Summary
Laser axotomy efterfulgt af time-lapse imaging er en følsom måde at analysere effekten af mutationer i
Abstract
Laser axotomy efterfulgt af time-lapse mikroskopi er et følsomt assay for Axon regenerering fænotyper i C. elegans 1. Den største vanskelighed i denne test er den oplevede omkostninger ($ 25-100K) og teknisk ekspertise, der kræves for at gennemføre en laser ablation-system 2,3. Dog kan solid state puls lasere med beskedne omkostninger (<$ 10K) giver robuste ydeevne til laser ablation i transparente præparater, hvor målet axoner er "tæt" på vævet overflade. Konstruktion og tilpasning af et system kan ske på en dag. Den optiske bane, som lyset fra fokuseret kondensatoren til ablation laser giver en bekvem tilpasning guide. En mellemliggende modul med alle fjernede optik kan blive dedikeret til ablation laser og forsikrer at ingen optiske elementer, der behøver at være flyttet i løbet af en laser-ablation session. En dichroic i de mellemliggende modulet giver mulighed for samtidig billedbehandling og laser ablation. Centrering laserstrålen to den udgående stråle fra den fokuserede mikroskopet kondensator linse guider den indledende tilpasning af systemet. En række af linser er vant til stand og udvide laserstrålen at udfylde bagsiden blænde af den valgte objektivlinsen. Endelig justering og test er udført med en front overflade spejlglas slide mål. Laser magt er justeret til at give en mindstestørrelse ablation stedet (<1um). Det ablation spot er centreret med fine justeringer af de sidste kinematically monteret spejl til trådkors fastsat i billedbehandling vinduet. Laser strøm til axotomy vil være ca 10 gange højere end nødvendigt for det minimale ablation spot på målet dias (dette kan variere med det mål, du bruger). Orme kan blive stående til laser axotomy og time-lapse imaging ved montering på agarose puder (eller i mikrofluide kamre 4). Agarose puder er nemt lavet med 10% agarose i balanceret saltvand smeltes i en mikrobølgeovn. En dråbe smeltet agarose er placeret på en glasplade og fladtrykte med en andenobjektglas i en pude cirka 200 um tyk (et enkelt lag af tid tape på tilstødende slides bruges som spacer). En "Sharpie" cap bruges til at skære en uniformeret diameter cirkulære pad på 13mm. Bedøvelse (1ul Muscimol 20mm) og Mikrokugler (Chris Fang-Yen personlig kommunikation) (1ul 2,65% Polystyren 0,1 um i vand) er føjet til midten af puden fulgt med 3-5 orme orienteret, så de ligger på deres venstre side. Et dækglas finder anvendelse, og derefter Vaseline bruges til at forsegle dækglasset og forhindre fordampning af prøven.
Protocol
1. Opførelse af en laser ablation-system
Brug laser beskyttelsesbriller og anvende god lasersikkerhed praksis i den indledende tilpasning. Aldrig ser gennem okularer, når laseren er tændt.
- Arranger komponenterne på breadboard som vist i Fig. 1 (se også eksempel 2). Bolt ned laser (med riser plade, hvis det er nødvendigt), periskop indlæg, og det forhøjede jernbane understøtter.
- Placer din mikroskop for at tilpasse sig jernbane-aksen. Juster med transmitteret lys stråle fra mikroskopet kondensator linse. Juster skinnen højden (brug et niveau) og position med en justerbar blænde eller en linse fastgjort til skinnen. Blænden eller objektivet skal sidde i begge ender af skinnen til kondensatoren stråle. Lab-stik kan hjælpe med jernbane højdejustering.
- Juster Glan-Thompson polarisator og halv-bølge plade til laserstrålen. Du behøver ikke laseren på at gøre denne tilpasning. Den bEAM bare nødt til at gå gennem både uden at ramme kanterne. Drej polarisator at give en praktisk orientering og position for strålen dump (fig. 1). Du vil rotere halve bølger pladen til at justere laser magt. Fastgør komponenter til breadboard.
- Tænd for laseren, skal du indstille pulsfrekvens til 100, kontinuerlig tilstand og reducere strømforbruget til et minimum ved hjælp af halvbølge plade. Brug en Post-It note eller linse papir til at visualisere laserstrålen.
- Justere og fastsætte kinematically monteret spejle i rækkefølge fra laser til at bringe den strålen op til det spejl, der er monteret for enden af det forhøjede jernbane. Laserstrålen bør tilpasses nogenlunde til midten af spejle. Spejlene skal være orienteret omkring 45 grader til laserstrålen akse (fig. 1).
- Groft justere kinematically monteret spejl på toppen af periskopet, og for enden af jernbanerne at tilpasse laserstrålen til midten af det lys stråle fra mikroskop. Både laserstrålen og tHan overføres lysstråle fra mikroskop kan samtidigt visualiseres ved at indsætte papiret i strålegangen. Sørg for, at alle ND filtre og åbninger i de mellemliggende modulet er ude eller helt åben.
- Fint justere laserstrålen til midten af det lys stråle med de fine justeringer på toppen periskopet og jernbane spejle. Hold papiret tæt på jernbane spejlet og justere laserstrålen til midten af det lys stråle med den øverste periskop spejlet. Hold papiret nær mikroskopet havnen og justere laserstrålen til midten af det lys stråle med jernbane spejlet justeringer (fig.2).
- Placer en Post-It note i strålegangen mellem de justerede kondensatoren linsen og det åbne mål tårnet. Du bør se det lys stråle med de mindre laserstrålen nær centrum. Brug den fine justeringer på skinnen spejlet for at centrere laserstrålen. Fix mikroskopet på plads med klemmer.
