Summary
Hier beschrijven we een methode voor de bereiding van zowel de single lezen en gekoppeld end Illumina mRNA-Seq sequencing bibliotheken voor genexpressie analyse op basis van T7-RNA lineaire versterking. Dit protocol vereist slechts 10 nanogram van het starten van totaal RNA en genereert een uiterst consistente bibliotheken vertegenwoordigt hele transcripten.
Abstract
Hele transcriptoom sequentiebepaling door mRNA-Seq wordt nu op grote schaal gebruikt om globale gen-expressie, mutatie, allel-specifieke expressie en andere genoom-brede analyses uit te voeren. mRNA-Seq opent ook de poort voor genexpressie analyse van niet-gesequenced genoom. mRNA-Seq biedt een hoge gevoeligheid, een groot dynamisch bereik en maakt het meten van transcript kopie nummers in een monster. Illumina's genoom analyse voert sequencen van een groot aantal (> 10 7) van de relatief korte reeks leest (<150 bp). De 'gepaarde end "-benadering, waarin een enkele lange lezen is gesequenced aan beide de uiteinden, maakt voor het volgen van alternatieve splice knooppunten , inserties en deleties, en is nuttig voor de novo transcriptoom montage.
Een van de belangrijkste uitdagingen voor onderzoekers is een beperkte hoeveelheid uitgangsmateriaal. Bijvoorbeeld, in experimenten waarbij cellen worden geoogst met behulp van laser micro-dissectie, beschikbaar vanaf totaal RNA may te meten in nanogram. Voorbereiding van de mRNA-Seq bibliotheken van dergelijke monsters zijn beschreven 1, 2 maar brengt grote PCR-amplificatie, dat kan invoeren bias. Andere RNA-Seq bibliotheek constructie met een minimum aan procedures PCR-amplificatie zijn gepubliceerd 3, 4 maar vereisen microgram hoeveelheden van het starten van totaal RNA.
Hier beschrijven we een protocol voor de Illumina Genome Analyzer II-platform voor mRNA-Seq sequencing voor bibliotheek voorbereiding die belangrijk PCR-amplificatie vermijdt en vereist slechts 10 nanogram totaal RNA. Hoewel dit protocol is eerder beschreven en gevalideerd voor single-end sequencing 5, waar het werd aangetoond dat directionele bibliotheken te produceren zonder invoering van aanzienlijke versterking bias, hier zijn we verder valideren voor gebruik als een gekoppelde end protocol. We selectief versterken gepolyadenyleerde messenger RNA's kan starten totaal RNA met behulp van de T7-gebaseerde Eberwine lineaire versterking methode, bedacht "T7LA "(T7 lineaire versterking). De geamplificeerde poly-A mRNA's zijn gefragmenteerd, reverse getranscribeerd en adapter geligeerd aan de uiteindelijke volgorde bibliotheek te maken. Voor zowel de single lezen en gekoppeld einde loopt, sequenties worden toegewezen aan de menselijke transcriptoom 6 en zodat genormaliseerde Gegevens uit meerdere runs kunnen worden vergeleken. We verslag van de genexpressie gemeten in eenheden van transcripten per miljoen (TPM), die een superieure maatregel om RPKM bij het vergelijken van samples 7.
Protocol
1. Isoleer totaal RNA
- Voeg 1 ml TRIzol aan cellen / weefsels, en gehomogeniseerd met 18-22 gaas naald indien nodig.
- Voeg 200 ul chloroform, en spin bij 14.000 rpm gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
- Haal bovenste waterlaag, 0,5 ul lineaire acrylamide toe te voegen, voeg dan 500 pi isopropanol. Laten we zitten bij kamertemperatuur gedurende 20 minuten.
- Draaien op 14.000 rpm bij 4 ° C, was pellet met 70% ethanol, en vacuüm droog.
- Resuspendeer in 1 pi nuclease gratis water en over te dragen aan 200 pi PCR buis.
2. Bereid dubbele cDNA stranded
- Om de bovengenoemde 1 pi RNA voeg 1 pi van 100 uM oligo-dT-T7 reverse transcriptie primer (5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT -3 '), warmte bij 70 ° C (warmte blok) gedurende 5 minuten, en snap koel op ijs.
