيز شعاع مكثف باستخدام الهدف العدسة. الشريط الورق على oculars لمنع أي شخص من عرض مكثف ينعكس ضوء الليزر. تدوير برج موضوعية لموقف فتح. وضع قطعة من الورق على المسرح لتسد شعاع المكثف. بدوره على ليزر لإزالة النمط المستمر ومصراع السلامة الميكانيكية. يجب أن تشاهد بعض ضوء الليزر المقبلة على رغم المجهر. تخفيف المشابك المجهر ودفع برفق المجهر لمحاذاة شعاع الليزر مع شعاع المكثف. يجب أن تكون دائرية شعاع الليزر وسطوع موحد. فمن المفيد أحيانا adjuشارع السكة محمولة على العدسات. يجب أن تكون قادرة على توسيع والعقد شعاع الليزر موحد إذا المحاذاة الصحيحة. يمكنك مركز شعاع الليزر تعاقدت على شعاع مكثف مع الحد الأدنى تركز المرآة السكك الحديدية المركبة ومن ثم توسيعه إلى الحجم المطلوب. بمجرد ضبط الموقف من الحزم التعاقد مع مرآة السكك الحديدية ، وسوف تحتاج الى اعادة هيكلة رأس بيريسكوب مرآة للحفاظ على منصة موحدة للسطوع شعاع الموسعة. إذا لم تتمكن من الحصول على التعميم تركز شعاع الليزر ثم سوف تحتاج إلى العودة من خلال الخطوات السابقة المحاذاة.

الشكل 5
الشكل 5 مركز البقعة الاجتثاث وضبط التقارب شعاع الليزر للتركيز الأمثل. إيقاف مصراع والليزر. إزالة الورق وتركيب الشريحة المستهدفة معكوسة (يمكنك أيضا استخدام الحبر علامة دائمة على ساترة كهدف 2). خدوش على السطح صورة معكوسة مع 60X عدسة النفط 1.4na) والآن صورة السطح مع مبائر أو CCD. لا تنظر من خلال oculars في حين أن الليزر هو عليه. بدوره على وunshutter الليزر. مجموعة ليزر لتحريك الوضع ، أدنى السلطة ، وهرتز 100. يؤدي حوالي 10 البقول. سترى بقعة الاجتثاث من 1-5 أم في قطر في غضون 10 أم من مركز العرض. إذا كنت لا ترى بقعة الاجتثاث يمكنك زيادة قوة الليزر في الخطوات 5-10 ٪. بمجرد تحديد بقعة الاجتثاث ، لأنها مركز مجال الرؤية. عبر وضع الشعر في 256 إحداثيات 256 ، إذا عرض الصور 512X512. إذا كنت ضبط بقعة الليزر إلى المركز ثم فإنه لن تغير موقفها مع التكبير. استخدام السكك الحديدية التي شنت مرآة لتحريك بقعة الاجتثاث لمرمى المركز. اعادة تقويم التوحيد من شعاع الليزر من خلال النظر في شعاع بهدف إزالة كما هو موضح أعلاه في الشكل 4. ضبط شعاع التوحيد مع مرآة بيريسكوب شنت أعلى. كرر تقييم الموقف الاجتثاث الفور. هذه هي تكرارية عrocess أن تتكرر حتى يتم توسيط بقعة الاجتثاث وتوسيع شعاع غير موحدة. إذا فعلت بشكل صحيح سوف يكون الاجتثاث بقعة دائرية كما رأينا في بقعة الاجتثاث في التركيز في الشكل. تقييم القادمة تركيز شعاع الليزر في محور Z. الزناد ليزر لإنتاج بقعة الاجتثاث من حوالي 1 ميكرون في المركز. ننتقل الآن الشريحة حوالي 5 أم أفقيا والتركيز 1 أم تحت سطح الشريحة المستهدفة. الزناد ليزر باستخدام الليزر ضبط نفس استخدمته لبقعة الاجتثاث الأول. بعد تكرار التركيز 1 أم فوق سطح الشريحة المستهدفة. إذا ركزت شعاع الليزر إلى التركيز على الصورة ثم سترى نمطا مماثلا لذلك هو موضح في هذا الشكل. يجب على بقعة أكبر الاجتثاث تتوافق مع تركيز الصورة والبقع الاجتثاث أعلاه وأدناه التركيز يجب ان تحصل على أصغر متناظر. ضبط العدسة L3 لمحاذاة طائرات التنسيق. وسوف تتحرك بعيدا عن عدسة L3 المجهر جعل شعاع متقاربة أكثر وسوف تتحرك بقعة الاجتثاث أقرب إلىهذا الهدف. وستكون هناك حاجة صغيرة <تعديلات 1MM بالقرب من التركيز. أنت الآن على استعداد لقطع محاور عصبية. شريط النطاق هو 1 ميكرون.