Trin 10,9-1,12 er valgfri, men det er nemt og nyttigt at vurdere tilpasningen og laser-ablation, før du tilføjer i strålen ekspanderende linser.
- Sluk for laseren og engagere den mekaniske sikkerhed udløseren. Drej 50% dichroic ud af strålegangen. Selv om ingen direkte laserlys vil gå til okularer, kan det reflekterede lys være ganske intens. Mount målet slide for den fine justering og billede med 60X olie mål. Fokus på ridser på diaset. Læg i ND4 og ND8 filter i mellemliggende modul.
- Billede målet slide med din CLSM, Spinning disk, eller CCD-kamera system. Drej 50% dichroic i laser stien. Fra dette punkt, bør du aldrig ser gennem okularer mens ablation laseren er tændt. Tænd for ablation laser og indstil tilstanden til udløst, frekvens til 100, og puls nummer til 10. Sørg for, at strømmen er stadig sat til minimum med den halve bølge plade og derefter åbne den mekaniske sikkerhed udløseren. Du kan simultaneousnedigt billede og bruge ablation laser.
- Mens imaging målet slide, udløse ablation laser. Check målet slide for en ablation spot 1-10 um i diameter. Sekventielt fjerner ND-filtre, indtil en ablation stedet er set. Juster ablation stedet til midten af billedet med skinnen spejlet. Vil du ønsker at tilføje tilbage ND filter til at have plads til fint øge laser magten med halvbølge plade til at give et <1 UM ablation stedet. Billede til 0,2 UM / pixel eller derunder, og finjustere ablation stedet til billedet centrum (position 256.256 med 512x512 billede).
- Kontroller dybde fokus og akse laserstrålen. Fokus op og ned 1-2 UM og kontrollere ablation position og ablation spot størrelse. Hvis laserstrålen aksialt er tilpasset den ablation stedet vil ikke flytte. Den ubetinget laserstråle vil distribuere magt over flere um (ca 3-5 um fra top til bund i fokus).
2. Tilføj linser at udvide laserstråle til at fylde det mål tilbageblænde og justerer konvergens for at kontrollere fokus
- Dette system bruger dobbelt galilæiske stråle ekspandere for at udvide laserstrålen at udfylde bagsiden blænde af målet (10 mm). Monter de 4 linser til luftfartsselskaber og vedhæfte dem til skinnen (L1f1 + L2f2 og L3f1 '+ L4f2'). Indstil positioner, således at alle linser er på samme optiske akse og præcist vinkelret på laserstrålen (fig. 2).
- Tænd laseren og juster det til mindste magt og kontinuerlig tilstand. Groft justere lyshøjden gennem hver linse med papir for at se laserstrålen og sendes lysstrålen fra mikroskop kondensator. Sluk og lukker laseren.
- Fjern klemmer fra den ene side af mikroskopet og skub mikroskop ud af laserstrålen vej. Tænd laseren og fjerne sikkerheden lukkeren.
- Den fine justering af linser og laserstrålen kan udføres ved at se den udvidede laserstrålen på en nærliggende mur. Strålen skal udvide og kontrakten symmetrisk, når lenses flyttes. Juster de to sidste kinematically monterede spejle til at justere strålen (Fig.3).
- De tilpasset og udvidet stråle profil skal være runde og ensartet lysstyrke (Fig.3). Størrelsen og ensartethed i bjælken kan ses med en post-it note på den anslåede position af målet igen blænde.
- Strålen skal justeres til nul konvergens for uendeligt optiske systemer. Konvergens kan estimeres ved at bemærke, hvordan strålen størrelse ændres, når du flytter en post-it note længere væk fra linser. Sluk for laseren og engagere den mekaniske lukkemekanisme.
- Skub mikroskopet tilbage i laserstrålen vej ved hjælp af den faste klemmer til at definere den korrekte justering. Udskift klemmer på den frie side af mikroskop, men spænd dem ikke ned.
- Tænd laseren og fjerne sikkerheden lukkeren. Drej målet tårnet til en åben position. Placer en post-it note på scenen. Du bør se en udvidet og ensartet laserstråle centreret om det lys, bEAM fra kondensatoren (fig.4). Du kan være nødt til at centrere det ved at løsne mikroskop klemmer og omhyggeligt skubber mikroskopet.
- Engager sikkerhed udløseren, og indstil laser til at udløse tilstanden. Drej 60X målsætning på plads og billede overflade ridser på målet dias.
- Fjern sikkerhed udløseren, udløser ablation laser og justere laser strøm til den mindste ablation stedet. Den ablation stedet bør være runde og i løbet af 5-10 UM af billedet centrum.
- Centrer ablation stedet med fine justeringer af kinematically monteret jernbane spejl. Du skal iterativt justere skinne og top periskop spejl til både centrere ablation stedet og opretholde et ensartet stråle profil.
- Vurdere Z fokus i laser ved at flytte fokus systematisk op og ned i 1 um trin og udløser ablation laser. Den udvidede, afstemt, og konvergens justeret stråle skal ablate maksimalt på billedet, fokus og svagt eller slet ikke alle 1 UM ABove eller under fokus (fig. 5).
- Juster Z fokus for den udvidede stråle ved at flytte linsen L3 af de Galileiske teleskopet (fig.2).
3. Laser axotomy og time-lapse mikroskopi af axon regenerering
- Mikroovn 10% Agarose (RPI Molekylær Biologi Grade EEO 0,1 A20090) i balanceret saltvand indtil fuldstændig smeltet. Set på en varm tallerken for at holde det smeltede under brug for montering.
