Summary
Лазерная axotomy следуют покадровой визуализации чувствительных способов анализа эффектов мутаций в
Abstract
Лазерная axotomy следуют покадровой микроскопии является чувствительным тест для фенотипов аксон регенерации в C. Элеганс 1. Основная трудность данного анализа воспринимается стоимость ($ 25-100K) и технические знания, необходимые для реализации системы лазерной абляции 2,3. Тем не менее, твердотельные лазеры скромных затрат (<$ 10K), могут обеспечить надежную производительность для лазерной абляции в прозрачной подготовки, где целевые аксоны "близка" к поверхности ткани. Строительство и выравнивание системы может быть выполнена в день. Оптического пути при условии, светом сосредоточено конденсатора к лазерной абляции обеспечивает удобное руководство выравнивания. Промежуточный модуль с оптикой удалены все может быть посвящен лазерной абляции и уверяет, что ни оптические элементы должны быть перемещены во время сеанса лазерной абляции. Дихроичных в промежуточном модуль позволяет одновременно с изображениями и лазерной абляции. Центрирование лазерного луча то исходящего пучка от сфокусированного линзой микроскопа конденсатора руководств начального выравнивания системы. Различные линзы используются для состояния и расширить лазерный луч, чтобы заполнить назад отверстие выбранной линзы объектива. Заключительные согласования и тестирования осуществляется с передней поверхности зеркальный целевой предметное стекло. Мощность лазера корректируется, чтобы дать минимальные месте абляции размера (<1 мкм). Абляции пятно в центре с точной настройки последнего кинематически установлены зеркала, чтобы перекрестие зафиксирован в изображение окна. Мощность лазера для axotomy будет примерно в 10 раз выше, чем необходима для минимального месте абляции на целевой слайд (это может меняться в зависимости от целевого использования). Черви могут быть иммобилизованы для лазерных axotomy и покадровой визуализации за счет установки на площадках агарозы (или в микрофлюидных камерах 4). Агарозном колодки легко сделать с 10% агарозном в сбалансированном солевом плавится в микроволновой печи. Капли расплавленного агарозы помещают на предметное стекло и уплощенная с другимстекло на площадку около 200 мкм (один слой ленты времени на смежных слайдов используется в качестве спейсера). "Шулера" крышка используется для вырезать форме диаметр круговой площадке 13 мм. Анестетики (1UL мусцимол 20 мм) и микросфер (Chris Фан-Йен личное общение) (1UL 2,65% полистирола 0,1 мкм в воде) будут добавлены в центре площадки следуют 3-5 червей ориентированы так, они лежат по левую стороны. Покровное стекло наносят вазелин, а затем используется для герметизации покровное и предотвратить испарение образца.
Protocol
1. Строительство системы лазерной абляции
Защитные очки лазерной безопасности и использования передового опыта лазерной безопасности во время первоначального выравнивания. Никогда не смотрите через окуляры, когда лазер включен.
- Упорядочить компоненты на плате, как показано на рис. 1 (см. также пример 2). Болт вниз лазера (с стояка пластины при необходимости), перископ пост, и повышенные поддерживает железной дороге.
- Поместите микроскоп для согласования с железнодорожной оси. Совместите с проходящим светом пучка от линзы конденсатора микроскопом. Выровнять высоту рельс (используйте уровень) и положение с регулируемой диафрагмы или линзы, прикрепленной к железной дороге. Диафрагмы или линзы должны быть выровнены на обоих концах железной дороге в конденсаторе луча. Лаборатория гнезд может помочь с регулировкой высоты рельса.
- Совместите Глана-Томпсона поляризатор и полуволновой пластинки, чтобы лазерный луч. Вам не нужно лазер для этого выравнивания. БEAM просто нужно пройти через обе, не задев их края. Повернуть поляризатор, чтобы обеспечить удобное положение и ориентацию для пучка дамп (рис.1). Вы будете вращать пластину полуволны для регулировки мощности лазера. Безопасные компонентов к плате.
- Включите лазер, набор частоты пульса до 100, в непрерывном режиме, а также снизить энергопотребление до минимума использование полуволновой пластинки. Используйте Post-It заметку или линзы бумаги для визуализации лазерного луча.
- Отрегулируйте и закрепите кинематически зеркала монтируются в последовательности от лазерной принести пучка до зеркала, которое устанавливается на конце повышенной железной дороге. Лазерного луча должна быть согласована примерно в центре зеркала. Зеркала должны быть ориентированы примерно 45 градусов к оси лазерного луча (рис. 1).
- Грубо настроить кинематически монтируется зеркало на вершине перископ и на конце железнодорожного выровнять лазерного луча к центру передается светового пучка от микроскопа. И лазерный луч и тон передал светового пучка от микроскопа можно одновременно визуализировать путем включения бумаги в пути луча. Убедитесь, что все ND фильтров и отверстия в промежуточном модуле находятся вне или полностью открыта.
- Мелко выравнивание лазерного луча к центру проходящем свете луча с точной регулировки на верхней перископ и железнодорожных зеркал. Держите бумагу близко к железнодорожным зеркало и выравнивание лазерного луча к центру проходящего света пучка с верхнего зеркала перископа. Держите бумагу рядом микроскоп порт и выравнивание лазерного луча к центру проходящего света пучка с железнодорожным зеркало корректировки (рис.2).
