Summary
Qui si descrive un metodo per la preparazione di entrambi i singoli letti e associato fine Illumina mRNA-Seq librerie sequenziamento per l'analisi di espressione genica basata su amplificazione lineare dell'RNA T7. Questo protocollo richiede solo 10 nanogrammi di RNA totale di partenza e genera librerie altamente coerente rappresentanza trascrizioni intero.
Abstract
Sequenziamento del trascrittoma intero mRNA-Seq è ormai ampiamente utilizzata per eseguire l'espressione genica globale, la mutazione, allele-specifica espressione e di altri genoma analisi. mRNA-Seq apre anche la porta per l'analisi dell'espressione genica di non genomi sequenziati. mRNA-Seq offre alta sensibilità, un'ampia gamma dinamica e consente di misurare numero di copie di trascrizione in un campione. Analizzatore del genoma Illumina effettua il sequenziamento di un numero elevato (> 10 7) della sequenza relativamente breve, si legge (<150 bp). Il "abbinato fine" approccio, in cui un letto singolo lungo è sequenziato ad entrambe le sue estremità, consente di seguire giunzioni di splicing alternativo , inserimenti ed eliminazioni, ed è utile per il montaggio de novo trascrittoma.
Una delle sfide principali affrontate dai ricercatori è una quantità limitata di materiale di partenza. Per esempio, in esperimenti in cui vengono raccolte le cellule con il laser micro-dissezione, disponibile a partire da RNA totale may misura in nanogrammi. Preparazione di mRNA-Seq librerie da tali campioni sono stati descritti 1, 2 ma prevede un uso intensivo di amplificazione che possono introdurre distorsioni. Altri RNA-Seq procedure di costruzione della libreria con il minimo di amplificazione sono stati pubblicati 3, 4 ma richiedono quantità microgrammo di RNA totale di partenza.
Qui descriviamo un protocollo per la piattaforma Illumina Genome Analyzer II per mRNA-Seq sequenziamento per la preparazione della libreria che evita significativi di amplificazione e richiede solo 10 nanogrammi di RNA totale. Anche se questo protocollo è stato descritto in precedenza e validato per single-end sequenziamento 5, dove è stato dimostrato che per produrre librerie direzionali, senza introdurre distorsioni significative amplificazione, qui lo abbiamo validare ulteriormente per essere utilizzato come protocollo di fine appaiati. Noi amplificare selettivamente RNA messaggeri polyadenylated l'avvio RNA totale utilizzando il metodo basato T7 amplificazione lineare Eberwine, coniato "T7LA "(T7 amplificazione lineare). Amplificato La poly-A mRNA sono frammentati, trascrizione inversa e l'adattatore legatura per produrre la sequenza finale biblioteca. Per entrambe le corse singole in lettura e associato, le sequenze vengono mappati al trascrittoma umano 6 e normalizzata in modo che dati provenienti da più esecuzioni può essere paragonato. Riportiamo la misura dell'espressione genica in unità di trascrizioni per milione (TPM), che è una misura superiore a RPKM quando si confrontano i campioni 7.
Protocol
1. Isolare RNA totale
- Aggiungere 1 ml Trizol a cellule / tessuti, e omogeneizzare con 18-22 ago garza, se necessario.
- Aggiungere 200 microlitri cloroformio, e far girare a 14.000 giri al minuto per 30 minuti a 4 ° C.
- Estrarre alto strato acquoso, aggiungere 0,5 microlitri acrilamide lineare, quindi aggiungere 500 microlitri isopropanolo. Lasciate riposare a temperatura ambiente per 20 minuti.
- Rotazione a 14.000 giri al minuto a 4 ° C, lavare a pellet con etanolo al 70%, e vuoto a secco.
- Risospendere in 1 microlitri di acqua priva di nucleasi e trasferimento in provetta da 200 microlitri PCR.