- En dråbe smeltet agarose er placeret på en glasplade og fladtrykte med en anden objektglas i en pude cirka 200 um tyk (et enkelt lag af tid tape på tilstødende slides bruges som spacer).
- En "Sharpie" markør cap bruges til at skære en uniformeret diameter cirkulære pad på 13mm.
- Bedøvelse (1ul Muscimol 20mm) og Mikrokugler (Chris Fang-Yen, personlig kommunikation) (1ul 2,65% Polystyren 0,1 um i vand) er føjet til midten af puden fulgt med 3-5 orme orienteret, så de ligger på deres venstre side . Et dækglas finder anvendelse, og derefter VaselIne bruges til at forsegle dækglasset og forhindre fordampning af prøven (fig. 6).
- Det ablation laseren er justeret til et kryds, som beskrevet ovenfor, i begyndelsen af hver session. Engager Lasersikkerhed lukkeren.
- Fjern laserjusteringssystem målet og billede en monteret voksne orm med en passende fluorescerende markør i målet neuroner. Billede axoner på et tilsvarende forstørrelse (0,2 UM / pixel eller højere forstørrelse) og position under sigtekornet (fig. 7).
- Åbn laser sikkerhed lukker og udløse ablation laser, mens billeddannelse. Vurdere Axon efter udløser laser og langsomt øge laser strøm, indtil Axon skæres. Du skal bruge ca 10X mere laser magt til at skære axoner end at danne en ablation sted på tilpasning målet slide (ca. 1uJ / ns puls). Vi typisk skæres med 100 pulser på 2,5 kHz og magt sat til ca 0.27mW (gennemsnitlig effekt målt ved prøven med sammenhængende FieldMaxII power meter og laser indstillet til kontinuerlig ved 2500 Hz). Det ablationlasereffekten indstilling vil være i overensstemmelse til skæring af axoner i fremtidige eksperimenter (fig. 7).
- Et succesfuldt cut Axon vil vise en pause på omkring 0,5-1 um uden tab af lysstyrke i de to snit ender (fig. 7). Et stort tab af lysstyrke eller et stort hul (2-10 UM) ofte betegner omfattende skader ud over de Axon af en kavitation boble. Den proksimale og distale axoner vil adskille og form tilbagetrækning pærer i løbet af de næste 30 minutter (fig. 8 og Film).
- Afbalancere din monteret orme med dit mikroskop scenen i 30 minutter, før du starter din tid bortfalder optagelse. Dette vil minimere afdrift på grund af temperaturforskelle og agarose sammentrækning.
- ) Time-lapse imaging parametre er sat op ved hjælp af imaging software forbundet med dit system. Vi typisk billede 10-20 Z trin (1um/step) på 0,1-0,2 UM / pixel ved hjælp af forstærkning, pinhole, scan hastighed, og billedbehandling laser strømindstillinger at minimere eksponeringen og samtidig give den ønskede rumlige opløsning. Sampling intervaller er typiskely 1-5 minutter over 15 timer afhængig af den ønskede tidsmæssige opløsning (fig. 8 og Film).
- Time-lapse billedet data er konverteret til film ved hjælp af NIS Elements eller ImageJ.
4. Repræsentative resultater:
Laser axotomy at bruge dette system er en pålidelig og rutine. Resultaterne er vist i figur 7 er typiske. Time-lapse billeder af Axon regenerering er meget robust ved hjælp af denne protokol. Vi rutinemæssigt snit og billede op til 5 axoner i 5 forskellige orme på et enkelt dias ved hjælp af et motoriseret scene. Den eneste begrænsning er den tid det tager at indsamle billeder af hver enkelt Axon, fx hvis det tager 20 sekunder at hente en stak for en Axon så i det højeste, du kan prøve 9 axoner (9 stacks), hvis du prøver hver 180 sekunder. Eksemplet er vist i figur 8 og 9 er en god repræsentant resultat. Omkring 10% af forsøgene giver resultater af denne kvalitet. De resterende eksperimenter levere gode data på gendannelsen fænotype, men er æstetisk unappealING på grund af små rysten bevægelser af ormen, der normalt starter efter 5-8 timer af immobilisering.
Figur 1 laser ablation System. De 532 nm Nd: Yag laser er monteret på en riser plade til at bringe den til højden af de andre komponenter og boltet fast til breadboard. (Optisk isolator er valgfrit og sandsynligvis ikke nødvendigt). Den Glan-Thompson polarisator og halvbølge plade bruges til fint styre lasereffekten. De er i fint kalibreret rotation mounts. Vær forsigtig indstilling strålen dump. Hjørnet spejl dirigerer laserstrålen til den lavere periskop spejl. Den øverste periskopet spejl leder strålen til jernbane spejlet. Skinnen er monteret på to stang understøttede platforme. Dual galilæiske linser er knyttet til glideskinne mounts. Læg mærke til den ekstra mellemliggende modul dedikeret til ablation laser. Systemet kan gøres mere kompakt ved at fjerne den optiske IsolaTor og hjørnet spejlet, og repositionering laser, Glan-Thompson polarisator og halv-bølge plade til bagkanten af breadboard.