- Voeg 1 ui 5x FS buffer, 0,5 ul DTT, 0,5 pl dNTP mix en 0,5 ul RnaseOUT (van SuperScript II kit).
- Verwarm tot 42° C in PCR machine voor 1 minuut, voeg dan 0,5 pl Superscript II reverse transcriptase. Incubeer gedurende 1 uur bij 42 ° C.
- Warmte bij 70 ° C gedurende 10 minuten, laat afkoelen tot 4 ° C.
- Op ijs, voeg het volgende toe aan de bovenstaande reactie:
- Nuclease gratis water - 22.75 ul
- 5X Tweede deel buffer - 7,5 pl
- dNTP mix - 0.75 ul
- E. coli DNA-ligase - 0,25 ul
- E. coli DNA-polymerase - 1 pi
- RNaseH - 0,25 ul
Incubeer 2 uur bij 16 ° C en voeg daarna 1 ul T4 DNA-polymerase, en voor nog eens 10 minuten bij 16 ° C. incubeer
- Transfer naar 1,5 ml Eppendorf buis, en voeg 80 ul water.
- Voeg 0,5 ul van lineaire acrylamide.
- Voeg 72 pl 3 M NH4OAc en 480 ul van koude 100% ethanol. Neerslag gedurende 1 uur bij -20 ° C.
- Draaien op 14.000 rpm bij 4 ° C gedurende 30 minuten, spoel met 1 ml 70% ethanol, centrifuge bij 14.000 rpm gedurende 2minuten, en vacuüm droog gedurende ongeveer 10 minuten.
3. Amplify poly-A mRNA door in vitro transcriptie
- Resuspendeer bovenstaande cDNA in 3,5 ul nuclease vrij water.
- Op het bovenstaande, voeg 1 ui van elk van de dNTPs (totaal 4 pl), 1 ui 10X reactiebuffer en 1 ul van T7-polymerase, en 0,5 pi RnaseOUT uit Megascript kit.
- Incubeer bij 37 ° C in PCR-machine 's nachts.
- Klaar voor volgende stap. Kan worden opgeslagen bij -80 ° C.
4. Versnippering van versterkte poly-A mRNA
- Voeg 26 ul van water tot boven de reactie en 4 pl 10x fragmentatie reagens.
- Verhit in PCR-machine op 70 ° C gedurende precies zeven minuten.
- Voeg 5 ul van fragmentatie te stoppen buffer, zet monster op ijs.
5. RNA schoon te maken
- Om de bovenstaande reactie, voeg 60 ul water en 350 pi buffer RLT van RNeasy MinElute kit, en meng door pipetteren.
- Voeg 250 ul ethanol, meng door pipetteren, en de pipet in de spin-kolom.
- Spin op 8000 RCF gedurende 20 seconden.
- Was eenmaal met RPE, spin gedurende 20 seconden, was de tweede keer met 80% EtOH, spin gedurende 2 minuten, en droog kolom met 5 minuten draaien.
- Elueer RNA in 10 ul nuclease vrij water.
6. cDNA-synthese
Eerste deel synthese voor single te lezen bibliotheek:
- In een PCR-buis, voegt u het volgende:
- Gefragmenteerde Poly-A mRNA - 10 pi
- Notl Random nonamer Primer - een ui
Incubeer bij 70 ° C gedurende 5 minuten in thermocycler, en snel chillen op het ijs. Notl Nonamer Primer (5'-TGAATTCGCGGCCGCTCAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT NNNNNNNNN -3 '). De 5 'proximale sequentie is de Notl restrictieplaats terwijl de volgende volgorde totdat het willekeurige gebied is het omgekeerde complement van de adapter Illumina's B opeenvolging van Chip-Seq kit.
- 5X eerste onderdeel buffer -4 ul
- DTT - 2 pi
- dNTP mengsel * - 1,5 pl
Doe thermocycler gedurende 2 minuten bij 42 ° C, voeg 1 pl SuperScript III reverse transcriptase, en incubeer bij 42 ° C voor 1 uur.
* In plaats van dCTP, werd 5-methyl dCTP gebruikt in de dNTP mengsel.