- Позиция Post-It отметить в пути луча между выровнены линзы конденсатора и открытой башне цели. Вы должны увидеть проходящего света пучок с меньшим лазерного луча вблизи центра. Используйте точную настройку на железнодорожном зеркало, чтобы центр лазерного луча. Fix микроскопа в месте с зажимами.
Шаги 1.9-1.12 Являются необязательными, но это легко и полезно оценить выравнивание и лазерной абляции, прежде чем добавлять луч расширяется линз.
- Выключить лазер и заниматься механическим затвором безопасности. Поворот на 50% дихроичных из луча. Хотя нет прямого лазерного света пройдет в окуляры, отраженного света может быть довольно интенсивным. Горы целевой слайд точное выравнивание и изображений с целью 60X нефти. Сосредоточьтесь на царапины на слайде. Положить в ND4 и ND8 фильтр в промежуточном модуле.
- Изображение целевого слайда с CLSM, вращающийся диск, или ПЗС-камеры. Поворот на 50% дихроичных в лазерный пути. С этого момента вы никогда не должны смотреть через окуляры при лазерной абляции включен. Включите лазерной абляции и установить режим срабатывания частотой до 100, а число импульсов до 10. Убедитесь, что власти по-прежнему установлен на минимум с полуволновой пластинки, а затем открыть механический затвор безопасности. Вы можете simultaneouхитрый изображение и использовать лазерной абляции.
- Хотя визуализация целевого слайда, триггер лазерной абляции. Проверка целевого слайда для абляции месте 1-10 мкм в диаметре. Последовательно удалить нейтральные фильтры, пока абляции пятно видно. Отрегулируйте абляции пятно в центре изображения с железнодорожным зеркало. Вы хотите, чтобы добавить обратно ND фильтра имеются резервы для увеличения мелко мощности лазера с полуволновой пластинки, чтобы дать <1 мкм абляции месте. Изображение на 0,2 мкм / пиксель или меньше, и точно настроить абляции место для центра изображения (позиция 256256 512x512 с изображением).
- Проверьте глубину резкости и оси лазерного луча. Фокус вверх-вниз 1-2 мкм и проверьте положение абляции и размер аблации месте. Если лазерный луч аксиально выровнены абляции места не сдвинется с места. Безусловных лазерный луч будет распространять власть на протяжении нескольких мкм (около 3-5 мкм сверху вниз в фокусе).
2. Добавить линзы расширить лазерный луч, чтобы заполнить цель назаддиафрагмой и регулировать конвергенции контролировать фокус
- Эта система использует двойную Галилея луч расширители расширить лазерный луч, чтобы заполнить назад апертура объектива (10 мм). Горы 4 линзы на перевозчиков и прикрепить их к железной дороге (L1f1 + L2f2 и L3f1 '+ L4f2'). Настройка позиции, с тем, что все линзы на одной оптической оси и точно ортогональной лазерного луча (рис. 2).
- Включите лазер и настроить его на минимальную мощность и непрерывном режиме. Грубо настроить выравнивание луча через каждую линзу с использованием бумажных видеть лазерный луч и проходящем свете луча микроскопа конденсатора. Выключите и затвора лазера.
- Снимите зажимы с одной стороны микроскопа и слайд-микроскоп от пути лазерного луча. Включите лазер и удалить безопасность затвора.
- Штрафа выравнивания линз и лазерного луча может быть выполнена путем просмотра расширенной лазерный луч на соседней стене. Луч должен расширяться и сжиматься симметрично, когда леNSES перемещаются. Отрегулируйте последних двух кинематически установлены зеркала, чтобы выровнять пучка (рис. 3).
- Выровнены и расширены профиля пучка должна быть круглой и равномерной яркости (рис.3). Размер и однородность пучка может быть просмотрены с помощью Post-It в расчетное положение диафрагмы обратно цели.
- Пучок должен быть настроен на нуль сходимости для системы оптического бесконечности. Конвергенция может быть оценена, заметив, как изменение размера пучка при перемещении Post-It отметить дальше от линзы. Выключить лазер и заниматься механическим затвором.
- Слайд микроскопом обратно в пути лазерного пучка с помощью неподвижных зажимов для определения правильного выравнивания. Замените зажимы на свободной стороне микроскопа, но не затягивайте вниз.
- Включите лазер и удалить безопасность затвора. Поворот башни цель для открытой позиции. Место Post-It отметить на сцене. Вы должны увидеть расширена и равномерного лазерного луча по центру проходящем свете бEAM из конденсатора (рис.4). Возможно, вам придется его центр, ослабив зажимы микроскопом и тщательно подталкивает микроскопом.
- Привлекать безопасности затвора, и установить лазер для запуска режима. Поворот 60X цель на месте и изображение поверхности царапины на целевой слайд.
- Удалить безопасность затвора, спусковой крючок лазерной абляции и скорректировать мощность лазера для минимального месте абляции. Абляции месте должны быть круговыми и в течение 5-10 мкм от центра изображения.
- Центр абляции место с точной настройки кинематически установлены железнодорожные зеркало. Вам нужно будет многократно корректировать установлен железнодорожного и верхнего зеркала перископа как центр абляции месте и поддерживать равномерный профиль луча.
- Оценка фокус Z лазерного, перемещая фокус систематически вверх и вниз в 1 мкм шагов и запуска лазерной абляции. Расширены, выровнены, и сближение регулировать пучок должен удалять максимально на фокус изображения и слабо или вообще не 1 мкм ABОве или ниже фокус (рис. 5).