Figur 2 Dual galilæiske Conditioning linser er brugt til at udvide de 300 um TEMoo laserstråle til et nul konvergens ensartet 10 mm størrelse. En lab Jack er placeret under en af de platforme holder skinnen. Dette hjælper med at justere skinnen højden under justeringen trin. Groft justere skinnen højden ved at montere L1 linsen til jernbane og ved hjælp af kondensatoren stråle som en tilpasning guide. Juster jernbane, så kondensatoren strålen justeres til midten af linsen i begge ender af skinnen. Dette vil sikre skinnen er justeret parallelt med den optiske akse af mikroskopet. Det kan være nødvendigt først at justere mikroskop til at matche den optiske akse af skinnen. Brug klemmer til at fastsætte placeringen af mikroskop (se fig. 1). Fjern the kører på skinner linse. Nu justere laserstrålen til midten af kondensatoren stråle i begge ender af skinnen. Et papir i strålegangen er en bekvem måde at se begge bjælker samtidigt. Brug den øverste periskop spejlet for at justere laserstrålen til kondensatoren stråle tæt på jernbane-monterede spejl. Brug skinne monteret spejlet for at justere laserstrålen til kondensatoren stråle mod den fjerneste ende af skinnen (tættest på mikroskop). Monter nu alle fire linser til skinnen som vist i figuren. Længden af skinnen, brændvidde objektiver, og objektivet ordninger vil variere afhængigt af din mikroskop og fysisk sat op. Kritiske parametre er laserstrålen diameter og størrelsen af ryggen blænde af den valgte målsætning. Infinity optiske systemer vil fokusere en perfekt parallel laserstråle (nul konvergens). Afstand mellem L1 og L2 skal være summen af de linser brændvidder, f1 + f2, og afstanden mellem L3 og L4 skal tilsvarende være f1 '+ F2'. Afstanden mellem the dual Galilæer par er ikke afgørende. Placering af L3 kan fint justeres til at styre strålen konvergens; <1mm justeringer vil være behov for at justere fokus for laser til billedet fokus. Vær sikker på at fjerne alle objektiver, filtre, åbninger, osv. fra den mellemliggende modul, der kan være i strålegangen (eller være klar over, hvad de gør og justere dit system i overensstemmelse hermed).
Figur 3 Justering af laserstrålen gennem den dobbelte galilæiske linser. Fjern mikroskop klemmer fra den ene side af mikroskopet, så mikroskopet kan blive flyttet ud af strålegangen, men de resterende klemmer vil gøre det muligt mikroskop for at være netop omplaceres. Tænk laser sikkerhed. Sørg for, lasereffekten er justeret til et minimum med Glan-Thompson polarisator. Tænd laseren og se laserstrålen mønster på væggen. Du kan finde et papir klæbet fast på væggen er med til at se laserspot. Systematisk justere placeringen af linser til at få en fornemmelse for, hvad de gør for at strålen størrelse og udseende. Du bør se noget, der ligner panel A, hvor en intens stedet er excentrisk placeret i en lysdæmper profil. Brug den kører på skinner, spejl til at justere den intense stedet til centrum som vist i panelet B. Brug nu den øverste periskop monteret spejl til at give en ensartet perifer profil. Hvis alt er justeret korrekt, skal du nu finde, at flytte linser får strålen til at udvide sig og trække symmetrisk. Flyt linser tilbage til udgangspunkter som vist i figur 2. Nu opsnappe strålen på afstand af målet igen blænde. Det bør være cirkulær, i hvert fald stor nok til at fylde din ryg blænde, og af en ensartet lysstyrke. Det er OK, hvis det er større, så længe du har tilstrækkelig laser strøm til din ablations. Evaluer konvergens ved at sammenligne strålediameter på afstand af målet tilbage blænde og væggen. Beam diameter skalvære identisk for et nul konvergens stråle. Skala bar er 10mm.
Figur 4 Justering af den udvidede laserstråle til kondensatoren stråle. Shutter laseren og flytte mikroskopet tilbage til stien af laserstrålen ved hjælp af klemmer angår tilpasning stopper. Tænd, justere og fokusere kondensatoren strålen efter en objektiv linse. Tape papiret over okularer for at forhindre nogen i at se den intense afspejles laserlys. Drej målet tårnet til en åben position. Læg et stykke papir på scenen til occlude kondensatoren stråle. Drej laseren til kontinuerlig drift og fjerne mekanisk sikkerhed udløseren. Du skulle se nogle laser-lys, der kommer om mikroskopet. Løsn mikroskop klemmer og forsigtigt skubbe mikroskop for at justere laserstrålen med kondensatoren stråle. Laserstrålen skal være runde og af ensartet lysstyrke. Det er til tider nyttigt at adjust det kører på skinner, linser. Du bør være i stand til at udvide sig og trække laserstrålen ensartet, hvis justeringen er korrekt. Du kan centrere kontrakt laserstråle til det minimum, centreret kondensatoren stråle med de kører på skinner, spejl og derefter udvide det til den ønskede størrelse. Når du justere placeringen af de aftalte stråle med jernbane spejlet, bliver du nødt til at justere topmonteret periskop spejl til at opretholde et ensartet lysstyrke af den udvidede stråle. Hvis du ikke kan få en cirkulær centreret laserstråle, så bliver du nødt til at gå tilbage gennem de tidligere tilpasning trin.