Eerste deel synthese voor gepaarde einde bibliotheek:
- In een PCR-buis, voegt u het volgende:
- Gefragmenteerde Poly-A mRNA - 10 pi
- Random hexameer primer - 1 pi
Incubeer bij 65 ° C gedurende 5 minuten in thermocycler, en snel chillen op het ijs.
- Om het bovenstaande, voegt u de volgende op ijs (van SuperScript firststrand III kit):
- 5X eerste onderdeel buffer - 4 pl
- DTT - 2 pi
- dNTPs (vankit) - 1,5 pl
Doe thermocycler voor een min bij 45 ° C, 1 ui SuperScript III reverse transcriptase toe te voegen, en incuberen bij 45 ° C gedurende 1 uur.
Tweede deel synthese (voor beide bibliotheken):
- Om het bovenstaande, voegt u de volgende op ijs (van SuperScript II kit):
- Water (RNase gratis) - 91 pl
- 5X Tweede Strand Buffer - 30 pl
- dNTPs (uit kit) - 3 pl
- E. coli DNA-ligase - 1 pi
- E. coli DNA-polymerase - 4 pl
- E. coli RNase H - 1 pi
Meng buis door inversie, geef een korte draai en incubeer bij 16 ° C gedurende 2 uur.
7. Zuiver cDNA
- Zuiver cDNA monster met Zymo kolommen, elueren in 40 pi van water voor enkele lees-en 30 ul van water voor gepaarde einde bibliotheek.
8. End reparatie
Voor de single te lezen bibliotheek:
- Om het boven de 40 ul van cDNA, toe te voegen:
- T4 DNA-ligase buffer met 10 mM ATP - 5 pl
- dNTP mix - 2 pi
- T4 DNA-polymerase - 1 pi
- Klenow enzym (verdund 1:05 met water tot 1U / ul) - 1 ui
- T4 PNK - 1 ui
Incubeer in het PCR-apparaat gedurende 30 minuten bij 20 ° C.
Voor gepaarde end bibliotheek:
(Gebruik Illumina gepaarde einde sample prep-kit)
- Om de boven 30 ul cDNA, toe te voegen:
- RNase DNase-vrij water - 45 pl
- T4 DNA-ligase buffer met 10 mM ATP - 10 pi
- 10 mM dNTP mix - 4 pl
- T4 DNA-polymerase - 5 pl
- Klenow enzym - een ui
- T4 PNK - 5 pl
Incubeer in het PCR-apparaat gedurende 30 minuten bij 20 ° C.
9. cDNA schoon te maken
- C lean up cDNA met behulp van Zymo kolommen. Elueren in 34 ul van EB voor enkele lees-en 32 ul van EB voor gepaarde einde bibliotheek.
10. Add 'A' bases aan het 3 'einde van de DNA-fragmenten
Voor de single te lezen bibliotheek:
- Bereid de volgende reactie mix:
- DNA-monster - 34 ul
- Klenow buffer - 5 pl
- dATP - 10 pi
- Klenow exo - 1 ui
Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
Voor gepaarde end bibliotheek:
- Bereid de volgende reactie mix:
- DNA-monster - 32 ul
- Klenow buffer - 5 pl
- dATP - 10 pi
- Klenow exo - 3 pl
Incubeer gedurende 30 minuten bij 37 ° C.
11. cDNA schoon te maken
- Schoon te maken met behulp van cDNA zymo kolommen. Elueren in 10 ul van EB.
12. Adapter ligatie
jove_step "> Voor single te lezen bibliotheek:(Gebruik Illumina Chip-Seq sample prep-kit)
- Bereid de volgende reactie mix:
- DNA-monster - 10 pi
- Adapter Oligo Mix - 1 pi
- 2X DNA-ligase buffer--15 pl
- DNA-ligase - 4 pl
Incubeer gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur. Adapters moeten worden ontdooid op ijs en verdund 1:20.
Voor gepaarde end bibliotheek:
(Gebruik Illumina gepaarde einde sample prep-kit)
- Bereid de volgende reactie mix:
- DNA-monster - 10 pi
- PE Adapter Oligo Mix - 10 pi
- 2X DNA-ligase Buffer - 25 ui
- DNA-ligase - 5 pl
Incubeer gedurende 15 minuten bij 20 ° C. Adapters moeten worden ontdooid op ijs en verdund 1:20.