- Настройте фокус Z расширенного пучка на подвижную линзу L3 в телескоп Галилея (рис.2).
3. Лазерная axotomy и покадровой микроскопии аксон регенерации
- Микроволновая 10% агарозы (RPI молекулярной биологии класса РВЗ 0,1 A20090) в сбалансированном солевом до полностью растаял. Установите на горячей плите, чтобы держать это расплавленный во время использования для монтажа.
- Капли расплавленного агарозы помещают на предметное стекло и уплощенная с другим стекло на площадку около 200 мкм (один слой времени ленту на смежных слайдов используется в качестве спейсера).
- "Шулера" маркер крышка используется для вырезать форме диаметр круговой площадке 13 мм.
- Анестетики (1UL мусцимол 20 мм) и микросфер (Chris Фан-Йен, личное сообщение) (1UL 2,65% полистирола 0,1 мкм в воде) будут добавлены в центре площадки следуют 3-5 червей ориентированы так, они лежат на левой сторонах . Покровное стекло применяется, а затем VaselНИС используется для герметизации покровное и предотвращения испарения образца (рис. 6).
- Лазерной абляции выравнивается перекрестье, как описано выше, в начале каждой сессии. Привлекать затвора лазерной безопасности.
- Удалить целевой лазерной центровки и изображения монтируется взрослого червя с подходящим флуоресцентного маркера в целевой нейронов. Изображение аксонов на аналогичной увеличение (0,2 мкм / пиксель или большем увеличении), а также положение под перекрестие (рис. 7).
- Откройте затвор лазерной безопасности и вызвать лазерной абляции в то время как изображения. Оценка аксонов после запуска лазера и медленно увеличивать мощность лазера до аксона разреза. Вам понадобится около 10 раз больше мощности лазера, чтобы сократить аксонов, чем к форме абляции место на слайде выравнивание целевых (около 1uJ / нс импульс). Как правило, мы сократить с 100 импульсов на 2,5 кГц и силовой агрегат до 0.27mW (средняя мощность измеряется в образце с когерентной мощности FieldMaxII метра и лазерной установлено непрерывное при 2500 Гц). АбляцииМощность лазера установка будет соответствовать для резки аксонов в будущих экспериментах (рис. 7).
- Успешно сократить аксонов покажет перерыва около 0.5-1 мкм без потери яркости в два вырезать концы (рис. 7). Большие потери яркости и большой разрыв (2-10 мкм) часто означает значительный ущерб за аксон от кавитационных пузырьков. Проксимальных и дистальных аксонов будет отдельный и формы опровержения луковицы в течение следующих 30 минут (рис. 8 и Movie).
- Уравновешивать ваш смонтированный червей с вашего столике микроскопа в течение 30 минут перед началом промежуток времени записи. Это сведет к минимуму дрейф из-за разницы температур и агарозном сокращения.
- ) Покадровый изображений параметры задаются с использованием изображений программное обеспечение, связанное с вашей системой. Как правило, мы изображений Z 10-20 шагов (1um/step) на 0.1-0.2 мкм / пиксел использованием усиления, отверстие, скорость сканирования и визуализации настройки мощности лазера, которые минимизируют воздействие, давая желаемый пространственным разрешением. Отбор проб интервалы характерныLy 1-5 минут в течение 15 часов в зависимости от желаемого временным разрешением (рис. 8 и Movie).
- Покадровый данные изображения преобразуются в фильмы с помощью NIS Элементы или ImageJ.
4. Представитель Результаты:
Лазерная axotomy с использованием этой системы является надежным и рутины. Результаты, показанные на рисунке 7 являются типичными. Покадровый изображений аксонов регенерации очень устойчив, используя этот протокол. Мы регулярно вырезать и изображение до 5 аксонов в 5 различных червей на одном слайде использованием моторизованных этапе. Единственным ограничением является время, необходимое для сбора изображений каждый аксон, например, если он занимает 20 секунд, чтобы собирать стека для аксона то не более чем можно отведать 9 аксонов (9 стеки), если вы выборки каждые 180 секунд. Пример, показанный на рисунках 8 и 9 является хорошим результатом представителя. Около 10% эксперименты дают результаты этого качества. Остальные эксперименты дают хорошие данные по регенерации фенотип, но эстетически unappealING из-за небольшого дрожания движения червя, который обычно начинается через 5-8 часов иммобилизации.
Рисунок 1 Лазерная абляция система. 532 нм Nd: YAG лазер установлен на стояк пластины довести ее до высоты другие компоненты и болтами к макетной плате. (Оптический изолятор не является обязательным и, вероятно, не требуется). Глана-Томпсона поляризатор и полуволновой пластинки используются для мелко контроля мощности лазера. Они находятся в мелко калиброванные монтирует вращения. Будьте осторожны, установка луч свалку. Углом зеркало направляет лазерный луч на нижней перископ зеркало. Верхняя зеркало перископа направляет луч железнодорожного зеркало. Железнодорожных установлен на двух стержней поддерживаемых платформах. Двойной Галилея линзы крепятся к скользящей монтирует железной дороге. Обратите внимание, добавил промежуточные модуль, посвященный лазерной абляции. Система может быть сделан более компактным, удалив оптических Isolaсектора и углу зеркало, и изменение лазер, Глана-Томпсона поляризатор и полуволновой пластинки к задней кромке макетной плате.