2. Preparare a doppio filamento del DNA
- Per quanto sopra 1 RNA microlitri aggiungere 1 ml di 100 mM oligo-dT-T7 fondo la trascrizione inversa (5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT -3 '), di calore a 70 ° C (blocco di calore) per 5 min e scatto raffreddare su ghiaccio.
- Aggiungere 1 microlitri di buffer 5x FS, 0,5 microlitri DTT, 0,5 mix di dNTP e 0,5 microlitri RnaseOUT microlitri (da SuperScript II kit).
- Calore a 42° C in macchina PCR per 1 minuto, quindi aggiungere 0,5 microlitri trascrittasi inversa Superscript II. Incubare per 1 ora a 42 ° C.
- Calore a 70 ° C per 10 minuti, raffreddare a 4 ° C.
- Sul ghiaccio, aggiungere il seguente alla reazione di cui sopra:
- Acqua priva di nucleasi - 22,75 microlitri
- 5X tampone Secondo aspetto - 7,5 microlitri
- dNTP mix - 0,75 microlitri
- E. coli DNA ligasi - 0,25 microlitri
- E. coli DNA polimerasi - 1 ml
- RnaseH - 0,25 microlitri
Incubare per 2 ore a 16 ° C si aggiunge 1 microlitri di DNA polimerasi T4, e incubare per altri 10 minuti a 16 ° C.
- Trasferimento a 1,5 ml di tubo Eppendorf, e aggiungere 80 microlitri di acqua.
- Aggiungere 0,5 ml di acrilamide lineare.
- Aggiungere 72 microlitri NH4OAc 3 M e 480 ml di etanolo freddo al 100%. Precipitare per 1 ora a -20 ° C.
- Rotazione a 14.000 giri al minuto a 4 ° C per 30 minuti, lavare con 1 mL di etanolo al 70%, centrifugare a 14.000 rpm per 2minuti e vuoto a secco per circa 10 minuti.
3. Amplificare poli-A dell'mRNA per la trascrizione in vitro
- Risospendere sopra cDNA in 3,5 microlitri di acqua priva di nucleasi.
- Per quanto sopra, aggiungere 1 ml ciascuno dei dNTP (totale 4 microlitri), 1 ml di tampone di reazione 10X e 1 ml di polimerasi T7, e 0,5 l di RnaseOUT dal kit Megascript.
- Incubare a 37 ° C in macchina PCR durante la notte.
- Pronto per il passo successivo. Possono essere conservati a -80 ° C.
4. Frammentazione del amplificato poli-A dell'mRNA
- Aggiungere 26 ml di acqua per reazione sopra e 4 reagente microlitri frammentazione 10x.
- Calore in macchina PCR a 70 ° C per esattamente 7 minuti.
- Aggiungere 5 ml di tampone frammentazione fermare, mettere campione sul ghiaccio.
5. RNA ripulire
- Per la reazione di cui sopra, aggiungere 60 microlitri di acqua e 350 ml di RLT tampone da RNeasy kit MinElute, e mescolare pipettando.
- Aggiungere 250 microlitri di etanolo, mescolare pipettando, e pipettare nella colonna di spin.
- Rotazione a 8000 rcf per 20 secondi.
- Lavare una volta con RPE, girare per 20 secondi, lavare la seconda volta con l'80% EtOH, spin per 2 minuti, e la colonna a secco con 5 minuti di spin.
- Eluire l'RNA in 10 microlitri di acqua priva di nucleasi.
6. sintesi di cDNA
Filamento prima sintesi per singolo biblioteca leggere:
- In un tubo di PCR, aggiungere il seguente:
- Frammentata Poly-A mRNA - 10 microlitri
- Noti Primer casuale nonamer - 1 ml
Incubare a 70 ° C per 5 minuti in termociclatore, e chill veloce sul ghiaccio. Noti Nonamer Primer (5'-TGAATTCGCGGCCGCTCAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT NNNNNNNNN -3 '). 5 'sequenza prossimale è il sito di restrizione Noti mentre la sequenza successiva fino a quando la regione casuale è il complemento inverso della sequenza adattatore Illumina B da Chip-Seq kit.