Figur 5 Centrér ablation stedet og justere laserstrålen konvergens for optimal fokus. Sluk og lukker laseren. Fjern papiret, og montere spejlet målet dias (du kan også bruge permanent markør blæk på et dækglas som et mål 2). Billede ridser på spejlet overflade med de 60X 1.4na olie objektiv) Nu billede af overfladen med en konfokal eller CCD. Må ikke se gennem okularer, mens laseren er tændt. Tænd og unshutter laseren. Indstil laser til at udløse tilstand, laveste strømforbrug, og 100 Hz. Trigger omkring 10 pulser. Du bør se en ablation stedet af 1-5 um i diameter inden for 10 UM for centrum af visningen. Hvis du ikke kan se en ablation stedet kan du øge laser magt i 5-10% trin. Når du identificere en ablation stedet, center det til synsfelt. Sæt kryds hårene ved 256, 256 koordinater, hvis visning 512x512 billede. Hvis du justerer laserpunkt til midten, så vil det ikke ændre position med zoom. Brug skinne monteret spejlet for at flytte ablation stedet til centrum trådkorset. Genvurdere ensartethed af laserstrålen ved at se på strålen med målsætningen fjernet som beskrevet ovenfor i Figur 4. Juster stråle ensartethed med toppen periskop monteret spejl. Gentag evaluering af ablation spotpositionen. Dette er en iterativ process, der bør gentages, indtil ablation stedet er centreret, og den udvidede strålen er ensartet. Hvis det gøres korrekt ablation stedet vil være cirkulær, som ses i ablation stedet hos Focus i figuren. Næste evaluere fokus laserstråle i Z-aksen. Trigger laseren at producere en ablation plet på omkring 1 UM i midten. Nu skal du skubbe omkring 5 UM sideværts og fokus 1 UM under overfladen af målet dias. Trigger laseren med den samme laser indstillinger som du brugte for første ablation stedet. Gentag efter fokusering 1 UM over overfladen af målet dias. Hvis laserstrålen er fokuseret på det billede, fokus, så skal du se et mønster svarende til den, er vist i denne figur. Den største ablation stedet skal svare til billedet fokus og ablation pletter over og under fokus bør få mindre symmetrisk. Juster linse L3 for at justere fokus fly. Flytning linse L3 væk fra mikroskop vil gøre strålen mere konvergente og ablation stedet vil flytte tættere påmålsætningen. Lille <1mm justeringer vil være behov for tæt fokus. Du er nu klar til at skære axoner. Skala bar er 1 um.
Figur 6 Montering orme til laser axotomy og time-lapse billeddannelse. Agarose 10% i saltvand er opvarmet indtil fuldstændig smeltet. En lille dråbe er placeret på et glas objektglas og derefter fladtrykt med et andet dias til at danne en flad pude. Tykkelsen af puden, er fastsat af tape på to tilstødende lysbilleder. Puden, er lov til at sætte i ca 1 minut og dias er adskilt. En "Sharpie" top bruges som en cookie cutter til at danne en ensartet størrelse pad på ca 13mm. 1 ul af 10mM Muscimol og 1 ul af mikrosfærer føjes til midten af puden (Fang-Yen personlig kommunikation). Orme er føjet til de 2 ul drop og orienteret, før du sætter på dækglas. Vaseline er derefter anvendes fra en sprøjte (20-25 GA. Nål) til kanten af dækglasset at forsegle den.
Figur 7 Typiske resultater af en laser axotomy i C. elegans. I A kan du se den intakte Axon kort før og efter laser axotomy. Forskellen er normalt omkring 0,5-1um. B viser laser axotomy af en axon uden at beskadige en nærliggende Axon omkring 1 um væk. Laser var sat til omkring 10% effekt (0,3 mW gennemsnit på 2500 Hz), og 100 pulser. Skala bar er 5 um.
Figur 8. Typiske vildtype L4 regenerering. Dette er en tidsserie, der viser ablation og time-lapse optagelse af Axon regenerering. Kort efter laser axotomy ved 0 minutter kan du se tilbagetrækning pære. Med 138 minutter tilbagetrækning pæren har trukket sig tilbage til sin fjerneste omfang, og nu er begyndt at remodel. Sporadiske membran fremspring (mircospikes eller filopodia) kan ses langs Axon aksel (pile 138 og 324). Denhøjre stub udvider en velformet kompakt vækst kegle på 360 minutter. På 414 minutter begge stubbe har udvidet vækst kegler. Den oprindelige embryonale-lignende vækst kegler bliver dystrofe som de strækker sig mod den dorsale nerve ledning (414, 519 og 597 minutter). Den dystrofe vækst kogler stall korte af det dorsale nerve ledning (960 minutter). Pilespidser påpege proximale stump og vækst kegler. Pile påpege membran fremspring langs proksimale Axon akslen. Skala bar 20um.
Movie 1. Movie af vildtype Axon regenerering. Denne film går langs med den tid punkter vist i figur 8. Worms blev monteret som beskrevet i protokollen, og axoner blev filmede hvert tredje minut i ca 10 timer. Z stakke (20 X 1um) blev truffet på hvert tidspunkt og fusionerede til enkelte billeder ved en maksimal projektion algoritme (NIS Elements). Klik her for at se filmen.