Рисунок 2 Двойные линзы Галилея кондиционирования используются для дополнения 300 мкм TEMoo лазерный луч для нулевого равномерной сходимости 10 мм размером. Лаборатория разъем расположен под одной из платформ проведения железной дороге. Это помогает в настройке высоту рельс во время выравнивания шагов. Грубо регулировать высоту рельс, монтируя L1 объектив железнодорожных и использовании пучка конденсатора выравнивания руководства. Отрегулируйте железнодорожным транспортом, что конденсатор луч выравнивание по центру линзы на обоих концах рельса. Это позволит обеспечить железнодорожный выравнивается параллельно оптической оси микроскопа. Возможно, вам придется сначала настроить микроскоп, чтобы соответствовать оптической оси рельса. Используйте зажимы, чтобы исправить положение микроскопа (см. рис. 1). Удалить йE-рейку линзы. Теперь выравнивание лазерного луча к центру конденсатора пучка на обоих концах рельса. Бумаги в пути луча является удобным способом видеть оба пучка одновременно. Использование верхнего зеркала перископа для выравнивания лазерного луча в конденсатор пучка близко к-рейку зеркало. Используйте рейку зеркало для выравнивания лазерного луча в конденсатор пучка на дальнем конце железной дороге (ближе всего к микроскопом). Теперь смонтировать все четыре линзы рельсе, как показано на рисунке. Длина железной дороге, фокусное расстояние линзы, и линзы меры будет варьироваться в зависимости от вашего микроскопа и физические установки. Критические параметры диаметр лазерного пучка и размер диафрагмы обратно избранной цели. Бесконечность оптических систем основное внимание будет уделяться совершенно параллельные лазерного луча (нулевой сходимости). Расстояние между L1 и L2 должна быть сумма фокусных расстояний линз, f1 + f2, и расстояние между L3 и L4 должны быть соответственно f1 + f2. Расстояние между гоэлектронной дуальных пар галилеевых не является критическим. Положение L3 может быть точно скорректирована с управлением луча сходимости, <1 мм корректировки будут необходимы для настройки фокусировки лазера на фокус изображения. Обязательно удалите все объективы, фильтры, отверстий и т.д. из промежуточных модулей, которые могут быть в пути луча (или быть в курсе того, что они делают, и настроить системы соответственно).
Рисунок 3 Выравнивание лазерный луч через двойную Галилея линз. Удалить микроскопом зажимы с одной стороны микроскоп так микроскоп может быть перемещен из луча, но остальные зажимы позволит микроскопом, чтобы быть точно на место. Подумайте лазерной безопасности. Убедитесь, что мощность лазера настраивается на минимум с Глана-Томпсона поляризатора. Включите лазер и просмотра картины лазерный луч на стену. Вы можете найти бумаги, приклеенный к стене помогает, чтобы посмотреть лазерноеместо. Систематически корректировать позиции линзы, чтобы чувствовать себя за то, что они делают, чтобы размер пучка и внешний вид. Вы должны увидеть что-то вроде панели, где интенсивное пятно эксцентрично расположенного в диммер профиля. Использование рельсовых зеркало, чтобы настроить интенсивное пятно в центре, как показано на панели B. Теперь использовать верхнюю перископ установлены зеркала, чтобы дать единый периферического профиля. Если все будет выровнен правильно, вы должны теперь найти, что перемещение линз причины луч расширяться и сжиматься симметрично. Перемещение линзы обратно в исходное положение, как показано на рисунке 2. Теперь перехвата пучка на расстоянии диафрагмы обратно цели. Она должна быть круглой, по крайней мере достаточно большой, чтобы заполнить спину диафрагмы, а также равномерную яркость. Это нормально, если оно больше, до тех пор пока у вас есть достаточные мощности лазера для абляции. Оценка конвергенции путем сравнения диаметр пучка на расстоянии диафрагма цель назад и стены. Диаметр пучка должнобыть одинаковыми для нулевой луч конвергенции. Шкала бар составляет 10 мм.
Рисунок 4 Выравнивание расширен лазерный луч в конденсатор луча. Затвор лазерных и перемещать микроскоп обратно в пути лазерного пучка с помощью зажимов, как выравнивание останавливается. Включите, выравнивания и сосредоточиться конденсатор пучка с помощью объектива. Ленты бумагу окуляров, чтобы никто от просмотра интенсивной отраженного лазерного света. Поворот башни цель для открытой позиции. Положите листок бумаги, на сцену, чтобы закупорить конденсатора луча. Включите лазер на непрерывном режиме и удалить механическим затвором безопасности. Вы должны увидеть несколько лазерных свет, идущий хотя микроскопом. Ослабьте зажимы микроскоп и мягко подтолкнуть микроскоп для выравнивания лазерного луча с конденсатором луча. Лазерный луч должен быть круглым, с равномерной яркостью. Это иногда полезно adjuй-рейку линз. Вы должны иметь возможность расширяться и сжиматься лазерный луч равномерно, если выравнивание является правильным. Вы можете центр контракт лазерного луча до минимума в центре пучка конденсатора-рейку зеркало, а затем расширить его до нужного размера. После того как вы отрегулировать положение контракт пучка с железнодорожным зеркало, то вам нужно перенастроить закрепленные сверху перископ зеркало, чтобы поддерживать равномерную яркость расширенного пучка. Если вы не можете получить в центре круговой лазерный луч, то вам нужно, чтобы вернуться через более ранние шаги выравнивания.