- 5X primo tampone microlitri filone -4
- DTT - 2 microlitri
- dNTP mix * - 1,5 microlitri
Messo su termociclatore per 2 minuti a 42 ° C, aggiungere 1 ml di trascrittasi inversa SuperScript III, e incubare a 42 ° C per 1 ora.
* Invece di dCTP, 5-metil dCTP è stato utilizzato nella miscela dNTP.
Filamento prima sintesi per la libreria fine appaiati:
- In un tubo di PCR, aggiungere il seguente:
- Frammentata Poly-A mRNA - 10 microlitri
- Esamero random primer - 1 ml
Incubare a 65 ° C per 5 minuti in termociclatore, e chill veloce sul ghiaccio.
- Per quanto sopra, aggiungere il seguente su ghiaccio (da SuperScript firststrand III kit):
- 5X primo buffer filo - 4 microlitri
- DTT - 2 microlitri
- dNTP (dakit) - 1,5 microlitri
Messo su termociclatore per 1 min a 45 ° C, aggiungere 1 ml di trascrittasi inversa SuperScript III, e incubare a 45 ° C per 1 ora.
Filamento sintesi secondo (per entrambe le biblioteche):
- Per quanto sopra, aggiungere il seguente su ghiaccio (da SuperScript II kit):
- Acqua (RNase free) - 91 microlitri
- Buffer 5X Secondo Strand - 30 microlitri
- dNTP (da kit) - 3 ml
- E. coli DNA ligasi - 1 ml
- E. coli DNA polimerasi - 4 microlitri
- E. coli RNase H - 1 ml
Tubo Miscelare invertendo e dare un giro breve e incubare a 16 ° C per 2 ore.
7. Purificare cDNA
- Purificare campione di cDNA con colonne Zymo, eluire in 40 ml di acqua per letto singolo e 30 ml di acqua per la libreria fine appaiati.
8. Fine riparazione
Per singola biblioteca leggere:
- Per quanto sopra 40 l di cDNA, aggiungere:
- T4 DNA ligasi tampone con 10 mM ATP - 5 microlitri
- dNTP mix - 2 microlitri
- DNA polimerasi T4 - 1 ml
- Klenow enzima (diluito 1:5 con acqua per 1U / mL) - 1 ml
- T4 PNK - 1 ml
Incubare nel termociclatore per 30 minuti a 20 ° C.
Per la libreria fine accoppiato:
(Usa Illumina accoppiato campione kit fine prep)
- Al superiore ai 30 microlitri cDNA, aggiungere:
- Acqua priva di DNasi RNasi - 45 microlitri
- T4 DNA ligasi tampone con 10 mM ATP - 10 microlitri
- 10mM dNTP mix - 4 microlitri
- DNA polimerasi T4 - 5 microlitri
- Klenow enzima - 1 ml
- T4 PNK - 5 microlitri
Incubare nel termociclatore per 30 minuti a 20 ° C.
9. cDNA di pulizia
- C magra fino cDNA colonne Zymo utilizzando. Eluire in 34 ml di EB per letto singolo e 32 ml di EB per la libreria fine appaiati.
10. Aggiungi 'A' le basi per porre fine alla 3 'dei frammenti di DNA
Per singola biblioteca leggere:
- Preparare la seguente miscela di reazione:
- Campione di DNA - 34 microlitri
- Klenow tampone - 5 microlitri
- dATP - 10 microlitri
- Klenow exo - 1 ml
Incubare per 30 minuti a 37 ° C.
Per la libreria fine accoppiato:
- Preparare la seguente miscela di reazione:
- Campione di DNA - 32 microlitri
- Klenow tampone - 5 microlitri
- dATP - 10 microlitri
- Klenow exo - 3 ml
Incubare per 30 minuti a 37 ° C.
