在这里,我们描述了读取和配对的单端Illumina公司的mRNA – Seq的测序基础上的T7线性RNA扩增的基因表达分析库的制备方法。该协议只需要10微克启动总RNA,并产生了高度一致库代表整个笔录。
全转录组测序的mRNA – Seq的是现在被广泛用于执行全球基因表达,突变,等位基因特异性表达,其他的全基因组分析。甚至打开的mRNA – Seq的非基因组测序的基因表达分析的大门。的mRNA – Seq的提供高灵敏度,大动态范围,并允许测量样品中的转录拷贝数。 Illumina公司的基因组分析仪进行测序一个大数目相对较短的序列(> 10 7)读取(<150 bp的)。“配对结束”的方法,其中一个单一的长读是在两个其两端测序,允许跟踪交替剪接路口插入和缺失,是有用的De Novo转录大会。
研究人员面临的主要挑战之一是数量有限的起始原料。例如,开始在激光微解剖,可收获细胞实验总RNA米AY在毫微克的措施。从这些样品中的mRNA – Seq的库的制备已被描述 1,2,但涉及显著PCR扩增,可能会引入偏差。其他RNA – seq的图书馆建设以最小的PCR扩增程序已经出版3,4,但需要启动总RNA微克金额。
在这里,我们描述的Illumina的Genome Analyzer的II平台库的准备,避免显著的PCR扩增和只需要10微克的总RNA测序的mRNA – Seq的协议。尽管这个协议已经前面描述的单端测序,它表明的情况下引进显著放大偏置定向库验证,在这里我们验证它进一步用于配对的最终协议。我们选择性地放大聚腺苷酸化的信使RNA,从开始使用总RNA,T7基于Eberwine线性扩增法,创造了“T7洛杉矶“(T7线性扩增)。扩增聚一个mRNA的是零散的,反转录和适配器结扎,以产生最后的测序库。对于读取和配对的单端运行,序列映射到人类转录组 6和规范化,使从多次运行数据可以比较,我们的报告基因表达的转录每百万为单位测量(TPM),这是一个出众的措施RPKM 比较样本7时。
1微克至2.5微克10日起的总RNA量之间的配对结束库当前的协议要求。在这里,我们目前我们对直线的T7扩增(T7LA)的方法来准备,此方法允许读取和配对的单端Illumina的测序库,并显示生成低至10纳克的总RNA库,生产数据是可比的,微创(MinAmp)放大1000倍以上的起始原料(10μg总RNA)的库。为10 ng图书馆不仅找出类似的基因总数,但也产生类似(图3a和b)的基因表达签名。此外,读取和T7LA方法产生配对的单端库是对方(图3c),这使研究人员能够比较无论从协议中作出的库产生的数据非常相似。由于这些库准备从人类胚胎干细胞的RNA,我们搜索为30个干细胞库中的特定基因,并发现,几乎所有这些基因(93-100%)发现至少10启动总RNA(图4)吴库,从而验证了我们的协议。我们相信,我们的协议将是非常有用的,为研究人员,特别是在诸如流量排序细胞或激光微解剖组织起始原料限制的情况下,。在这种情况下,我们的协议将允许从开始量大得多,因为我们的协议产生的表达谱,在至少3订单开始RNA的幅度相媲美的库生成的基因表达数据相媲美。
The authors have nothing to disclose.
这项工作是从莫格里奇研究所的研究和威斯康星大学基金会的资金支持。我们感谢克里斯塔伊士曼社论援助。
Company | Kit/Reagent | Catalog # | Special Comments |
Ambion | Fragmentation reagent | AM8740 | |
Ambion | Liner Acrylamide | AM9520 | |
Ambion | MEGAscript T7 Kit | AM1334 | |
Ambion | Non DEPC treated nuclease free water | AM9932 | |
Fermentas | dNTP set | R0181 | |
Fermentas | methylated dNTPs | R0431 | For Single Read sample prep only |
Illumina | TruSeq SR Cluster Generation kit v5 | GD-203-5001 | For Single Read sample prep only |
Illumina | TruSeq Seq Kit v5 36 cycles | FC-104-5001 | |
Illumina | Chip Seq Sample Prep Kit | IP-102-1001 | For Single Read sample prep only. Can be replaced with NEB DNA sample prep Master Mix Set 1 Cat# E6040S |
Illumina | TruSeq PE Cluster Generation kit v5 | PE-203-5001 | For paired end sample prep only |
Illumina | Paired End Sample Prep Kit | PE-102-1001 | For paired end sample prep only |
Invitrogen | 1kb plus ladder | 10787-018 | |
Invitrogen | E. coli Rnase H | 18021-014 | |
Invitrogen | Rnase Out | 10777-019 | |
Invitrogen | 2nd strand buffer 5x | 10812-014 | |
Invitrogen | E. coli DNA polymerase | 18010-017 | |
Invitrogen | E-gel SYBR safe 2% | G521802 | |
Invitrogen | Superscript III (with 5X FS buffer and 0.1M DTT) | 18080-085 | |
Invitrogen | Trizol | 12183555 | |
Invitrogen | RNA quibit assay kit | Q32852 | |
Invitrogen | dsDNA HS qubit assay kit | Q32851 | |
Invitrogen | E. coli DNA ligase | 18052-019 | |
Invitrogen | T4 DNA Polymerase | 18005-025 | |
Invitrogen | Ultra Pure Dnase Rnase water | 10977-015 | |
Invitrogen | Superscript II double stranded cDNA synthesis kit | 11917-020 | |
Invitrogen | Random Primer (invitrogen) | 48190-011 | For paired end sample prep only |
IDT | Not1Nonamer B primer | N/A | For Single Read sample prep only |
IDT | Oligo dT T7 | N/A | |
NEB | Not1 digestion kit | R0189S | For Single Read sample prep only |
Qiagen | Rneasy Minelute kit | 74204 | |
Qiagen | RNEasy Mini Kit (50) | 74104 | |
Qiagen | Gel purification kit | 28604 | |
Qiagen | Dnase set | 79254 | |
Qiagen | Rneasy MinElute kit | 74204 | |
Zymo Research | DNA clean and concentrator (250X) | D4014 |