الشكل 6
الشكل 6 الديدان لتركيب axotomy الليزر والتصوير مرور الزمن. يسخن Agarose 10 ٪ في المياه المالحة حتى ذابت تماما. يتم وضع قطرة صغيرة على شريحة المجهر والزجاج المسطح ثم مع شريحة أخرى لتشكيل لوحة مسطحة. تم تعيين سمك اللوحة بواسطة شريط لاصق على شريحتين المجاورة. ولا يسمح لوحة لتعيين لحوالي 1 دقيقة ومن ثم يتم فصل الشرائح. ويستخدم "Sharpie" من أعلى كما قطع الكعكة على شكل لوحة موحدة الحجم من حوالي 13mm. تضاف 1 من المجاهدين Muscimol 10MM و 1 ماي من المجهرية إلى وسط لوحة (فانغ الين اتصال شخصي). تضاف إلى الانخفاض الديدان 2 المجاهدين والتوجه قبل طرحها على ساترة الزجاج. ثم يتم تطبيق الفازلين من حقنة (20-25 الجا. إبرة) إلى حافة ساترة لختم عليها.


الشكل 7 النتائج النموذجية لaxotomy الليزر في ايليجانس جيم. في ويمكنك ان ترى محوار سليمة قبل فترة وجيزة ، وبعد axotomy الليزر. الفجوة عادة حول 1um - 0.5. B عروض الليزر axotomy واحد دون الإضرار محور عصبي محور عصبي قريب حوالي 1 أم بعيدا. تم تعيين ليزر لحوالي 10 ٪ من الطاقة (0.3 ميغاواط في المتوسط ​​في 2500 هرتز) ، والبقول 100. شريط المقياس 5 ميكرون.

الشكل 8
الرقم 8. البرية نوع نموذجي L4 التجدد. هذه هي سلسلة زمنية تظهر الاجتثاث وتسجيل الوقت الفاصل بين التجديد محور عصبي. بعد وقت قصير من الليزر على axotomy 0 دقائق يمكنك ان ترى لمبة التراجع. بأغلبية 138 دقيقة انسحب لمبة التراجع مرة أخرى إلى مدى أبعد ، وبدأت الآن لإعادة. ويمكن رؤية غشاء نتوءات متفرقة (mircospikes أو أرجل كاذبة خيطية) على طول محور عصبي رمح (سهام 138 و 324). وجدعة الحق يمد بشكل جيد مخروط النمو المضغوط في 360 دقيقة. في 414 دقائق ومدد كل من جذوع مخاريط النمو. الأولي مخاريط النمو الجنيني تصبح شبيهة التصنع لأنها تمتد في اتجاه الحبل الظهري العصبية (414 ، 519 دقيقة 597). والتصنع المماطلة مخاريط النمو قصيرة من الحبل الظهري العصبية (960 دقيقة). النصال نشير جدعة القريبة ومخاريط النمو. الأسهم تشير إلى نتوءات على طول الغشاء رمح محوار القريبة. 20um نطاق العارضة.