11. cDNA di pulizia
- Pulire cDNA colonne zymo utilizzando. Eluire in 10 ml di EB.
12. Adattatore legatura
jove_step "> Per singola biblioteca di leggere:(Usa Illumina Chip-Seq campione preparazione kit)
- Preparare la seguente miscela di reazione:
- Campione di DNA - 10 microlitri
- Adattatore Oligo Mix - 1 ml
- 2X DNA ligasi Buffer--15 microlitri
- La DNA ligasi - 4 microlitri
Incubare per 15 minuti a temperatura ambiente. Adattatori devono essere scongelati su ghiaccio e diluito 1:20.
Per la libreria fine accoppiato:
(Usa Illumina accoppiato campione kit fine prep)
- Preparare la seguente miscela di reazione:
- Campione di DNA - 10 microlitri
- PE Adattatore Oligo Mix - 10 microlitri
- 2X DNA ligasi Buffer - 25 microlitri
- La DNA ligasi - 5 microlitri
Incubare per 15 minuti a 20 ° C. Adattatori devono essere scongelati su ghiaccio e diluito 1:20.
13. Reazione legatura ripulire
- Pulire la reazione legatura con zymo colonne. Eluire in 44 ml di acqua per singola biblioteca leggere e 6 ml di EB seguito da un altro eluizione in 5 ml di EB per la libreria fine appaiati.
Eseguire una digestione Noti, SOLO per singola biblioteca leggere
- cDNA - 44 microlitri
- NEB tampone 3-5 microlitri
- BSA - 0,5 microlitri
- Noti - 1 ml
Incubare per 2 ore a notte a 37 ° C, e la reazione purificare con colonna zymo. Eluire con 6 ml di tampone EB seguita da una seconda eluizione con 5 ml di EB.
14. Selezione del formato / Gel purificazione
Eseguire le seguenti operazioni utilizzando un 2% Sybr di sicurezza E-Gel da Invitrogen.
- Esegui programma 0-PreRun 2 minuti.
- Carico più 1kb scala da Invitrogen diluito 1:4, e carico 10 microlitri.
- Carica tutti di campione di DNA, e riempire corsie vuote con 10 ml di acqua.
- Esegui programma 1-2% Egel Esegui 28 minuti.
- Dimensione selezionare 200-300 pb gel slice con una lametta fresca.
15. DNA eluiscano dalla fetta gel
- Pesare fetta gel, e aggiungere 3 volumi di tampone QG di 1 volume di gel (gel kit da utilizzare estrazione Qiagen)
- Incubare a 50 ° C per 10 minuti o fino a quando fetta gel si scioglie.
- Aggiungere 1 volume di ispropanol, e mescolare per inversione o pipettamento.
- Aggiungi alla colonna, girare per 1 minuto alla massima velocità, e scartare flow-through.
- Aggiungere 500 ml di buffer QG alla colonna, girare per 1 minuto alla massima velocità, ed eliminare il flusso attraverso.
- Aggiungere 750 ml di tampone PE alla colonna, girare per 1 minuto alla massima velocità, ed eliminare il flusso attraverso.
- Centrifugare per 1 minuto alla massima velocità.
- Eluire in 36 ml di EB per letto singolo e 23 microlitri per la libreria EB fine appaiati.
16. PCR
Per singola biblioteca leggere:
(Usa Illumina Chip-Seq campione preparazione kit)
- Preparare il following Miscela di reazione PCR:
- DNA - 36 microlitri
- Phusion 5X tampone - 10 microlitri
- dNTP mix - 1,5 microlitri
- PCR Primer 1,1-1 microlitri
- PCR Primer 2,1-1 microlitri
- Phusion polimerasi - 0,5 microlitri
Utilizzare il seguente protocollo PCR:
- 30 secondi a 98 ° C
- 10 cicli di:
- 10 secondi a 98 ° C
- 30 secondi a 65 ° C
- 30 secondi a 72 ° C
- 5 minuti a 72 ° C
- Mantenere a 4 ° C
* La prima volta che il kit è usato, diluire primer PCR 1:2 con tampone EB.