13. Ligatiereactie schoon te maken
- Het schoonmaken van de ligatiereactie met behulp van Zymo kolommen. Elueren in 44 ul van water voor enkele gelezen bibliotheek en 6 pl van EB gevolgd door een andere elutie in 5 pi van EB voor gepaarde einde bibliotheek.
Voer een Notl spijsvertering, ALLEEN voor alleenstaande lezen bibliotheek
- cDNA - 44 pl
- NEB buffer 3 tot 5 pl
- BSA - 0,5 pl
- Notl - 1 pi
Incubeer gedurende 2 uur een nacht bij 37 ° C, en het zuiveren reactie met gebruikmaking van zymo kolom. Elueren met 6 pi buffer EB gevolgd door een tweede elutie met 5 ul van EB.
14. Maat selectie / Gel zuivering
Voer de volgende met behulp van een 2% SYBR Safe E-Gel van Invitrogen.
- Run Program 0-PreRun 2 minuten.
- Laad 1kb plus ladder van Invitrogen verdund 1:04, en de belasting 10 pi.
- Belasting van alle DNA-monster, en vul lege lanen met 10 ul van water.
- Run Program 1-Egel 2% Run 28 minuten.
- Formaat te selecteren 200-300 bp gel SLICe met een frisse scheermesje.
15. Elueren DNA uit gel slice
- Weeg gel slice, en voeg 3 volumes buffer QG tot een volume van gel (gebruik Gel Extraction kit van Qiagen)
- Incubeer bij 50 ° C gedurende 10 minuten of tot gel slice oplost.
- Voeg een volume van ispropanol, en meng door inversie of pipetteren.
- Voeg toe aan kolom, spin voor 1 minuut bij maximale snelheid, en gooi flow-through.
- Voeg 500 pi buffer QG kolom, spin gedurende 1 minuut bij maximale snelheid, en gooi doorstromen.
- Voeg 750 pi buffer PE kolom, spin gedurende 1 minuut bij maximale snelheid, en gooi doorstromen.
- Centrifugeer gedurende 1 minuut bij maximale snelheid.
- Elueren in 36 ul van EB voor enkele lees-en 23 ul EB voor gepaarde einde bibliotheek.
16. PCR
Voor de single te lezen bibliotheek:
(Gebruik Illumina Chip-Seq sample prep-kit)
- Bereid de following PCR reactie mix:
- DNA - 36 ui
- 5X Phusion buffer - 10 pi
- dNTP mix - 1,5 ul
- PCR primer 1,1 tot 1 ui
- PCR primer 2,1 tot 1 ui
- Phusion polymerase - 0,5 pl
Gebruik de volgende PCR-protocol:
- 30 seconden bij 98 ° C
- 10 cycli van:
- 10 seconden bij 98 ° C
- 30 seconden bij 65 ° C
- 30 seconden bij 72 ° C
- 5 minuten bij 72 ° C
- Houd bij 4 ° C
* De eerste keer dat de kit wordt gebruikt, verdund PCR-primers 01:02 met EB buffer.
Voor gepaarde end bibliotheek:
(Gebruik Illumina gepaarde einde sample prep-kit)
- Bereid de volgende PCR-reactie:
- DNA - 23 ui
- Phusion DNA-polymerase - 25 ui
- PCR-primer PE 1.1-1 ui
- PCR-primer PE 2.1 -1 pi
Versterken met de volgende PCR-protocol:
- 30 seconden bij 98 ° C
- 10 cycli van:
- 10 seconden bij 98 ° C
- 30 seconden bij 65 ° C
- 30 seconden bij 72 ° C
- 5 minuten bij 72 ° C
- Houd bij 4 ° C
* De eerste keer dat de kit wordt gebruikt, verdund PCR-primers 01:02 met EB buffer.
17. Bibliotheek opruimen
- Opruimen bibliotheek met zymo kolommen. Elueren in 12 ul van EB
18. Kwantificeren bibliotheek
- Kwantificeren bibliotheek met qubit. Het is klaar voor het rangschikken. Gebruik sequencing primers van Illumina single lezen cluster generatie kit V4 of hoger voor een bibliotheek en lezen Illumina gekoppeld eind cluster generatie kit V4 of hoger voor gepaarde einde bibliotheek.