Рисунок 5 Центр абляции место и отрегулируйте конвергенции лазерный луч для оптимальной фокусировки. Выключите и затвора лазера. Удалить бумагу и установить слайд зеркальные цели (вы также можете использовать стойкие чернила маркера на покровное как цель 2). Изображение царапин на зеркальной поверхности с 60X 1.4na нефти объектива) Теперь изображение поверхности с конфокальной или ПЗС-матрицы. Не смотрите через окуляры в то время как лазер включен. Включение и открывать ставни лазера. Установить лазер для запуска режима, самое низкое энергопотребление, и 100 Гц. Триггер около 10 импульсов. Вы должны увидеть абляции месте 1-5 мкм в диаметре в 10 мкм от центра зрения. Если вы не видите абляции месте вы можете увеличить мощность лазера в 5-10 шагах%. Как только вы определите абляции месте, в центре его поле зрения. Поместите перекрестие на 256, 256 координат при просмотре изображения 512x512. При настройке лазерного пятна к центру, то он не будет менять позицию с масштабированием. Используйте рейку зеркало, чтобы двигаться абляции месте в центре перекрестия. Пересмотреть однородность лазерного луча, глядя на пучок с целью удалить, как описано выше на рисунке 4. Отрегулируйте луч единообразия с верхней зеркала установлены перископ. Повторите оценку позиции месте абляции. Это итеративный рrocess, который должен быть повторен до удаления пятна по центру и расширил пучок форме. Если все сделано правильно абляции месте будет круговым, как показано на удаление пятна в фокусе на рисунке. Следующая оценка фокусе лазерного луча по оси Z. Триггер лазерной производить удаление пятна около 1 мкм в центре. Теперь переместите слайд около 5 мкм с боков и сосредоточиться 1 мкм под поверхностью целевой слайд. Триггер лазер с теми же настройками, как лазер, использованный для первого места абляции. Повторите после фокусировки 1 мкм над поверхностью целевого слайда. Если лазерный луч фокусируется на фокус изображения, то вы должны увидеть картину, подобную показанной на этом рисунке. Крупнейший абляции месте должна соответствовать фокус изображения и абляции пятна сверху и снизу основное внимание следует получать меньше симметрично. Отрегулируйте объектив L3 для выравнивания фокальных плоскостях. Перемещение линз L3 от микроскопом сделает луч более сходящихся и абляции пятно будет двигаться ближе кцели. Малые <1 мм корректировки будут необходимы около фокус. Теперь вы готовы сократить аксонов. Шкала бар составляет 1 мкм.
Рисунок 6 Монтаж червей для лазерных axotomy и покадровой съемки. 10% агарозы в физиологическом растворе нагревается до полностью растаял. Маленькая капля помещается на предметное стекло микроскопа стекло, а затем уплощенная с другой слайд, чтобы сформировать плоскую площадку. Толщина площадки устанавливается лента на двух смежных слайдов. Площадки допускается устанавливать в течение приблизительно 1 минуты, а затем слайды разделены. "Шулера" сверху используется в качестве шаблонных сформировать единую площадку размером около 13 мм. 1 мкл 10 мМ мусцимол и 1 мкл микросферы добавляют в центре площадки (Фан-Йен личное сообщение). Черви будут добавлены 2 ул падение и ориентированы, прежде чем положить на стекло покровное. Вазелин применяется затем из шприца (20-25 га. Иглы) к краю покровного стекла, чтобы запечатать его.
Рисунок 7 Типичные результаты лазерного axotomy в C. Элеганс. В вы можете увидеть нетронутыми аксон незадолго до и после лазерной axotomy. Разрыв обычно составляет около 0.5-1 мкм. В лазерных шоу axotomy одного аксона, не повреждая близлежащие аксон около 1 мкм прочь. Лазерная был установлен на около 10% мощности (0,3 мВт среднем на 2500 Гц) и 100 импульсов. Шкала бар 5 мкм.
Рисунок 8. Типичные дикого типа L4 регенерации. Это временных рядов показывает абляции и покадровой записи регенерации аксона. Вскоре после лазерной axotomy при 0 минут вы можете увидеть опровержение лампочки. По 138 минут втягивание лампа вытащил обратно до самой дальней степени и сейчас начали переделывать. Спорадические выступов мембраны (mircospikes или филоподий) можно увидеть вдоль вала аксонов (стрелки 138 и 324).Право пень простирается хорошо сформированные компактный конус роста на 360 минут. На 414 минут оба пни расширили роста конусов. Начальные эмбриональные типа конусов роста стали дистрофические, поскольку они распространяются на спинной нерв шнур (414, 519 и 597 минут). Дистрофических роста конусов стойло короткий спинной нервный шнур (960 минут). Стрелки указывают проксимальной культи и роста конусов. Стрелки указывают выступы вдоль мембраны проксимальных вала аксона. 20um Шкала бар.
Фильм 1. Фильм дикой регенерации аксонов типа. Этот фильм идет вместе с временными точками показано на рисунке 8. Черви были установлены, как описано в протоколе и аксонов были обследованы каждые три минуты в течение приблизительно 10 часов. Z стеки (20 X 1 мкм) были взяты в каждый момент времени и объединены в единый изображений, максимальная алгоритм проекции (NIS Elements). Нажмите сюда, чтобы посмотреть фильм.