فيلم 1. الفيلم من نوع البرية التجدد محور عصبي. هذا الفيلم يسير جنبا إلى جنب مع نقاط الوقت هو موضح في الشكل 8. وقد شنت الديدان كما هو موضح في البروتوكول وكانت محاور تصوير كل ثلاث دقائق لنحو 10 ساعة. كانت المداخن Z (20 X 1um) المتخذ في كل نقطة زمنية ودمجها في الصور واحدة بواسطة خوارزمية الإسقاط الأقصى (عناصر شيكل). اضغط هنا لمشاهدة الفيلم.

Discussion

هناك العديد من مناقشات جيدة مع الأنظمة المجهرية ليزر ليزر مختلفة 3،5-11. الفيمتو ثانية ليزر الأشعة تحت الحمراء هي "المعيار الذهبي" لالتذرية الليزر التحت خلوية 12 و مريحة اذا المرتبطة منشأة التصوير ، لكنها غالبا ما تكون مكلفة للغاية للمستخدمين الفرديين. إذا كنت تحتاج إلى ليزر الفيمتو ثانية الأشعة تحت الحمراء للتصوير عينتك بسبب عمق التصوير ثم ستحتاج على الارجح واحدة من أجل axotomy الليزر. الأنسجة شفافة مع المحاور المستهدفة في غضون 30-50 ميكرون السطح ربما تكون مجدية مع نبض الليزر الزرقاء والخضراء في نطاق الجامعة الاردنية / 20 نبضة المستهدفة من خلال عدسة عالية الغمر غ. وسوف يكون هناك المزيد من الاضرار الجانبية مع النانو والليزر بيكو الثاني مقارنة مع ليزر الفيمتو ثانية ، خصوصا أن عمق يزيد محوار المستهدفة. جيم ايليجانس شفاف وجميع محاور هي أم في غضون 20-30 من السطح. نقطع بشكل روتيني المحاور الحركية التي يتم في غضون 5 ميكرون من السطح. لدينا أيضا بسهولة خفض الفأسإضافات داخل الحلبة العصبية التي هي حوالي 20 ميكرون من سطح بشرة. وجدنا حد لقطع محاور أن يكون حوالي 30-50 أم من خلال قطره دودة الكبار. فمن المحتمل أن نظام الليزر التذرية وصفها هنا سوف تعمل بشكل جيد مع الاستعدادات المختلفة التي تتلاءم مع معايير الشفافية وعمق المحاور المستهدفة. ومع ذلك ، فإنه هو قليلا من المستغرب ، نظرا للمزايا النظرية ليزر الفيمتو ثانية الأشعة تحت الحمراء ، التي نانو وبيكو ثانية نانومتر 355 و 532 نانومتر ليزر أداء جيدا جدا ليزر axotomy في C. ايليجانس 6،13. نحن لا نرى أي اختلافات في التجدد محوار ردا على axotomy الليزر مع النانوسيكند 440 نانومتر ، النانوسيكند نانومتر 532 ، والليزر الفيمتو ثانية الأشعة تحت الحمراء.

الحالة الصلبة للأشعة فوق البنفسجية 355 نانومتر ليزر نحو نفس تكلفة الصمام الثنائي ضخ 532 نانومتر بسلبية Q - مبدلة ليزر الحالة الصلبة ، ولكنها تتطلب صلاحيات أعلى أو البصرية التي تمر بكفاءة هذه أقصر طول موجي. صممت معظم البصريات لأداء جيدا مع 400 مرئية --700 نانومتر الخفيفة. والليزر 355 نانومتر تقدم بعض المزايا مثل عتبة 6 البلازما مخفضة ، أصغر حجم البقعة ، ومزدوج اللون تمريرة طويلة ومباشرة بكفاءة 100 ٪ من التذرية الليزر إلى الهدف ، والسماح التصوير المتزامن لGFP دون فقدان الإشارة العينة. وأشعة الليزر الزرقاء 440 نانومتر الإبقاء على مزايا العمل مع ليزر الضوء المرئي (الأداء الجيد مع البصريات القياسية والسلامة). لسوء الحظ ، فإن تكلفة تشغيل DPP Q - 440 ليزر الحالة الصلبة نانومتر هي 3 أضعاف تكلفة الليزر 355nm نانومتر أو 532 من قوة مماثلة في هذا الوقت. إذا كنا في وضع نظام جديد لجيم ايليجانس ، حيث عمق الهدف هو الحد الأدنى ، فإننا اختيار عدسة شفافة للأشعة فوق البنفسجية (يكلف نحو 3،000 دولار للعدسة النفط 1.3na 40X مع نفاذية 50-70 ٪ في 355nm) والليزر 355 نانومتر المنتجة UJ 10/05 / نبضة في 1 -20 كيلو هرتز.