19. Data-analyse
Bowtie 6 werd gebruikt om map leest de RefSeq gen set (NCBI Build 36,1). De single einde leest (30 nucleotiden) en het paar eind leest (42 nucleotiden) werden in kaart gebracht waardoor tot 10 wedstrijden aan de set genen, en waardoor tot twee mismatches per lezen. Afschriften Per Million (TPM)-waarden werden verkregen van genexpressie met behulp van RSEM 7 (RNA-Seq door Expectation-Maximization) te meten.
20. Representatieve resultaten: We T7LA bibliotheken gemaakt voor zowel de single te lezen en is afgestemd op het einde loopt van 1 ug, 100 ug, 10 ug, 1 pg en 100 pg totaal RNA te beginnen (figuur 1). Voor de evaluatie van ons protocol, hebben we enkele lees-en gekoppeld eind bibliotheken zonder T7-RNA-amplificatie vanaf 10 ug totaal RNA Deze controle bibliotheken, aangeduid als "MinAmp", beschikken over een minimale versterking. De enige versterking ondergaan ze zijn de 10 cycli van PCR in de buurt van het einde van het protocol bij het Illumina sequencing adapters, een stap voor alle bibliotheken ligeren. Alle RNA gebruikt werden geïsoleerd uit H14menselijke embryonale stamcellen 8.
We hebben eerst onderzocht het aantal genen geïdentificeerd door de verschillende bibliotheken (tabel 1 en aanvullende tabel 1). Voor zowel een lees-en gekoppeld einde bibliotheken, de 10 ng T7LA bibliotheken geïdentificeerd bijna hetzelfde aantal genen als de 10 ug MinAmp bibliotheken, met een TPM van 10 of meer. In het geval van de te lezen bibliotheken, de 10 ng T7LA bibliotheek geïdentificeerd 100% van de 8500 genen geïdentificeerd door de 10 microgram onversterkte bibliotheek. Voor gepaarde einde bibliotheken, de 10 ng T7LA bibliotheek geïdentificeerd 86% van de genen geïdentificeerd door de 10 microgram onversterkte bibliotheek (7961 van de 9267 genen). Bibliotheken gemaakt van minder dan 10 ng niet in staat waren te identificeren als vele genen. Bijvoorbeeld, in de single lezen protocol, de 1 ng bibliotheek geïdentificeerd slechts ~ 50% van de genen geïdentificeerd door de 10 microgram MinAmp bibliotheek, vragen ons om het laagste bedrag van totaal RNA limiet voor gebruik met de T7LA protocol om 10 ng. Bovendien, in kaart brengen van een huishouding gen, GAPDH (Figuur 2) blijkt dat alle T7LA bibliotheken gemaakt met minstens 10ng van het starten van RNA alle exonen geïdentificeerd, met inbegrip van de extreme 5 'exon. Vergelijking van de 10 ng T7LA single lezen en gekoppeld einde bibliotheken met de MinAmp bibliotheken vertoont een hoge mate van overeenstemming (Spearman correlatie, R = 0,90 en 0,95 respectievelijk figuren 3a en b). We hebben ook ten opzichte van de twee enkele lees-en gekoppeld eind bibliotheken gemaakt van 10 ng totaal RNA en zij hadden een zeer hoge correlatie coëfficiënt (R = 0,92), waaruit blijkt dat beide soorten bibliotheken gemaakt met behulp van de T7LA protocol een zeer gelijkaardig genexpressie handtekening te produceren ( figuur 3c.). Vandaar dat de T7LA methode in staat is om sequencing bibliotheken die zijn zo betrouwbaar en uitgebreid als de MinAmp bibliotheken te produceren, maar vanaf 1000-maal minder uitgangsmateriaal.
Figuur 1 Schema van gepaarde end en 'single lezen bibliotheek voorbereiding protocol.
Figuur 2 Een genoom browser beeld van een huishouding gen, GAPDH, voor alle single lezen en gekoppeld einde bibliotheken. De schaal balk aan de linkerkant voor de single lezen bibliotheken geeft 350 in totaal leest. De schaal bar in het centrum voor de gepaarde eind bibliotheken geeft aan in totaal 5000 leest. De horizontale as geeft de genoomsequentie van GAPDH.