Discussion
Der er flere gode diskussioner af laser mikrokirurgi med forskellige lasersystemer 3,5-11. Femtosekund IR-lasere er "gold standard" for subcellulære laser ablation 12 og praktisk, hvis forbundet med en imaging facilitet, men de er ofte for dyre for de enkelte brugere. Hvis du har brug for en femtosekund IR-laser for imaging din prøve på grund af dybden af billeddata, så vil du sandsynligvis brug for én til laser axotomy. Transparent væv med target axoner inden for 30-50 um af overfladen er sandsynligvis mulig med blå og grønne puls lasere i de 20 UJ / puls interval målrettet gennem en høj na fordybelse linse. Der vil være flere følgeskaderne med nano og pico sekunder lasere sammenlignet med femtosekund laser, især da dybden af målet Axon stiger. C. elegans er gennemsigtig og alle axoner er indenfor 20-30 um af overfladen. Vi rutinemæssigt skåret motoriske axoner, der er inden for 5 UM af overfladen. Vi har også let skåret økseons inden den nerve ring, der er omkring 20 UM fra neglebånd overfladen. Vi har fundet grænsen for at skære axoner at være omkring 30-50 um gennem diameteren af en voksen orm. Det er sandsynligt, at laser-ablation systemet beskrives her, vil fungere godt med mange forskellige præparater, som passer til kriterierne om gennemsigtighed og dybde af mål axoner. Men det er en smule overraskende i betragtning af den teoretiske fordele ved femtosekund IR-lasere, som nano-og picosekund 355 nm og 532 nm laser udføre så godt for laser axotomy i C. elegans 6,13. Vi ser ingen forskelle i Axon regenerering som reaktion på laser axotomy med nanosekund 440 nm, nanosekund 532 nm, og femtosekund IR-lasere.
Solid state 355 nm UV-lasere er omkring samme pris som de 532 nm diode pumpes passivt Q-Switched solid state laser, men det kræver enten højere magter eller optik, der effektivt videregive disse kortere bølgelængder. De fleste optik er designet til at klare sig godt med synlig 400 -700 nm lys. 355 nm lasere ville give nogle fordele 6 såsom reduceret plasma-tærskel, mindre spot størrelse, og en lang aflevering dichroic ville effektivt direkte 100% af ablation laser til målet og tillade samtidige billeder af GFP uden tab af prøve signal. Blå 440 nm lasere ville bevare fordelene ved at arbejde med et synligt lys laser (gode resultater med standard optik og sikkerhed). Desværre er prisen for en DPP Q-switched solid state 440 nm laser er 3 gange prisen for en 355nm eller 532 nm laser af lignende effekt på dette tidspunkt. Hvis vi skulle designe et nyt system til C. elegans, hvor målet dybde er minimal, vil vi vælge en UV gennemsigtig linse (koste omkring $ 3.000 for en 40X 1.3na olie-objektiv med 50-70% transmission på 355nm) og en 355 nm laser producerer 5-10 UJ / puls ved 1 -20 kHz.
Axon ablation menes at skyldes plasma dannelse. Kortere impulser vil producere plasma tærskler på et lavere el-og plasma-volumen w dårligt være mindre 6. Målet er at producere den mindste og korteste levetid plasma ved at justere pulsen energi til det laveste strømforbrug. Større langlivede plasmaer vil generere kavitation bobler, der skader omkringliggende celler. Vi har generelt konstateret, at ablation bruger omkring 50-100 pulser på højeste frekvens (dvs. 2.5kHz) giver de bedste resultater. Dette tyder på, at skaden kan gradvist integreret over en række impulser til bedre at kontrollere omfanget af skader. Den laser ablation system, der beskrives her, er meget tilgivende, hvis strålen er justeret og udvidet præcist. Vi starter skære axoner hos voksne orme på 10% laser effekt (gennemsnit på 0,3 mW, målt ved 2500 Hz, og anslået 1 UJ / puls) og kan skæres med begrænset lokal skade gennem 14% effekt. Du kan observere store områder med skader fra 15 til 39% laser magt, men kun over 40% effekt (ca. 1 mW gennemsnit målt ved 2500 Hz) gøre ormene eksplodere på grund af store kavitation bobler og skader på orme-neglebånd.
e_content "> Den Steinmeyer et al. 2010 2 papiret er en fremragende ressource for at konstruere en laser ablation system. Leon Avery har også en dejlig praktisk beskrivelse af en laser ablation system baseret på en billig N2 gas 337 nm laser, og han giver nogle store praktiske rådgivning (elegans.swmed.edu / Worm_labs / Avery /). Når designe dit eget system, bør du først tale med din mikroskop repræsentant for at afgøre, hvorledes den vil øremærke ablation laser til mikroskopet mål. Din mikroskop skal monteres på et vibrationsisolering tabel (Newport, TMI, Thor). En breadboard top er optimal, men et massivt stål toppen kan stadig bruges med magnetisk svejseborde. En dedikeret mellemliggende modul på en opretstående anvendelsesområde er rart, fordi alle optiske elementer kan blive siddende på plads. Men det kan være billigere og mere bekvemt at