ويعتقد محوار الاجتثاث أن ذلك يعود إلى تشكيل البلازما. وسوف أقصر البقول عتبات إنتاج البلازما في خفض استهلاك الطاقة وحجم البلازما ث أن سوء أصغر 6. والهدف هو انتاج البلازما أصغر وأقصر عمرا من خلال تعديل نبض الطاقة إلى أدنى السلطة. وأكبر معمرة البلازما تولد فقاعات التجويف أن الأضرار المحيطة بها الخلايا. لقد وجدنا عموما ان الاجتثاث باستخدام حوالي 5-10 البقول على أعلى تردد (أي 2.5kHz) يعطي أفضل النتائج. هذا يشير إلى أن الضرر يمكن أن تكون متكاملة تدريجيا خلال سلسلة من النبضات لتحسين مراقبة مدى الضرر. نظام الليزر التذرية الموصوفة هنا هو متسامح جدا إذا محاذاة شعاع وتوسعت بشكل دقيق. نبدأ في خفض المحاوير الديدان البالغة في قوة الليزر 10 ٪ (في المتوسط ​​0.3 ميغاواط في 2500 هرتز يقاس ويقدر UJ 1 / نبض) ويمكن أن يقلل من تلف محدودة من خلال السلطة المحلية 14 ٪. يمكنك مراقبة مناطق أكبر من الضرر 15-39 ٪ طاقة الليزر ، ولكن فقط فوق طاقة بنسبة 40 ٪ (حوالي 1 في المتوسط ​​بنحو 2500 ميغاواط قياس هرتز) لا الديدان تنفجر بسبب فقاعات التجويف الكبيرة والأضرار التي لحقت جليدة الدودة.

e_content "> وآخرون 2010 2 ورقة ممتازة من الموارد لبناء نظام التذرية الليزر. Steinmeyer أفيري ليون أيضا وصفا لطيفة العملي لنظام الليزر التذرية على أساس الغاز N2 غير مكلفة ليزر 337 نانومتر وانه يوفر بعض عملية كبيرة نصيحة (elegans.swmed.edu / Worm_labs / افري /). عند تصميم النظام الخاص بك يجب عليك التحدث أولا مع الممثل الخاص المجهر لتحديد كيفية استهداف الليزر التذرية إلى الهدف المجهر. ينبغي شن المجهر الخاص بك على الاهتزاز جدول العزلة (نيوبورت ، TMI ، ثور). بارز اللوح هو الأمثل ، ولكن لا يزال من أعلى الفولاذ الصلب يمكن استخدامه مع positioners المغناطيسي ألف وحدة مخصصة المتوسطة على نطاق تستقيم هو لطيف لأنه لا يمكن أن تترك جميع العناصر البصرية في مكانها ، إلا أنه قد تكون أقل تكلفة وأكثر ملاءمة لاستخدام منفذ الكاميرا (مقلوب) او "الموحد" تعلق على منفذ البرنامج الموسع للتمنيع ، فلوري ، تحتاج إلى معرفة حجم الفتحة في الظهر والنفاذية (في A blation الليزر الطول الموجي) من عدسة الهدف كنت تنوي استخدامها. بمجرد اتخاذ قرار بشأن ليزر (على سبيل المثال ، Crylas ، زخر ، كريستال ، أو لجنة حقوق الطفل) يجب عليك الاتصال ثور أو نيوبورت للمساعدة في اختيار العناصر الصحيحة البصرية ، وأجهزة ومعدات السلامة. قررنا على المتوسع شعاع الجليل مزدوج لتوفير مساحة ، ولكن أبسط المتوسع كبلر هو خيار (f2/f1 عامل التوسع =). وسوف تكون مخصصة المتوسع شعاع الأقل كلفة ، ولكن نيوبورت ، ثور ، والعديد من الشركات المصنعة ليزر نقدم نوعية ممتازة التجارية شعاع المتوسع. بعض الشركات المصنعة ليزر كما تقدم مخففات اليدوية والتي تسيطر عليها الكترونيا التي قد تكون فعالة من حيث التكلفة وتوفير مساحة ، ولكن ليس تنوعا مثل المستقطب Glan طومسون ونصف لوحة الموجة. وسوف تحتاج أيضا إلى اتخاذ قرار بشأن كيفية السيطرة على الليزر. يمكنك تصميم وحدة تحكم LABVIEW يستند إلى استخدام المولدات TTL التجارية ، أو البرامج التي تقدمها الشركة ليزر. مناقشة الخيارات مع الشركة المصنعة ليزر معينة.