Figuur 3 Correlatie van gen-expressie tussen de verschillende bibliotheken (Spearman's):. A. Tussen de single lezen 10 ng T7LA en 10 pg MinAmp bibliotheek blijkt dat zowel deze bibliotheken een zeer gelijkaardig gen-expressie patroon (R = 0,90) hebben B. Tussen gekoppeld einde 10 ng T7LA en 10 pg MinAmp bibliotheek toont de gelijkenis van genexpressie profielen (R = 0,95). C. Correlatie van gen-expressions tussen 10 ng gekoppeld eind en 10 ng single lezen bibliotheken vertonen een hoge mate van overeenstemming tussen deze bibliotheken is opgesteld door de T7LA methode (R = 0,92).
Figuur 4 Identificatie van menselijke embryonale stamcellen specifieke genes5 van al de single lezen en gekoppeld einde bibliotheken.
| Bibliotheek | Type ° | Raw Clusters | % Clusters passeren filter | % Uitlijnen tot genoom | % Error Rate | Genen geïdentificeerd |
| MinAmp 10ug | Single gelezen | 225.602 + / - 4952 | 65,48 + / - 2,58 | 47,61 + / - 0,53 | 0.62 + / - 0,06 | 8500 |
| 1 ug T7LA | Single gelezen | 144.818 + / - 6513 | 82,21 + / - 6,45 | 48,09 + / - 0,27 | 0.42 + / - 0,03 | 8757 |
| 100ng T7LA | Single gelezen | 27.385 + / - 1818 | 81,33 + / - 11.75 | 44,46 + / - 4,53 | 0.49 + / - 0,10 | 8709 |
| 10ng T7LA | Single gelezen | 11.184 + / - 985 | 60,70 + / - 3,70 | 14,96 + / - 1,15 | 0.99 + / - 0,30 | 8589 |
| 1ng T7LA | Single gelezen | 12.695 + / - 1365 | 53,27 + / - 16.76 | 4.08 + / - 0,79 | 2.25 + / - 1,56 | 4720 |
| 100pg T7LA | Single gelezen | 10.390 + / - 1398 | 72,99 + / - 2,90 | 1.48 + / - 0,20 | 1.51 + / - 0,39 | 1121 |
| MinAmp 10ug | Gekoppelde Einde R1 | 95.786 + / - 12.937 | 90,77 + / - 2,79 | 58,50 + / - 0,95 | 0.94 + / - 0,38 | 9267 |
| Gekoppelde Einde R2 | 95.786 + / - 12.937 | 90,77 + / - 2,79 | 58,13 + / - 1,13 | 0.99 + / - 0,37 | ||
| 1 ug T7LA | Gekoppelde Einde R1 | 297.669 + / - 10.196 | 91,35 + / - 0,36 | 46,89 + / - 0,14 | 0.47 + / - 0,01 | 7334 |
| Gekoppelde Einde R2 | 297.669 + / - 10.196 | 91,35 + / - 0,36 | 45,52 + / - 0,12 | 0.51 + / - 0,01 | ||
| 100ng T7LA | Gekoppelde Einde R1 | 205.602 + / - 9932 | 90,53 + / - 0,76 | 63,44 + / - 1,00 | 0.48 + / - 0,02 | 8011 |
| Gekoppelde Einde R2 | 205.602 + / - 9932 | 90,53 + / - 0,76 | 61,80 + / - 8,09 | 0,60+ / - 0,36 | ||
| 10ng T7LA | Gekoppelde Einde R1 | 214.622 + / - 11.155 | 89,98 + / - 1,13 | 56,32 + / - 1,94 | 0.80 + / - 0,26 | 7961 |
| Gekoppelde Einde R2 | 214.622 + / - 11.155 | 89,98 + / - 1,13 | 46,41 + / - 18.39 | 2.48 + / - 2,68 | ; | |
| 1ng T7LA | Gekoppelde Einde R1 | 144.951 + / - 19.841 | 90,54 + / - 1,19 | 3.91 + / - 0,16 | 8.71 + / - 0,86 | 8124 |
| Gekoppelde Einde R2 | 144.951 + / - 19.841 | 90,54 + / - 1,19 | 3.27 + / - 1,21 | 9.11 + / - 3,52 | ||
| 100pg T7LA | Gekoppelde Einde R1 | 187.600 + / - 11.759 | 89,52 + / - 1,11 | 1.78 + / - 0,05 | 13,42 + / - 0,50 | 6623 |
| Gekoppelde Einde R2 | 187.600 + / - 11.759 | 89,52 + / - 1,11 | 1.99 + / - 0,23 | 15,29 + / - 0,96 | ||
° R1 en R2 zijn voor-en achteruit sequenties van een tag
* ≥ 10 TPM
Tabel 1. Informatie over de cluster nummers, genen geïdentificeerd, error rate, percentage uitlijning van de single te lezen en gekoppeld einde bibliotheken.