bruge et kamera port (inverteret) eller en "combiner" vedhæftet en epi-fluorescerende port. Du skal kende størrelsen af ryggen blænde og transmittans (på A blation laser bølgelængde) i objektivlinsen du agter at bruge. Når du beslutter dig for en laser (f.eks Crylas, vrimle, Crystal, eller CRC), bør du kontakte Thor eller Newport for at få hjælp til at vælge den korrekte optiske elementer, hardware og sikkerhedsudstyr. Vi besluttede på en dual galilæiske beam expander for at spare plads, men en enklere Kepler-expander er en mulighed (f2/f1 = ekspansion faktor). En brugerdefineret beam expander vil være den billigste, men Newport, Thor, og flere af de laser producenter tilbyder fremragende kvalitet kommercielle stråle ekspandere. Nogle laser producenter tilbyder også manuel og elektronisk styrede dæmpeled, der kan være omkostningseffektive og pladsbesparende, men ikke lige så alsidig som de Glan-Thompson polarisator og halvdelen bølge plade. Du bliver også nødt til at beslutte, hvordan man styrer laseren. Du kan designe en LabView baseret controller, kan du bruge en kommerciel TTL generator, eller software, som laser virksomheden. Drøft muligheder med den specifikke laser producenten. telt "> Vi har fremlagt en liste over den hardware, vi har kun bruges som en generel vejledning. Systemet er beskrevet her koste omkring $ 15,000, når tilføjet til vores eksisterende imaging system. Din lokale Fysik afdeling vil ofte have nogen er villige til at give en praktisk introduktion til sikkert at arbejde med fri stråle lasere.Alternative metoder til immobilisering og tid bortfalder billeddannelse af C. elegans er for nylig blevet beskrevet. 14
Fejlfinding
Den mest vanskelige og kritiske skridt er opretning af centreret udvidet strålen til den optiske akse af mikroskopet. Når du har strålen centreret og udvidet gennem de Galileiske linser du skal arbejde hårdt for at få den tilpasset til inden for 5 UM af mikroskopet optiske akse, FØR du bruger styretøjet spejle til den endelige tilpasning til centrum. Overdreven brug af styre-spejle for at justere strålen til mikroskop vil flytte den off axis gennem strålenexpander. BRUG yderste forsigtighed kan du dæmpe laserstrålen med de relevante ND filteret og direkte se laserstrålen profil på en reflekterende mål (forreste overflade spejl). Du kan forsigtigt skubbe mikroskop til præcist at centrere bjælke i 60X målet synsfelt (hvis det ikke kan centreres i op / ned interval, du har brug for at justere skinnen højde). Strålen profil kan bruges til præcist at justere mikroskopet optiske akse for at give en centreret bom, der er cirkulær og "blusser" symmetrisk. En asymmetrisk flare er et tegn på, at mikroskopet aksen ikke er perfekt afstemt (eller skinnen er ikke niveau). Endelig bør du justere L3 og se et jævnt og symmetrisk udvidelse og sammentrækning af bjælken. Fokus mikroskopet præcist på målet overfladen og derefter justere L3 til at fokusere laserstrålen til den mindste plet. Du skal nu finde, at laserstrålen er inden for 5 UM i midten, når filmede via LSCM eller CCD-system og ablation stedet er inden for1um af Z fokus.
Hvis du opdager, at du er "sprænge" orme eller konstant generere store kavitation bobler til at skære axoner dit problem er sandsynligvis den fine tilpasning af ablation laser. Sørg for minimum (<500 Nm) ablation stedet er lokaliseret til Z fokus (justering konvergens med L3 objektiv) og til XY betroede stedet (juster med sidste kinematically monteret spejl).
Målretning axoner tættere på overfladen vil kræve mindre laser strøm. Ligeledes vil mindre dyr (L1 og L2) kræver mindre laser strøm til axotomy i forhold til at målrette den samme axoner hos voksne.
Hvis dine vilde type axoner ikke regenerere eller axoner blegemiddel, bør du prøve at reducere billedbehandling laser magt eller nedsætte samplingfrekvens. Hvis din orme dø eller blive syg forsøge at reducere procent Agarose i 1% trin. Sørg for at du ikke bevæger dækglasset efter montering orme, da dette ofte vil få dem til at dø, når du bruger high prejen agarose og mikrosfærer.
Hvis din orme briste eller dør under en time-lapse session det skyldes: 1. Procentdel agarose er for høj. 2. Skader på neglebånd ved ablation laser. 3. Flytning af dækglasset efter montering. Hvis skader på neglebånd er skyld i ulykken, vil kun påvirke monteret orme, der er blevet målrettet med ablation laser.
Hvis din orm bevæger sig for meget under en time-lapse session du prøve at øge den procentdel agarose i 0,5% trin. Sund axoner hos raske orme er altid "aktive" og vise et ensartet fluorescens. Hvis du ser et pludseligt fald i fluorescens eller aktivitet ormen er døende eller døde. Flere beaded eller fragmenteret axoner er et sikkert tegn på en døende eller døde orm.