خيمة "> لقد قدمنا ​​لائحة من الأجهزة لدينا تستخدم فقط كدليل عام. النظام الموصوفة هنا تكلف حوالي 15000 $ عند إضافتها إلى نظامنا التصوير الموجودة. قسمك الفيزياء المحلية وغالبا ما يكون شخص ما على استعداد لتوفير مقدمة عملية ل العمل بأمان مع شعاع الليزر الحرة.

الطرق البديلة لتجميد والفاصل الزمني للتصوير C. وقد وصف مؤخرا ايليجانس (14).

المشاكل

الخطوة الأصعب والأكثر أهمية هو محاذاة شعاع تركز على توسيع المحور البصري للالمجهر. مرة واحدة لديك شعاع تركزت وتوسعت من خلال عدسات الجليل يجب أن نعمل بجد للحصول عليه الانحياز في حدود 5 أم محور المجهر الضوئي وقبل استخدام المرايا لتوجيه محاذاة النهائي للمركز. والإفراط في استخدام المرايا لتوجيه أشعة لمواءمة المجهر نقله خارج المحور من خلال شعاعالمتوسع. USING الحذر الشديد يمكنك التخفيف من شعاع الليزر مع فلتر ND المناسبة وعرضها مباشرة على ملف شعاع الليزر على الهدف العاكسة (المرآة الأمامية السطحية). يمكنك دفع برفق المجهر لمركز شعاع بالتحديد في مجال الهدف من عرض 60X (إذا كان لا يمكن أن تتركز في نطاق يصل إلى أسفل / تحتاج إلى ضبط ارتفاع السكك الحديدية). ويمكن استخدام ملف شعاع لمحاذاة بالضبط محور المجهر الضوئي لإعطاء شعاع التي تركزت دائرية و "مشاعل" متناظر. قنبلة غير المتماثلة هو إشارة إلى أن ليس المحور المجهر المنحازة تماما (أو ليس على مستوى السكك الحديدية). أخيرا ، يجب عليك ضبط L3 وحتى نرى توسعا ومتناظرة والانكماش من الحزم. تركيز المجهر بدقة على سطح الهدف ثم L3 ضبط تركيز شعاع الليزر إلى أصغر بقعة. يجب أن تجد الآن أن شعاع الليزر في غضون 5 ميكرون للمركز عندما التقط عبر LSCM أو نظام CCD وضمن بقعة الاجتثاث1um التركيز Z.

إذا كنت تجد "نسف" الديدان أو توليد فقاعات باستمرار التجويف كبيرة لخفض المحاوير المشكلة هو الأكثر احتمالا محاذاة غرامة الليزر التذرية. تأكد من أن الحد الأدنى (<500nm) هي بقعة الاجتثاث المترجمة إلى التركيز Z (ضبط التقارب مع عدسة L3) والبقعة XY الائتمانية (مع ضبط مرآة الماضي شنت kinematically).