Aanvullende Tabel 1. Lijst van alle genen en hun TPM waarden voor alle monsters, een lees-en gekoppeld te beëindigen.
Discussion
Huidige protocollen voor het maken van gekoppelde eind bibliotheken vereisen tussen 1 ug 9 tot 2,5 microgram 10 basisbedrag van totaal RNA. Hier presenteren we onze lineaire T7 versterking op basis van (T7LA) methode om zowel de single lezen en is afgestemd op het einde Illumina-sequencing bibliotheken en tonen voor te bereiden dat deze methode maakt het mogelijk genereren van bibliotheken uit zo laag als 10 ng totaal RNA, het produceren van gegevens die vergelijkbaar is met dat van minimaal versterkt (MinAmp) bibliotheken gemaakt van een factor 1000 meer uitgangsmateriaal (10 ug totaal RNA). De 10 ng bibliotheken niet alleen identificeren vergelijkbaar totaal aantal genen, maar produceren ook genexpressie handtekeningen die vergelijkbaar zijn met (de figuren 3a en b). Bovendien zijn zowel de single te lezen en is afgestemd op het einde bibliotheken geproduceerd door de T7LA methode zijn erg op elkaar lijken (figuur 3c), waarmee onderzoekers te vergelijken gegevens die worden gegenereerd door bibliotheken gemaakt van een protocol. Aangezien deze bibliotheken werden bereid uit menselijke embryonale stamcellen RNA, zochten we naarvoor 30 stamcel specifieke genen bij de bibliotheken en vind dat bijna al deze genen (93-100%) zijn geïdentificeerd door de bibliotheken gemaakt van ten minste 10 ng van het starten van totaal RNA (figuur 4), waardoor het valideren van ons protocol. Wij geloven dat ons protocol zou zeer nuttig zijn voor onderzoekers, vooral in omstandigheden zoals stroom gesorteerd cellen of laser-, micro-ontleed weefsel waar de grondstof is beperkt. In dergelijke omstandigheden zou ons protocol laten generatie van genexpressie data te vergelijken met bibliotheken gemaakt van veel grotere hoeveelheden te beginnen, omdat ons protocol produceert expressie profielen vergelijkbaar zijn tussen minstens drie ordes van grootte van het starten van RNA.
Disclosures
De auteurs beschrijven dat JAT is een oprichter, stockowner, adviseur en bestuurslid van Cellular Dynamics International (CDI). Hij fungeert ook als wetenschappelijk adviseur en heeft financiële belangen in Tactics II Stem Cell Ventures.