Per la libreria fine accoppiato:
(Usa Illumina accoppiato campione kit fine prep)
- Preparare la seguente reazione di PCR:
- DNA - 23 microlitri
- Phusion DNA polimerasi - 25 microlitri
- PCR Primer PE 1,1-1 microlitri
- PCR Primer PE 2.1 -1 ml
Amplificare utilizzando il seguente protocollo PCR:
- 30 secondi a 98 ° C
- 10 cicli di:
- 10 secondi a 98 ° C
- 30 secondi a 65 ° C
- 30 secondi a 72 ° C
- 5 minuti a 72 ° C
- Mantenere a 4 ° C
* La prima volta che il kit è usato, diluire primer PCR 1:2 con tampone EB.
17. Biblioteca ripulire
- Pulire libreria con colonne zymo. Eluire in 12 ml di EB
18. Quantificare biblioteca
- Biblioteca quantificare con Qubit. E 'pronto per il sequenziamento. Usa sequenza primer da Illumina unico kit grappolo leggere generazione V4 o superiore per singolo biblioteca di lettura e Illumina abbinati kit grappolo fine generazione V4 o superiore per la libreria fine appaiati.
19. Analisi dei dati
Bowtie 6 è stato utilizzato per map legge sul set gene RefSeq (NCBI Costruire 36.1). La fine delle singole letture (30 nucleotidi) e la fine paio legge (42 nucleotidi) sono stati mappati consentendo fino a 10 partite al set gene, e permettendo fino a due squilibri per leggere. Trascrizioni per milione (TPM) i valori sono stati ottenuti per misurare l'espressione genica utilizzando RSEM 7 (RNA-Seq da Expectation-massimizzazione).
20. Risultati rappresentante: Abbiamo fatto le biblioteche T7LA sia per fine solo leggere e associato va da 1 mg, 100 mg, 10 mg, 1 mg e 100 pg di partenza RNA totale (Figura 1). Per la valutazione del nostro protocollo, abbiamo fatto solo leggere e associato biblioteche fine senza amplificazione T7 RNA a partire da 10 mg di RNA totale Queste librerie di controllo, denominato "MinAmp", hanno amplificazione minima. L'amplificazione solo subiscono sono i 10 cicli di PCR verso la fine del protocollo di legare gli adattatori Illumina sequenziamento, un passaggio comune a tutte le librerie. Tutti utilizzato RNA sono stati isolati da H14cellule staminali embrionali umane 8.
In primo luogo abbiamo valutato il numero di geni identificati dalle biblioteche diverse (Tabella 1 e Tabella supplementare 1). Per entrambe le singole biblioteche fine leggere e associati, l'ng 10 biblioteche T7LA identificato quasi lo stesso numero di geni come le librerie MinAmp 10 mg, con un TPM di 10 o più. Nel caso delle singole biblioteche di lettura, il 10 ng T7LA biblioteca identificato il 100% del 8500 geni identificati dalla libreria 10 mcg non amplificata. Per le librerie fine associati, l'10 ng T7LA biblioteca individuato 86% dei geni identificati dalla libreria 10 mcg non amplificata (7961 di 9267 geni). Biblioteche fatto da meno di 10 ng non sono stati in grado di identificare come molti geni. Per esempio, nel protocollo unico letto, il 1 biblioteca ng identificato solo circa il 50% dei geni identificati dalla libreria 10 mcg MinAmp, ci spinge a limitare la quantità più bassa di RNA totale per l'utilizzo con il protocollo T7LA a 10 ng. Inoltre, la mappatura di un gene housekeeping, GAPDH (Figura 2) mostra che tutte le librerie T7LA realizzati con almeno 10ng di RNA a partire identificato tutti gli esoni, compreso l'estremo 5 'esone. Confronto tra i 10 ng T7LA singole biblioteche fine lettura e in coppia con le librerie MinAmp mostra un elevato grado di somiglianza (correlazione Spearman, R = 0,90 e 0,95 rispettivamente le figure 3a e b). Abbiamo anche confrontato i due singole biblioteche fine leggere e associato presentate dal 10 ng di RNA totale e hanno avuto un coefficiente di correlazione molto alta (R = 0,92), dimostrando che entrambi i tipi di biblioteche effettuate utilizzando il protocollo T7LA produrre un simile profilo di espressione genica ( Figura 3c).. Quindi, il metodo T7LA è in grado di produrre librerie di sequenziamento che sono affidabili ed esaurienti le librerie MinAmp, ma dal 1000 volte meno materiale di partenza.