Discussion
Есть несколько хороших обсуждений лазерной микрохирургии с различными системами лазерной 3,5-11. Фемтосекундных лазеров ИК-диапазона являются «золотым стандартом» для субклеточных лазерной абляции 12 и удобно, если связанные с изображения объекта, но они часто слишком дорого для отдельных пользователей. Если вам требуется фемтосекундного лазерного ИК-изображений для вашего образца из-за глубины изображения, то вы, вероятно, понадобится один для лазерных axotomy. Прозрачные ткани с целевыми аксоны в пределах 30-50 мкм от поверхности, вероятно, возможно с синими и зелеными импульсные лазеры в 20 мкДж / имп диапазон целевых через объектив высокого погружения па. Там будет больше побочного ущерба с нано-и пико второго лазеров по сравнению с фемтосекундного лазера, тем более что глубина увеличивается целевой аксона. C. Элеганс прозрачна и все аксоны в пределах 20-30 мкм от поверхности. Мы регулярно вырезать двигателя аксонов, которые находятся в пределах 5 мкм от поверхности. Мы также легко режется топоромдополнений среди нервное кольцо, что около 20 мкм от поверхности кутикулы. Мы обнаружили, предел для резки аксонов составляет около 30-50 мкм по диаметру взрослого червя. Вполне вероятно, что система лазерной абляции, описанные здесь будет хорошо работать с большим количеством различных препаратов, которые соответствуют критериям прозрачности и глубины целевой аксонов. Тем не менее, это немного удивительно, учитывая теоретические преимущества фемтосекундных лазеров ИК-порт, что нано-и пикосекундных 355 нм и 532 нм лазеров приносить такой же доход для лазерных axotomy на языке C. Элеганс 6,13. Мы не видим никаких различий в регенерации аксонов в ответ на лазерное axotomy с наносекундным 440 нм, 532 нм наносекундной и фемтосекундной ИК лазеров.
Твердотельные лазеры 355 нм УФ примерно ту же стоимость, как 532 нм с диодной накачкой пассивной модуляцией добротности твердотельный лазер, но требуют либо высших сил или оптика, которая эффективно передать эти коротких длин волн. Большинство оптики предназначены для выполнения хорошо видимый 400 -700 нм свет. 355 нм лазеров бы предложить некоторые преимущества 6 таких, как снижение порога плазмы, меньше размер пятна, и длинный проход дихроичных бы эффективнее прямого 100% от лазерной абляции до цели и позволяют одновременно изображений GFP без потери образец сигнала. Синие лазеры 440 нм сохранит преимущества работы с видимым лазерным светом (хорошая производительность со стандартной оптикой и безопасности). К сожалению, стоимость DPP добротности твердотельных 440 нм лазер в 3 раза стоимость 355nm или 532 нм лазер аналогичной мощности в это время. Если мы разрабатывали новую систему для C. Элеганс, где целевая глубина минимальна, мы хотели бы выбрать для УФ-прозрачного хрусталика (стоимость около $ 3000 за 40X 1.3na линзы нефти с 50-70% пропускания при 355nm) и 355 нм лазер производит 5-10 мкДж / имп на 1 -20 кГц.
Axon абляции, как считается, из-за плазменного образования. Более короткие импульсы будут производить плазменные пороговых значений, при меньшей мощности и объемы плазмы W плохо быть меньше 6. Целью является производство маленьких и кратчайшим сроком плазмы путем изменения энергии импульса до самой низкой мощности. Большие долгоживущих плазме будут генерировать кавитационных пузырьков, которые повреждают окружающие клетки. В целом, мы обнаружили, что удаление используя около 50-100 импульсов на высокой частоте (т.е. 2,5 кГц) дает наилучшие результаты. Это говорит о том, что ущерб может быть постепенно интегрирована в течение серии импульсов, чтобы лучше контролировать размер ущерба. Система лазерной абляции, описанный здесь, очень снисходительно, если луч выравнивается и расширена точно. Мы начинаем резки аксонов у взрослых червей на 10% мощности лазера (в среднем 0,3 мВт измеряется при 2500 Гц и около 1 мкДж / имп) и могут сократить с ограниченными локализованное повреждение до 14% мощности. Вы можете наблюдать большие площади ущерба от 15-39 мощности лазерного%, но только выше 40% мощности (около 1 мВт среднем измеряется при 2500 Гц) делают черви взорваться из-за больших кавитационных пузырьков и повреждения кутикулы червя.