Acknowledgments
Dit werk werd ondersteund door financiering uit het Morgridge Instituut voor Onderzoek en de Universiteit van Wisconsin Foundation. Wij danken Krista Eastman voor redactionele ondersteuning.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Fragmentation reagent | Ambion | AM8740 | |
| Liner Acrylamide | Ambion | AM9520 | |
| MEGAscript T7 Kit | Ambion | AM1334 | |
| Non DEPC treated nuclease free water | Ambion | AM9932 | |
| dNTP set | Fermentas | R0181 | |
| methylated dNTPs | Fermentas | R0431 | For Single Read sample prep only |
| TruSeq SR Cluster Generation kit v5 | Illumina | GD-203-5001 | For Single Read sample prep only |
| TruSeq Seq Kit v5 36 cycles | Illumina | FC-104-5001 | |
| Chip Seq Sample Prep Kit | Illumina | IP-102-1001 | For Single Read sample prep only. Can be replaced with NEB DNA sample prep Master Mix Set 1 Cat# E6040S |
| TruSeq PE Cluster Generation kit v5 | Illumina | PE-203-5001 | For paired end sample prep only |
| Paired End Sample Prep Kit | Illumina | PE-102-1001 | For paired end sample prep only |
| 1kb plus ladder | Invitrogen | 10787-018 | |
| E. coli Rnase H | Invitrogen | 18021-014 | |
| Rnase Out | Invitrogen | 10777-019 | |
| 2nd strand buffer 5x | Invitrogen | 10812-014 | |
| E. coli DNA polymerase | Invitrogen | 18010-017 | |
| E-gel SYBR safe 2% | Invitrogen | G521802 | |
| Superscript III (with 5X FS buffer and 0.1M DTT) | Invitrogen | 18080-085 | |
| Trizol | Invitrogen | 12183555 | |
| RNA quibit assay kit | Invitrogen | Q32852 | |
| dsDNA HS qubit assay kit | Invitrogen | Q32851 | |
| E. coli DNA ligase | Invitrogen | 18052-019 | |
| T4 DNA Polymerase | Invitrogen | 18005-025 | |
| Ultra Pure Dnase Rnase water | Invitrogen | 10977-015 | |
| Superscript II double stranded cDNA synthesis kit | Invitrogen | 11917-020 | |
| Random Primer (invitrogen) | Invitrogen | 48190-011 | For paired end sample prep only |
| Not1Nonamer B primer | IDT | N/A | For Single Read sample prep only |
| Oligo dT T7 | IDT | N/A | |
| Not1 digestion kit | New England Biolabs | R0189S | For Single Read sample prep only |
| Rneasy Minelute kit | Qiagen | 74204 | |
| RNEasy Mini Kit (50) | Qiagen | 74104 | |
| Gel purification kit | Qiagen | 28604 | |
| Dnase set | Qiagen | 79254 | |
| Rneasy MinElute kit | Qiagen | 74204 | |
| DNA clean and concentrator (250X) | Zymo Research Corp. | D4014 |
References
- Tang, F., Barbacioru, C., Wang, Y., Nordman, E., Lee, C., Xu, N., Wang, X., Bodeau, J., Tuch, B. B., Siddiqui, A., Lao, K., Surani, M. A. mRNA-Seq whole-transcriptome analysis of a single cell. Nature Methods. 6, 377-382 (2009).
- Armour, C. D., Castle, J. C., Chen, R., Babak, T., Loerch, P., Jackson, S., Shah, J. K., Dey, J., Rohl, C. A., Johnson, J. M., Raymond, C. K. Digital transcriptome profiling using selective hexamer priming for cDNA synthesis. Nature Methods. 6, 647-649 (2009).
- Mortazavi, A., Williams, B. A., McCue, K., Schaeffer, L., Wold, B. Mapping and quantifying mammalian transcriptomes by RNA-Seq. Nature Methods. 5, 621-628 (2008).
- Mamanova, L., Andrews, R. M., James, K. D., Sheridan, E. M., Ellis, P. D., Langford, C. F., Ost, T. W., Collins, J. E., Turner, D. J. FRT-seq amplification-free, strand-specific transcriptome sequencing. Nature Methods. 5, 130-132 (2010).
- Sengupta, S., Ruotti, V., Bolin, J., Elwell, A., Hernandez, A., Thomson, J., Stewart, R. Highly consistent, fully representative mRNA-Seq libraries from ten nanograms of total RNA. Biotechniques. 49, 898-904 (2010).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome. Biology. 10, R25-R25 (2009).
- Li, B., Ruotti, V., Stewart, R. M., Thomson, J. A., Dewey, C. N. RNA-Seq gene expression estimation with read mapping uncertainty. Biotechniques. 26, 493-500 (2010).
- Thomson, J. A., Itskovitz-Eldor, J., Shapiro, S. S., Waknitz, M. A., Swiergiel, J. J., Marshall, V. S., Jones, J. M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282, 1145-1147 (1998).
- mRNA-Seq-8 Sample Prep Kit [Internet]. , Illumina. Available from: http://www.illumina.com/products/mrna_seq_8_sample_prep_kit.ilmn Forthcoming.
- ScriptSeq mRNA-Seq Library Preparation Kit (Illumina -compatible) Epicentre [Internet]. , Epicenter. Available from: http://www.epibio.com/item.asp?id=578 Forthcoming.
