Leia única e emparelhados End mRNA-Seq Bibliotecas Illumina de 10 nanogramas RNA total

Summary

Aqui nós descrevemos um método para a preparação de ambos única leitura e emparelhado final Illumina mRNA Seq-libraries seqüenciamento para análise de expressão gênica com base na amplificação T7 RNA linear. Este protocolo requer apenas 10 nanogramas de começar RNA total e gera bibliotecas altamente consistentes representando transcrições todo.

Abstract

Seqüenciamento do transcriptoma inteiro por mRNA Seq-se amplamente utilizado para realizar a expressão gênica global, mutação, expressão alelo-específico e outras análises genômicas. mRNA-Seq ainda abre o portão para a análise de expressão gênica de genomas seqüenciados não. mRNA Seq oferece alta sensibilidade, uma grande gama dinâmica e permite a medição do número de cópias transcrição em uma amostra. Analisador Illumina genoma realiza sequenciamento de um grande número (> 10 ⁷⁾ da seqüência relativamente curta lê (<150 pb). O "emparelhado fim" abordagem, em que uma leitura única e longa é seqüenciado em ambas as extremidades a sua, permite o rastreamento junções splice alternativo , inserções e deleções, e é útil para a montagem de transcriptoma novo.

Um dos grandes desafios enfrentados pelos pesquisadores é uma quantidade limitada de matéria-prima. Por exemplo, em experimentos onde as células são colhidas por laser micro-dissecção, disponível a partir de RNA total de may medida em nanogramas. Preparação de mRNA Seq-bibliotecas a partir de tais amostras foram descritas ^{1, 2,} mas envolve a amplificação por PCR significativo que pode introduzir viés. Outros RNA-Seq procedimentos de construção da biblioteca com a amplificação PCR mínima foram publicados ^{3, 4,} mas requerem quantidades micrograma de RNA total de partida.

Aqui nós descrevemos um protocolo para a plataforma Illumina Genome Analyzer II para mRNA Seq-seqüenciamento para a preparação de biblioteca que evita a amplificação PCR significativa e requer apenas 10 nanogramas de RNA total. Embora este protocolo foi descrito anteriormente e validado para um único fim de seqüenciamento ^5, onde foi mostrado para produzir bibliotecas direcional sem introduzir viés de amplificação significativa, aqui nós validá-lo para utilização como um protocolo final emparelhados. Nós seletivamente amplificam RNA mensageiro polyadenylated de iniciar RNA total usando o T7 com base Eberwine método de amplificação linear, cunhado "T7LA "(T7 amplificação linear). Amplificada O poli-A mRNAs são fragmentados, reverso transcrito e adaptador ligado para produzir a biblioteca seqüenciamento final. Para ambos única corre final ler e emparelhado, as seqüências são mapeados para o transcriptoma humano ⁶ e normalizados para que dados de várias execuções podem ser comparados. Relatamos a medida de expressão gênica em unidades de transcrições por milhão (TPM), que é uma medida superior a RPKM quando se comparam amostras ^7.

Protocol

1. Isolar RNA total

1. Adicionar 1 ml Trizol para as células / tecidos, e homogeneizar com agulha 18-22 gaze se necessário.
2. Adicionar 200 mL de clorofórmio, e girar a 14.000 rpm por 30 minutos a 4 ° C.
3. Retire camada aquosa superior, adicione 0,5 mL de acrilamida linear, em seguida, adicione 500 mL de isopropanol. Deixe descansar em temperatura ambiente por 20 minutos.
4. Giram a 14.000 rpm a 4 ° C, lavar pellet com etanol 70%, e vácuo seco.
5. Ressuspender em 1 mL de água nuclease livre e transferir para tubo de 200 mL PCR.

2. Prepare dupla fita de cDNA

1. Ao acima de 1 RNA mL adicionar 1 ml de 100 M oligo-dT-T7 cartilha transcrição reversa (5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT -3 '), o calor a 70 ° C (bloco de calor) por 5 min, e encaixe legal no gelo.
2. Adicione 1 mL tampão FS 5x, 0,5 mL DTT, 0,5 mL mix dNTP e 0,5 mL RnaseOUT (de SuperScript II kit).
3. Calor a 42° C na máquina de PCR por 1 minuto, em seguida, adicionar 0,5 mL Sobrescrito transcriptase reversa II. Incubar por 1 hora a 42 ° C.
4. Calor a 70 ° C por 10 minutos, arrefecer a 4 ° C.
5. No gelo, adicione o seguinte para a reação acima:

• Água livre de nuclease - 22,75 mL
• 5X tampão vertente Segundo - 7,5 mL
• dNTP mix - 0,75 mL
• E. coli DNA Ligase - 0,25 mL
• E. coli DNA polimerase - 1 ml
• RnaseH - 0,25 mL

Incubar por 2 horas a 16 º C, em seguida, adicionar 1 mL T4 DNA polimerase, e incubar por mais 10 minutos a 16 ° C.