Figura 1 Schema di fine coppie e singole leggere protocollo di preparazione biblioteca.
Figura 2 Una foto del browser del genoma di un gene housekeeping, GAPDH, per tutte le singole biblioteche fine leggere e associati. La barra della scala a sinistra per leggere le singole biblioteche indica totale 350 letture. La barra della scala al centro per le librerie di fine 5000 indica accoppiato totale letture. L'asse orizzontale rappresenta la sequenza del genoma di GAPDH.
Figura 3 Correlazione di espressioni gene tra le varie biblioteche (Spearman):. Singola A. Tra leggere 10 e 10 ng T7LA biblioteca MinAmp mcg mostra che entrambe queste biblioteche hanno un simile pattern di espressione genica (R = 0,90) B. Tra la fine accoppiato 10 ng T7LA e 10 mcg biblioteca MinAmp dimostra la loro somiglianza dei profili di espressione genica (R = 0,95). Correlazione C. gene expressions tra i 10 ng fine associato e 10 ng singole biblioteche leggere mostrano un elevato grado di somiglianza tra queste librerie preparato con il metodo T7LA (R = 0,92).
Figura 4 Identificazione delle risorse umane genes5 sulle cellule staminali embrionali specifiche da tutte le singole biblioteche fine leggere e associati.
| Biblioteca | ° tipo | Cluster prime | Cluster% passando filtro | Allineamento% di genoma | % Error Rate | Geni identificati |
| MinAmp 10ug | Letto singolo | 225.602 + / - 4952 | 65,48 + / - 2,58 | 47,61 + / - 0,53 | 0,62 + / - 0,06 | 8500 |
| 1UG T7LA | Letto singolo | 144.818 + / - 6513 | 82,21 + / - 6,45 | 48,09 + / - 0.27 | 0,42 + / - 0,03 | 8757 |
| 100 ng T7LA | Letto singolo | 27385 + / - 1818 | 81,33 + / - 11.75 | 44,46 + / - 4,53 | 0,49 + / - 0.10 | 8709 |
| 10ng T7LA | Letto singolo | 11184 + / - 985 | 60,70 + / - 3,70 | 14,96 + / - 1.15 | 0.99 + / - 0,30 | 8589 |
| 1NG T7LA | Letto singolo | 12695 + / - 1365 | 53,27 + / - 16,76 | 4,08 + / - 0,79 | 2,25 + / - 1,56 | 4720 |
| 100pg T7LA | Letto singolo | 10390 + / - 1398 | 72,99 + / - 2,90 | 1,48 + / - 0,20 | 1,51 + / - 0.39 | 1121 |
| MinAmp 10ug | Fine R1 accoppiato | 95786 + / - 12937 | 90,77 + / - 2,79 | 58,50 + / - 0,95 | 0,94 + / - 0,38 | 9267 |
| Fine R2 abbinato | 95786 + / - 12937 | 90,77 + / - 2,79 | 58,13 + / - 1.13 | 0.99 + / - 0,37 | ||
| 1UG T7LA | Fine R1 accoppiato | 297.669 + / - 10196 | 91,35 + / - 0,36 | 46,89 + / - 0,14 | 0,47 + / - 0,01 | 7334 |
| Fine R2 abbinato | 297.669 + / - 10196 | 91,35 + / - 0,36 | 45,52 + / - 0,12 | 0,51 + / - 0,01 | ||
| 100 ng T7LA | Fine R1 accoppiato | 205.602 + / - 9932 | 90,53 + / - 0,76 | 63,44 + / - 1.00 | 0,48 + / - 0,02 | 8011 |
| Fine R2 abbinato | 205.602 + / - 9932 | 90,53 + / - 0,76 | 61,80 + / - 8,09 | 0,60+ / - 0,36 | ||
| 10ng T7LA | Fine R1 accoppiato | 214.622 + / - 11155 | 89,98 + / - 1.13 | 56,32 + / - 1.94 | 0,80 + / - 0,26 | 7961 |