e_content "> Штайнмайером и соавт. 2010 2 бумага является отличным ресурсом для построения системы лазерной абляции. Леон Avery также имеет хорошие практические описание системы лазерной абляции на основе недорогого газа N2 337 нм лазер, и он предоставляет некоторые большое практическое советы (elegans.swmed.edu / Worm_labs / Avery /). При разработке собственной системы, которую вы должны сначала поговорить с вашим микроскопом представитель чтобы определить, как целевой лазерной абляции для объектива микроскопа. Ваш микроскоп должен быть установлен на столе виброизоляции (Ньюпорт, TMI, Тор). макет верхней является оптимальным, но твердой стали топ-прежнему можно использовать с магнитной позиционеров. посвященная промежуточным модуля на вертикальном сферу приятно, потому что все оптические элементы могут быть оставлены на месте. Тем не менее, может быть дешевле и удобнее в использовании камеры порта (перевернутой) или "комбайнер", прикрепленные к эпи-флуоресцентный порт. Вы должны знать размер диафрагмы и обратно пропускания (по крайней blation длины волны лазерного излучения) объектива вы собираетесь использовать. Как только вы решите на лазерном (например, Crylas, кишат, Кристалл, или CRC), вы должны связаться с Тором или Ньюпорт за помощь в выборе правильного оптических элементов, оборудования и оборудования для обеспечения безопасности. Мы остановились на двойной Галилея расширителем пучка, чтобы сэкономить место, но более простой кеплеровской расширитель вариант (f2/f1 = коэффициент расширения). Пользовательские расширителем пучка будет самый дешевый, но Ньюпорт, Тор, и несколько лазерных производители предлагают отличное качество коммерческих луч расширителей. Некоторые лазерные производители также предлагают ручной и электронным управлением аттенюаторов, которые могут быть экономически эффективными и экономия места, но не столь универсальны, как Глана-Томпсона поляризатор и пластину полуволны. Вы также должны решить, как управлять лазером. Вы можете спроектировать LabView контроллер, использование коммерческих генератор TTL, или программное обеспечение, лазерный компании. Обсудить варианты с конкретным производителем лазера. палатка "> Мы предоставили список аппаратных мы использовали только в качестве общего руководства. системы, описываемой здесь стоит около $ 15000 при добавлении к нашей существующей системе формирования изображения. Ваш местный отдел физики часто будет кто-то готов предоставить практическое введение в безопасной работы с лазеров на свободных луча.Альтернативные методы иммобилизации и промежуток времени визуализации C. Элеганс недавно были описаны 14.
Поиск неисправностей
Наиболее трудным и важным этапом является выравнивание центру расширить луча оптической оси микроскопа. После того как вы луч по центру и расширены за счет Галилея линз вы должны упорно трудиться, чтобы получить его выровнены с точностью до 5 мкм оптической оси микроскопа Перед использованием рулевого зеркала для окончательного выравнивания по центру. Чрезмерное использование рулевого зеркал для выравнивания луч микроскопа будет двигать его от оси, проходящей через лучрасширителя. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПРЕДЕЛЬНО ОСТОРОЖНЫ вы можете ослабления лазерного пучка с соответствующим фильтром ND и непосредственно просмотреть профиль лазерного луча на отражающую цели (перед зеркальной поверхности). Вы можете мягко подтолкнуть микроскопом, чтобы точно центре пучка в 60X поле зрения цель (если она не может быть сосредоточена в вверх / вниз, диапазон вам нужно настроить высоту рельс). Профиля пучка может быть использована для точного выравнивания оптической оси микроскопа, чтобы дать в центре пучка, круговые и "вспышки" симметрично. Асимметричной вспышке признак того, что микроскоп ось не идеально ровные (или железнодорожным не уровень). Наконец, вы должны настроить L3 и посмотреть, даже и симметричном расширении и сжатии луча. Фокус микроскопом именно на поверхности мишени, а затем настроить L3 сфокусировать лазерный луч до мельчайших месте. Теперь вы должны найти, что лазерный луч находится в пределах 5 мкм от центра, когда отображаемого через LSCM или ПЗС-система и абляции пятно находится в пределах1 мкм фокус Z.
Если вы обнаружили, что "взрыв" червей или последовательно генерации больших кавитационных пузырьков, чтобы сократить аксонов ваша проблема, скорее всего, штраф выравнивание лазерной абляции. Убедитесь, что минимальный (<500 нм) абляции пятно локализовано в фокусе Z (регулировать сближение с L3 объектива) и XY фидуциарных пятно (настройки с прошлым кинематически смонтированы зеркала).
Ориентация аксонов ближе к поверхности будет требоваться меньше мощности лазера. Аналогичным образом, мелких животных (L1 и L2) будет требоваться меньше мощности лазера для axotomy по сравнению с той же ориентации аксонов у взрослых.
Если ваш дикий тип аксонов не восстанавливаются или отбеливателя аксонов вы должны попробуйте уменьшить изображение мощность лазера или уменьшении частоты дискретизации. Если черви умирают или становятся болезненным попробуйте уменьшить процент агарозы с шагом 1%. Убедитесь, что вы не движется покровное после монтажа червей, как это часто заставляет их умирать при использовании высоких вcentage агарозы и микросфер.
Если черви взорваться или умирают во время замедленной сессии это связано с: 1. Процент агарозном слишком высока. 2. Повреждение кутикулы путем лазерной абляции. 3. Движение покровное после монтажа. Если повреждения кутикулы виноват он будет влиять только на установленный червей, которые стали мишенью с лазерной абляции.
Если червь движется слишком много во время замедленной сессии попробуйте увеличить процент агарозы в 0,5% шаги. Здоровый аксонов у здоровых червей всегда "активный" и отображения постоянный уровень флуоресценции. Если вы увидите резкое уменьшение флуоресценции или деятельности червь умирает или мертвым. Несколько бисером или фрагментарной аксоны верный признак умирающего или умершего червя.