6. Transferência para 1,5 tubo eppendorf ml, e adicionar 80 mL de água.
7. Adicionar 0,5 mL de acrilamida linear.
8. Adicionar 72 mL 3 M e 480 mL NH4OAc de etanol a 100% frio. Precipitar para 1 hr a -20 ° C.
9. Giram a 14.000 rpm a 4 ° C por 30 minutos, lave com 1 mL de etanol a 70%, centrifugar a 14.000 rpm por 2minutos, a vácuo e seco por aproximadamente 10 minutos.

3. Amplificar poli-A do mRNA por transcrição in vitro

1. Ressuspender acima cDNA em 3,5 mL de água livre de nuclease.
2. Ao acima, adicionar 1 ml cada um dos dNTPs (4 mL total), 1 ml de tampão de reação 10X e 1 ml de polimerase T7, e 0,5 mL de RnaseOUT de kit Megascript.
3. Incubar a 37 ° C na máquina de PCR durante a noite.
4. Pronto para o próximo passo. Podem ser armazenadas a -80 ° C.

4. Fragmentação do amplificada poli-A do mRNA

1. Adicionar 26 mL de água a reação acima e 4 mL de reagente fragmentação 10x.
2. Calor na máquina de PCR em 70 ° C por exatamente sete minutos.
3. Adicionar 5 mL de tampão parar de fragmentação, coloque amostra no gelo.

5. RNA limpar

1. Para a reação acima, adicionar 60 mL de água e 350 uL de tampão RLT de kit MinElute Rneasy, e misture por pipetagem.
2. Adicionar 250 mL de etanol, a mistura por pipetagem e uma pipeta na coluna spin.
3. Giram a 8000 rcf durante 20 segundos.
4. Lavar uma vez com RPE, spin por 20 segundos, lave segunda vez com EtOH 80%, spin por 2 minutos, e coluna seca com 5 minutos de rotação.
5. Eluir RNA em 10 ml de água livre de nuclease.

6. síntese de cDNA

Síntese primeira vertente para a biblioteca ler single:

1. Em um tubo de PCR, adicione o seguinte:

• Fragmentado Poly-A mRNA - 10 ml
• NotI Primer nonamer Random - 1 ml

Incubar a 70 ° C por 5 minutos em termociclador e frio rápido no gelo. NotI Primer Nonamer (-3 5'-TGAATTCGCGGCCGCTCAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT NNNNNNNNN '). A 5 'seqüência proximal é o sítio de restrição NotI enquanto a próxima seqüência até que a região aleatória é o complemento reverso da Illumina B do adaptador seqüência de Chip-Seq kit.

Ao acima, adicione o seguinte sobre o gelo (de SuperScript III kit):

• ML tampão 5X primeira vertente -4
• TDT - 2 l
• dNTP mistura ^* - 1,5 mL

Colocar em termociclador por 2 minutos a 42 ° C, adicione 1 ml de SuperScript transcriptase reversa III, e incubar a 42 ° C por 1h.

* Em vez de dCTP, 5-metil dCTP foi utilizado na mistura dNTP.

Síntese primeira vertente para a biblioteca final emparelhados:

1. Em um tubo de PCR, adicione o seguinte:

• Fragmentado Poly-A mRNA - 10 ml
• Cartilha hexâmero aleatória - 1 ml

Incubar a 65 ° C por 5 minutos em termociclador e frio rápido no gelo.

2. Ao acima, adicione o seguinte sobre o gelo (de SuperScript firststrand III kit):

• Tampão 5X primeira vertente - 4 mL
• TDT - 2 l
• dNTPs (dekit) - 1,5 mL

Colocar em termociclador por 1 min a 45 ° C, adicione 1 ml de SuperScript transcriptase reversa III, e incubar a 45 ° C por 1 hora.

Síntese segunda vertente (para ambas as bibliotecas):

3. Ao acima, adicione o seguinte sobre o gelo (de SuperScript kit II):

• Água (RNase free) - 91 mL
• Tampão 5X Segundo Strand - 30 mL
• dNTPs (de kit) - 3 mL
• E. coli DNA Ligase - 1 ml
• E. coli DNA polimerase - 4 mL
• E. coli RNase H - 1 ml

Misture por inversão do tubo, dá um giro de curto e incubar a 16 ° C por 2 horas.