| Fine R2 abbinato | 214.622 + / - 11155 | 89,98 + / - 1.13 | 46,41 + / - 18,39 | 2,48 + / - 2,68 | ; | |
| 1NG T7LA | Fine R1 accoppiato | 144.951 + / - 19841 | 90,54 + / - 1.19 | 3,91 + / - 0,16 | 8,71 + / - 0,86 | 8124 |
| Fine R2 abbinato | 144.951 + / - 19841 | 90,54 + / - 1.19 | 3,27 + / - 1.21 | 9,11 + / - 3,52 | ||
| 100pg T7LA | Fine R1 accoppiato | 187.600 + / - 11759 | 89,52 + / - 1.11 | 1,78 + / - 0,05 | 13,42 + / - 0,50 | 6623 |
| Fine R2 abbinato | 187.600 + / - 11759 | 89,52 + / - 1.11 | 1,99 + / - 0,23 | 15,29 + / - 0,96 | ||
° R1 e R2 sono avanti e indietro le sequenze di un tag
* ≥ 10 TPM
Tabella 1. Informazioni sui numeri di cluster, i geni identificati, tasso di errore, l'allineamento per cento delle singole biblioteche fine leggere e associati.
Tabella supplementare 1. Elenco di tutti i geni ed i loro valori TPM per tutti i campioni, letto singolo e associato fine.
Discussion
Attuali protocolli per rendere le biblioteche fine abbinato richiedono tra 1 mg 9-2,5 mcg 10 importo iniziale di RNA totale. Qui vi presentiamo il nostro lineare di amplificazione basato T7 (T7LA) per preparare sia letto singolo e associato biblioteche Illumina fine di sequenziamento e dimostrare che questo metodo permette la generazione di librerie da un minimo di 10 ng di RNA totale, producendo dati paragonabile a quella di minimamente amplificato (MinAmp) librerie fatte da 1000 volte più materiale di partenza (10 mcg totale RNA). Le 10 librerie ng non solo di identificare simili numero totale di geni, ma anche produrre firme di espressione genica che sono simili (Figure 3a e b). Inoltre, sia le singole biblioteche fine leggere e associato ottenuti con il metodo T7LA sono molto simili tra loro (Figura 3c), che permette ai ricercatori di confrontare i dati generati dalle biblioteche fatto da uno dei due protocolli. Dal momento che queste librerie sono state preparate da RNA di cellule staminali embrionali, abbiamo cercatoper i geni specifici delle cellule staminali 30 tra le librerie e scoprire che quasi tutti questi geni (93-100%) sono identificati con le librerie base di almeno 10 ng di RNA totale di partenza (Figura 4), convalidando così il nostro protocollo. Crediamo che il nostro protocollo sarebbe molto utile per i ricercatori, soprattutto in circostanze come celle di flusso ordinato o laser-micro-tessuto sezionato in cui il materiale di partenza è limitante. In tali circostanze, il nostro protocollo permetterebbe la generazione di dati di espressione genica simile a biblioteche fatto da molto più grande quantità a partire dal nostro protocollo produce profili di espressione comparabili tra almeno 3 ordini di grandezza di RNA di partenza.