Если у вас есть проблемы с поддержанием вашего аксонов в центре внимания в течение всего сеанса промежуток времени может быть несколько различных задач. Первый этап проверить дрейф изображений инертного образца на предметное стекло в течение 10 чRS. Несколько микрон дрейфа может быть связано с тепловой неустойчивости, но больше 5 мкм, вероятно, из-за механических проблем с вашим микроскопом. Проблемы с монтажными являются более распространенными. Пусть ваш смонтированный червей равновесие со своим столике микроскопа в течение 30 минут перед началом промежуток времени. Убедитесь, что вазелин печать не развивались утечек в ходе сеанса промежуток времени.
Disclosures
Нет конфликта интересов объявлены.
Acknowledgments
Это исследование было поддержано Национальным научным фондом, Макнайт дарственного фонда для проведения Neuroscience, Кристофера и Даны Рив фонда и Amerisure благотворительный фонд.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 535 nm Laser | Crylas | FDSS532Q3 | (TEEM, Crystal, and CRC also offer comparable lasers) |
| All optics and hardware | (Thor offers comparable optics and hardware) | ||
| SUPREMA Optical Mount, 1.0-in diameter | Newport Corp. | SS100-F2KN | 2 |
| 1" diameter post, 1" height | Newport Corp. | PS-1 | 1 |
| 1" diameter post fork | Newport Corp. | PS-F | 1 |
| Achromatic Zero-Order Wavel Plate, ½ Wave Retardation, 400-700nm | Newport Corp. | 10RP52-1 | 1 |
| Rotation Stage, 1" Aperature | Newport Corp. | RSP-1T | 1 |
| 1" diameter post, 1" height | Newport Corp. | PS-1 | 1 |
| 1" diameter post fork | Newport Corp. | PS-F | 1 |
| Glan-Laser Calcite Polarizer, 430-700nm | Newport Corp. | 10GL08AR.14 | 1 |
| Polarizer Rotation Mount | Newport Corp. | RM25A | 1 |
| ¼" spacer for 1" diameter post | Newport Corp. | PS-0.25 | 1 |
| ½" height, 1"diameter post | Newport Corp. | PS-0.5 | 1 |
| Fork, 1" diameter post | Newport Corp. | PS-F | 1 |
| Beam Dump | Newport Corp. | PL15 | 1 |
| Microscope Objective Lens Mount | Newport Corp. | LH-OBJ1 | 1 |
| 1" diameter post, 1" height | Newport Corp. | PS-1 | 1 |
| 1" diameter post fork | Newport Corp. | PS-F | 1 |
| High-Energy Nd:YAG Laser Mirror, 25.4 mm Diameter, 45°, 532 nm | Newport Corp. | 10Q20HE.2 | 4 |
| SUPREMA Optical Mount, 1.0 inch diameter, clearance mounting hole | Newport Corp. | SN100C-F | 2 |
| High Precision Knob Adjustment Screw, 12.7mm travel, 100TPI | Newport Corp. | AJS100-0.5K | 4 |
| Thread adaptor, ¼-20 male, 8-32 female | Newport Corp. | SS-1-B | 2 |
| Rod Clamp for 1.5 inch diameter rod | Newport Corp. | 340-RC | 2 |
| Rod, 14 inch (35.5 cm) tall | Newport Corp. | 40 | 1 |
| Rail carrier for X26, square 40mm length | Newport Corp. | CN26-40 | 4 |
| Steel Rail, 384mm (15") length | Newport Corp. | X26-384 | 1 |
| Rod Platform for 1.5 inch diameter rod | Newport Corp. | 300-P | 2 |
| Rod, 14 inch (35.5 cm) tall | Newport Corp. | 40 | 2 |
| Plano-Concave Lens, 12.7mm diameter, -25mm EFL, 430-700nm | Newport Corp. | KPC025AR.14 | 2 |
| Plano-Convex Lens, 25.4mm diameter, 50.2mm EFL, 430-700nm | Newport Corp. | KPX082AR.14 | 1 |
| Plano-Convex Lens, 25.4mm diameter, 62.9mm EFL, 430-700nm | Newport Corp. | KPX085AR.14 | 1 |
| Fixed Lens Mount, 0.5" diameter, 1.0" Axis height | Newport Corp. | LH-0.5 | 2 |
| Fixed Lens Mount, 1.0" diameter, 1.0" Axis height | Newport Corp. | LH-1 | 2 |
| Microspheres 0.1um | Polysciences, Inc. | 00876 | |
| Agarose | Research Products International Corp. | A20090 | EEO matters |
| Muscimol | Sigma-Aldrich | M1523 |
References
- Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway. Science. 323, 802-806 (2009).
- Steinmeyer, J. D. Construction of a femtosecond laser microsurgery system. Nature protocols. 5, 395-407 (2010).
- Wu, Z. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching. Proc Natl Acad. 104, 15132-15137 (2007).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature protocols. 5, 1888-1902 (2010).
- Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. J. Microsc. 234, 1-8 (2009).
- Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Physical review letters. 99, 158104-158104 (2007).
- Venugopalan, V., Guerra, A. 3rd, Nahen, K., Vogel, A. Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation. Physical review letters. 88, 078103-078103 (2002).
- Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans. Opt Express. 16, 5963-5963 (2008).
- O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), e1129-e1129 (2009).
- Tsai, P. S. Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 90-99 (2009).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30-30 (2006).
- Shen, N. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor. Mech. Chem. Biosyst. 2, 17-25 (2005).
- Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Opt. Express. 16, 9884-9894 (2008).
- Rohde, C. B., Yanik, M. F. Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates. Nat. Commun. 2, 271-271 (2011).