Hvis du har problemer med at holde din axoner i fokus i hele den tid bortfalder sessionen kan der være flere forskellige problemer. Først kontrollere din stage drift ved billeddannelse en inaktiv prøve på en glasplade over 10 timerrs. Et par mikron drive kan skyldes termiske ustabilitet, men større end 5 um skyldes formentlig, at mekaniske problemer med dit mikroskop. Problemer med montering er mere almindelige. Lad din monteret orme ligevægt med din mikroskop scenen i 30 minutter, før du starter din tid bortfalder. Kontroller, at din Vaseline segl ikke udviklede lækager i løbet af din tid bortfalder session.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Denne forskning blev støttet af National Science Foundation, McKnight Endowment Fonden for Neuroscience, at Christopher og Dana Reeve Foundation og Amerisure Charitable Foundation.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
| 535 nm Laser | Crylas | FDSS532Q3 | (TEEM, Crystal, and CRC also offer comparable lasers) |
| All optics and hardware | (Thor offers comparable optics and hardware) | ||
| SUPREMA Optical Mount, 1.0-in diameter | Newport Corp. | SS100-F2KN | 2 |
| 1" diameter post, 1" height | Newport Corp. | PS-1 | 1 |
| 1" diameter post fork | Newport Corp. | PS-F | 1 |
| Achromatic Zero-Order Wavel Plate, ½ Wave Retardation, 400-700nm | Newport Corp. | 10RP52-1 | 1 |
| Rotation Stage, 1" Aperature | Newport Corp. | RSP-1T | 1 |
| 1" diameter post, 1" height | Newport Corp. | PS-1 | 1 |
| 1" diameter post fork | Newport Corp. | PS-F | 1 |
| Glan-Laser Calcite Polarizer, 430-700nm | Newport Corp. | 10GL08AR.14 | 1 |
| Polarizer Rotation Mount | Newport Corp. | RM25A | 1 |
| ¼" spacer for 1" diameter post | Newport Corp. | PS-0.25 | 1 |
| ½" height, 1"diameter post | Newport Corp. | PS-0.5 | 1 |
| Fork, 1" diameter post | Newport Corp. | PS-F | 1 |
| Beam Dump | Newport Corp. | PL15 | 1 |
| Microscope Objective Lens Mount | Newport Corp. | LH-OBJ1 | 1 |
| 1" diameter post, 1" height | Newport Corp. | PS-1 | 1 |
| 1" diameter post fork | Newport Corp. | PS-F | 1 |
| High-Energy Nd:YAG Laser Mirror, 25.4 mm Diameter, 45°, 532 nm | Newport Corp. | 10Q20HE.2 | 4 |
| SUPREMA Optical Mount, 1.0 inch diameter, clearance mounting hole | Newport Corp. | SN100C-F | 2 |
| High Precision Knob Adjustment Screw, 12.7mm travel, 100TPI | Newport Corp. | AJS100-0.5K | 4 |
| Thread adaptor, ¼-20 male, 8-32 female | Newport Corp. | SS-1-B | 2 |
| Rod Clamp for 1.5 inch diameter rod | Newport Corp. | 340-RC | 2 |
| Rod, 14 inch (35.5 cm) tall | Newport Corp. | 40 | 1 |
| Rail carrier for X26, square 40mm length | Newport Corp. | CN26-40 | 4 |
| Steel Rail, 384mm (15") length | Newport Corp. | X26-384 | 1 |
| Rod Platform for 1.5 inch diameter rod | Newport Corp. | 300-P | 2 |
| Rod, 14 inch (35.5 cm) tall | Newport Corp. | 40 | 2 |
| Plano-Concave Lens, 12.7mm diameter, -25mm EFL, 430-700nm | Newport Corp. | KPC025AR.14 | 2 |
| Plano-Convex Lens, 25.4mm diameter, 50.2mm EFL, 430-700nm | Newport Corp. | KPX082AR.14 | 1 |
| Plano-Convex Lens, 25.4mm diameter, 62.9mm EFL, 430-700nm | Newport Corp. | KPX085AR.14 | 1 |
| Fixed Lens Mount, 0.5" diameter, 1.0" Axis height | Newport Corp. | LH-0.5 | 2 |
| Fixed Lens Mount, 1.0" diameter, 1.0" Axis height | Newport Corp. | LH-1 | 2 |
| Microspheres 0.1um | Polysciences, Inc. | 00876 | |
| Agarose | Research Products International Corp. | A20090 | EEO matters |
| Muscimol | Sigma-Aldrich | M1523 |
References
- Hammarlund, M., Nix, P., Hauth, L., Jorgensen, E. M., Bastiani, M. Axon regeneration requires a conserved MAP kinase pathway. Science. 323, 802-806 (2009).
- Steinmeyer, J. D. Construction of a femtosecond laser microsurgery system. Nature protocols. 5, 395-407 (2010).
- Wu, Z. Caenorhabditis elegans neuronal regeneration is influenced by life stage, ephrin signaling, and synaptic branching. Proc Natl Acad. 104, 15132-15137 (2007).
- Gilleland, C. L., Rohde, C. B., Zeng, F., Yanik, M. F. Microfluidic immobilization of physiologically active Caenorhabditis elegans. Nature protocols. 5, 1888-1902 (2010).
- Raabe, I., Vogel, S. K., Peychl, J., Tolic-Norrelykke, I. M. Intracellular nanosurgery and cell enucleation using a picosecond laser. J. Microsc. 234, 1-8 (2009).
- Hutson, M. S., Ma, X. Plasma and cavitation dynamics during pulsed laser microsurgery in vivo. Physical review letters. 99, 158104-158104 (2007).
- Venugopalan, V., Guerra, A. 3rd, Nahen, K., Vogel, A. Role of laser-induced plasma formation in pulsed cellular microsurgery and micromanipulation. Physical review letters. 88, 078103-078103 (2002).
- Bourgeois, F., Ben-Yakar, A. Femtosecond laser nanoaxotomy properties and their effect on axonal recovery in C. elegans. Opt Express. 16, 5963-5963 (2008).
- O'Brien, G. S., Rieger, S., Martin, S. M., Cavanaugh, A. M., Portera-Cailliau, C., Sagasti, A. Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos. J. Vis. Exp. (24), e1129-e1129 (2009).
- Tsai, P. S. Plasma-mediated ablation: an optical tool for submicrometer surgery on neuronal and vascular systems. Curr. Opin. Biotechnol. 20, 90-99 (2009).
- Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation. BMC Neurosci. 7, 30-30 (2006).
- Shen, N. Ablation of cytoskeletal filaments and mitochondria in live cells using a femtosecond laser nanoscissor. Mech. Chem. Biosyst. 2, 17-25 (2005).
- Rao, G. N., Kulkarni, S. S., Koushika, S. P., Rau, K. R. In vivo nanosecond laser axotomy: cavitation dynamics and vesicle transport. Opt. Express. 16, 9884-9894 (2008).
- Rohde, C. B., Yanik, M. F. Subcellular in vivo time-lapse imaging and optical manipulation of Caenorhabditis elegans in standard multiwell plates. Nat. Commun. 2, 271-271 (2011).