Disclosures
Gli autori rivelare che JAT è uno dei fondatori, stockowner, consulente e membro del consiglio di Cellular Dynamics International (CDI). Si serve anche come consulente scientifico e ha interessi finanziari in joint sulle cellule staminali Tactics II.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da un finanziamento della Morgridge Istituto per la Ricerca e l'Università del Wisconsin Fondazione. Ringraziamo Krista Eastman per l'assistenza editoriale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fragmentation reagent | Ambion | AM8740 | |
| Liner Acrylamide | Ambion | AM9520 | |
| MEGAscript T7 Kit | Ambion | AM1334 | |
| Non DEPC treated nuclease free water | Ambion | AM9932 | |
| dNTP set | Fermentas | R0181 | |
| methylated dNTPs | Fermentas | R0431 | For Single Read sample prep only |
| TruSeq SR Cluster Generation kit v5 | Illumina | GD-203-5001 | For Single Read sample prep only |
| TruSeq Seq Kit v5 36 cycles | Illumina | FC-104-5001 | |
| Chip Seq Sample Prep Kit | Illumina | IP-102-1001 | For Single Read sample prep only. Can be replaced with NEB DNA sample prep Master Mix Set 1 Cat# E6040S |
| TruSeq PE Cluster Generation kit v5 | Illumina | PE-203-5001 | For paired end sample prep only |
| Paired End Sample Prep Kit | Illumina | PE-102-1001 | For paired end sample prep only |
| 1kb plus ladder | Invitrogen | 10787-018 | |
| E. coli Rnase H | Invitrogen | 18021-014 | |
| Rnase Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| 2nd strand buffer 5x | Invitrogen | 10812-014 | |
| E. coli DNA polymerase | Invitrogen | 18010-017 | |
| E-gel SYBR safe 2% | Invitrogen | G521802 | |
| Superscript III (with 5X FS buffer and 0.1M DTT) | Invitrogen | 18080-085 | |
| Trizol | Invitrogen | 12183555 | |
| RNA quibit assay kit | Invitrogen | Q32852 | |
| dsDNA HS qubit assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| E. coli DNA ligase | Invitrogen | 18052-019 | |
| T4 DNA Polymerase | Invitrogen | 18005-025 | |
| Ultra Pure Dnase Rnase water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Superscript II double stranded cDNA synthesis kit | Invitrogen | 11917-020 | |
| Random Primer (invitrogen) | Invitrogen | 48190-011 | For paired end sample prep only |
| Not1Nonamer B primer | IDT | N/A | For Single Read sample prep only |
| Oligo dT T7 | IDT | N/A | |
| Not1 digestion kit | New England Biolabs | R0189S | For Single Read sample prep only |
| Rneasy Minelute kit | Qiagen | 74204 | |
| RNEasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | |
| Gel purification kit | Qiagen | 28604 | |
| Dnase set | Qiagen | 79254 | |
| Rneasy MinElute kit | Qiagen | 74204 | |
| DNA clean and concentrator (250X) | Zymo Research Corp. | D4014 |
References
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- Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis. Nature Methods. 6, 647-649 (2009).
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- Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing. Nature Methods. 5, 130-132 (2010).
- Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA. Biotechniques. 49, 898-904 (2010).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).
- Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty. Biotechniques. 26, 493-500 (2010).
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- mRNA-Seq-8 Sample Prep Kit [Internet]. , Illumina. Available from: http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn Forthcoming.
- ScriptSeq mRNA-Seq Library Preparation Kit (Illumina -compatible) Epicentre [Internet]. , Epicenter. Available from: http://www.epibio.com/item.asp?id=578 Forthcoming.