وسوف تستهدف المحاوير أقرب إلى السطح تتطلب طاقة أقل ليزر. وبالمثل ، فإن الحيوانات الصغيرة (L1 و L2) تتطلب طاقة أقل ليزر لaxotomy مقارنة استهداف المحاور نفسها في البالغين.

إذا كان لديك نوع المحاور البرية لا تتجدد أو التبييض المحاور يجب أن تحاول خفض قوة الليزر أو التصوير خفض معدل أخذ العينات. إذا كان لديك الديدان تموت ، أو أن تصبح مريضا حاول تقليل Agarose في المئة في الخطوات من 1 ٪. تأكد من انك لا تتحرك في ساترة الديدان بعد تصاعد لأن هذا سوف يتسبب في كثير من الأحيان إلى الموت عند استخدام عالية فيcentage agarose والمجهرية.

إذا انفجر الديدان الخاص أو يموت خلال جلسة مرور الزمن هو للأسباب التالية : 1. agarose النسبة مرتفعة للغاية. 2. الأضرار التي لحقت إهاب بواسطة الليزر التذرية. 3. حركة ساترة بعد التركيب. إذا كان الضرر الذي يلحق إهاب هو على خطأ فإنه يؤثر فقط على الديدان التي شنت استهدفوا مع الليزر التذرية.

إذا كان لديك دودة تتحرك كثيرا أثناء جلسة مرور الزمن حاول زيادة نسبة agarose في خطوات 0.5 ٪. المحاوير صحية سليمة في الديدان هي دائما "النشط" وعرض على مستوى ثابت من مضان. إذا رأيت انخفاض مفاجئ في مضان أو نشاط الدودة تموت او ميتا. محاور متعددة من الخرز أو مجزأة هي علامة مؤكدة على دودة الموت أو ميتا.

إذا كان لديك مشاكل في الحفاظ على المحاور الخاص في التركيز خلال الدورة بأكملها الفاصل الزمني قد تكون هناك مشاكل عديدة ومختلفة. الاختيار الأول الخاص الانجراف مرحلة من مراحل التصوير عينة خاملة على شريحة زجاجية أكثر من 10 ساعةروبية. قد يكون الانجراف ميكرون قليلة بسبب عدم الاستقرار الحراري ، ولكن أكبر من 5 ميكرون وربما يرجع ذلك إلى القضايا الميكانيكية مع مجهر الخاص. مع تصاعد المشاكل هي أكثر شيوعا. اسمحوا الديدان الخاص شنت يوازن مع مرحلة المجهر الخاص لمدة 30 دقيقة قبل بدء انقضاء الوقت الخاص. تأكد من أن الختم الخاص الفازلين لم تتطور تسرب أثناء وقتك انقضاء الدورة.