7. Purify cDNA

1. Purify amostra cDNA com colunas Zymo, eluir em 40 mL de água para leitura individuais e 30 l de água para a biblioteca final emparelhados.

8. Reparo final

Para a biblioteca ler single:

1. Para a 40 mL acima de cDNA, acrescentar:

• Tampão ligase T4 DNA com 10mM ATP - 5 mL
• dNTP mix - 2 l
• DNA polimerase T4 - 1 ml
• Klenow enzima (diluído 1:5 com água para 1U / mL) - 1 ml
• PNK T4 - 1 ml

Incubar no termociclador por 30 minutos a 20 ° C.

Para a biblioteca final emparelhados:

(Use Illumina emparelhado final amostra kit prep)

1. À 30 mL acima cDNA, acrescentar:

• RNase água DNase livre - 45 mL
• Tampão ligase T4 DNA com 10mM ATP - 10 ml
• 10mM mix dNTP - 4 mL
• DNA polimerase T4 - 5 mL
• Klenow enzima - 1 ml
• PNK T4 - 5 mL

Incubar no termociclador por 30 minutos a 20 ° C.

9. limpeza cDNA

1. C lean up cDNA colunas usando Zymo. Eluir em 34 mL de EB para leitura individuais e 32 mL de EB para a biblioteca final emparelhados.

10. Adicionar 'A' bases para acabar com a 3 'dos ​​fragmentos de DNA

Para a biblioteca ler single:

1. Prepare a mistura de reacção seguinte:

• Amostra de DNA - 34 mL
• Klenow buffer - 5 mL
• dATP - 10 ml
• Klenow exo - 1 ml

Incubar por 30 minutos a 37 ° C.

Para a biblioteca final emparelhados:

1. Prepare a mistura de reacção seguinte:

• Amostra de DNA - 32 mL
• Klenow buffer - 5 mL
• dATP - 10 ml
• Klenow exo - 3 mL

Incubar por 30 minutos a 37 ° C.

11. limpeza cDNA

1. Limpar cDNA colunas zymo usando. Eluir em 10 ml de EB.

12. Ligadura adaptador

jove_step "> Para ler única biblioteca:

(Use Illumina Chip-Seq amostra prep kit)

1. Prepare a mistura de reacção seguinte:

• Amostra de DNA - 10 ml
• Adaptador Oligo Mix - 1 ml
• 2X DNA Ligase mL-Buffer -15
• DNA ligase - 4 mL

Incubar por 15 minutos em temperatura ambiente. Adaptadores devem ser descongeladas em gelo e 01:20 diluída.

Para a biblioteca final emparelhados:

(Use Illumina emparelhado final amostra kit prep)

1. Prepare a mistura de reacção seguinte:

• Amostra de DNA - 10 ml
• PE Adapter Mix Oligo - 10 ml
• 2X tampão de DNA Ligase - 25 mL
• DNA ligase - 5 mL

Incubar por 15 minutos a 20 ° C. Adaptadores devem ser descongeladas em gelo e 01:20 diluída.

13. Reação ligadura limpar

1. Limpar a reação utilizando ligadura zycolunas mo. Eluir em 44 mL de água para a biblioteca ler único e 6 mL de EB seguido por outro de eluição em 5 mL de EB para a biblioteca final emparelhados.

Realizar uma digestão NotI, SOMENTE para a biblioteca ler única

• cDNA - 44 mL
• NEB tampão 3-5 mL
• BSA - 0,5 mL
• NotI - 1 ml

Incubar por 2 horas durante a noite a 37 ° C, ea reação purificar utilizando coluna zymo. Eluir com 6 mL de tampão EB seguido por um segundo eluição com 5 mL de EB.

14. Purificação tamanho da seleção / Gel

Execute o seguinte usando a 2% Sybr Seguro E-Gel da Invitrogen.

1. Executar Programa 0-PreRun 2 minutos.
2. Carga 1kb plus escada da Invitrogen 01:04 diluída, e carregar 10 ml.
3. Carregar todos amostra de DNA, e encher pistas vazio com 10 ml de água.
4. Executar Programa 1-Egel 2% Run 28 minutos.
5. Selecione o tamanho 200-300 bp gel slice com uma lâmina de barbear fresco.