Disclosures

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Acknowledgments

وأيد هذا البحث من قبل مؤسسة العلوم الوطنية ، وصندوق الوقف ماكنايت علم الأعصاب ، وكريستوفر ودانا ريف وAmerisure مؤسسة الخيرية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Name of the reagent Company Catalogue number Comments (optional)
535 nm Laser Crylas FDSS532Q3 (TEEM, Crystal, and CRC also offer comparable lasers)
All optics and hardware (Thor offers comparable optics and hardware)
SUPREMA Optical Mount, 1.0-in diameter Newport Corp. SS100-F2KN 2
1" diameter post, 1" height Newport Corp. PS-1 1
1" diameter post fork Newport Corp. PS-F 1
Achromatic Zero-Order Wavel Plate, ½ Wave Retardation, 400-700nm Newport Corp. 10RP52-1 1
Rotation Stage, 1" Aperature Newport Corp. RSP-1T 1
1" diameter post, 1" height Newport Corp. PS-1 1
1" diameter post fork Newport Corp. PS-F 1
Glan-Laser Calcite Polarizer, 430-700nm Newport Corp. 10GL08AR.14 1
Polarizer Rotation Mount Newport Corp. RM25A 1
¼" spacer for 1" diameter post Newport Corp. PS-0.25 1
½" height, 1"diameter post Newport Corp. PS-0.5 1
Fork, 1" diameter post Newport Corp. PS-F 1
Beam Dump Newport Corp. PL15 1
Microscope Objective Lens Mount Newport Corp. LH-OBJ1 1
1" diameter post, 1" height Newport Corp. PS-1 1
1" diameter post fork Newport Corp. PS-F 1
High-Energy Nd:YAG Laser Mirror, 25.4 mm Diameter, 45°, 532 nm Newport Corp. 10Q20HE.2 4
SUPREMA Optical Mount, 1.0 inch diameter, clearance mounting hole Newport Corp. SN100C-F 2
High Precision Knob Adjustment Screw, 12.7mm travel, 100TPI Newport Corp. AJS100-0.5K 4
Thread adaptor, ¼-20 male, 8-32 female Newport Corp. SS-1-B 2
Rod Clamp for 1.5 inch diameter rod Newport Corp. 340-RC 2
Rod, 14 inch (35.5 cm) tall Newport Corp. 40 1
Rail carrier for X26, square 40mm length Newport Corp. CN26-40 4
Steel Rail, 384mm (15") length Newport Corp. X26-384 1
Rod Platform for 1.5 inch diameter rod Newport Corp. 300-P 2
Rod, 14 inch (35.5 cm) tall Newport Corp. 40 2
Plano-Concave Lens, 12.7mm diameter, -25mm EFL, 430-700nm Newport Corp. KPC025AR.14 2
Plano-Convex Lens, 25.4mm diameter, 50.2mm EFL, 430-700nm Newport Corp. KPX082AR.14 1
Plano-Convex Lens, 25.4mm diameter, 62.9mm EFL, 430-700nm Newport Corp. KPX085AR.14 1
Fixed Lens Mount, 0.5" diameter, 1.0" Axis height Newport Corp. LH-0.5 2
Fixed Lens Mount, 1.0" diameter, 1.0" Axis height Newport Corp. LH-1 2
Microspheres 0.1um Polysciences, Inc. 00876
Agarose Research Products International Corp. A20090 EEO matters
Muscimol Sigma-Aldrich M1523

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway. Science. 323, 802-806 (2009).
  2. Steinmeyer, J. D. Construction of a femtosecond laser microsurgery system. Nature protocols. 5, 395-407 (2010).
  3. Wu, Z. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching. Proc Natl Acad. 104, 15132-15137 (2007).
  4. Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature protocols. 5, 1888-1902 (2010).
  5. Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. J. Microsc. 234, 1-8 (2009).
  6. Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Physical review letters. 99, 158104-158104 (2007).
  7. Venugopalan, V., Guerra, A. 3rd, Nahen, K., Vogel, A. Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation. Physical review letters. 88, 078103-078103 (2002).
  8. Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans. Opt Express. 16, 5963-5963 (2008).
  9. O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), e1129-e1129 (2009).
  10. Tsai, P. S. Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 90-99 (2009).
  11. Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30-30 (2006).
  12. Shen, N. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor. Mech. Chem. Biosyst. 2, 17-25 (2005).
  13. Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Opt. Express. 16, 9884-9894 (2008).
  14. Rohde, C. B., Yanik, M. F. Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates. Nat. Commun. 2, 271-271 (2011).

Tags

علم الأعصاب ، العدد 57 ، axotomy الليزر ، والتجدد ، مخروط النمو ، ومرور الوقت ،
بناء منخفض الميزانية Axotomy نظام ليزر لدراسة التجديد في أكسون<em> C. ايليجانس</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Williams, W., Nix, P., Bastiani, M.… More

Williams, W., Nix, P., Bastiani, M. Constructing a Low-budget Laser Axotomy System to Study Axon Regeneration in C. elegans. J. Vis. Exp. (57), e3331, doi:10.3791/3331 (2011).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video
Waiting X
Simple Hit Counter