15. Eluir o DNA de fatia gel

1. Pesar fatia gel, e adicionar 3 volumes de tampão QG para 1 volume de gel (use kit Extraction Gel de Qiagen)
2. Incubar a 50 ° C por 10 minutos ou até que fatia gel se dissolve.
3. Adicionar um volume de ispropanol, e misturar por inversão ou pipetagem.
4. Adicionar a girar coluna, por 1 minuto em velocidade máxima, e descartar por escoamento.
5. Adicionar 500 mL de tampão QG para a coluna, spin por 1 minuto em velocidade máxima, e descartar fluir.
6. Adicionar 750 mL de tampão PE à coluna, spin por 1 minuto em velocidade máxima, e descartar fluir.
7. Centrifugar por 1 minuto em velocidade máxima.
8. Eluir em 36 mL de EB para leitura individuais e 23 mL para a biblioteca EB final emparelhados.

16. PCR

Para a biblioteca ler single:

(Use Illumina Chip-Seq amostra prep kit)

1. Prepare o following mistura de reacção da PCR:

• DNA - 36 mL
• Phusion tampão 5X - 10 ml
• dNTP mix - 1,5 mL
• PCR primário 1,1-1 mL
• PCR primário 2,1-1 mL
• Polimerase Phusion - 0,5 mL

Use o seguinte protocolo de PCR:

• 30 segundos a 98 ° C
• 10 ciclos de:
  • 10 segundos a 98 ° C
  • 30 segundos a 65 ° C
  • 30 segundos a 72 ° C
• 5 minutos a 72 ° C
• Segure a 4 ° C

^* A primeira vez que o kit é usado, diluir PCR primers 1:2 com tampão EB.

Para a biblioteca final emparelhados:

(Use Illumina emparelhado final amostra kit prep)

1. Prepare a reação de PCR seguinte:

• DNA - 23 mL
• Polimerase DNA Phusion - 25 mL
• PCR primário PE 1,1-1 mL
• PCR primário PE 2.1 -1 ml

Amplificar usando o seguinte protocolo de PCR:

1. 30 segundos a 98 ° C
2. 10 ciclos de:
   • 10 segundos a 98 ° C
   • 30 segundos a 65 ° C
   • 30 segundos a 72 ° C
3. 5 minutos a 72 ° C
4. Segure a 4 ° C

^* A primeira vez que o kit é usado, diluir PCR primers 1:2 com tampão EB.

17. Biblioteca de limpar

1. Limpar biblioteca usando colunas zymo. Eluir em 12 mL de EB

18. Quantificar biblioteca

1. Biblioteca quantificar usando Qubit. Ele está pronto para o seqüenciamento. Use primers de seqüenciamento de Illumina kit geração leu único cluster V4 ou superior para biblioteca de leitura simples e Illumina emparelhado final kit geração de clusters V4 ou superior para biblioteca final emparelhados.

19. A análise dos dados

Bowtie ⁶ foi usado para map lê para o conjunto de genes RefSeq (NCBI Construir 36.1). O fim único lê (30 nucleotídeos) e lê o final par (42 nucleotídeos) foram mapeadas, permitindo até 10 partidas para o conjunto de genes, e permitindo até dois desencontros por ler. Transcrições por milhão (TPM) valores foram obtidos para medir a expressão gênica usando RSEM ⁷ (RNA-Seq por Expectation-Maximization).

20. Resultados representativos: Fizemos T7LA bibliotecas para tanto o fim único de leitura e emparelhado vai de 1 mg, 100 mg, 10 mg, 1 mg e 100 pg começando RNA total (Figura 1). Para avaliação do nosso protocolo, fizemos única leitura e bibliotecas emparelhado fim sem amplificação T7 RNA a partir de 10 mg RNA totais Essas bibliotecas de controle, denominado "MinAmp", têm amplificação mínimo. A amplificação só eles sofrem são os 10 ciclos de PCR perto do final do protocolo para ligadura dos adaptadores Illumina seqüenciamento, um passo comum a todas as bibliotecas. Todos usados ​​RNA foram isoladas de H14células tronco embrionárias humanas ^8.

Primeiro, avaliamos o número de genes identificados por várias bibliotecas (Tabela 1 e Tabela Complementar 1). Para ambas as bibliotecas único fim ler e emparelhado, a 10 bibliotecas ng T7LA identificados quase o mesmo número de genes como as bibliotecas MinAmp 10 mg, com uma TPM de 10 ou mais. No caso das bibliotecas única leitura, a 10 ng T7LA biblioteca identificados em 100% dos 8.500 genes identificados pela biblioteca mcg 10 sem amplificação. Para bibliotecas final emparelhados, a 10 ng T7LA biblioteca identificou 86% dos genes identificados pela biblioteca mcg 10 sem amplificação (7.961 de 9267 genes). Bibliotecas feita a partir de menos de 10 ng não foram capazes de identificar como muitos genes. Por exemplo, no protocolo de leitura única, a uma biblioteca ng identificado apenas ~ 50% dos genes identificados pela biblioteca MinAmp 10 mg, levando-nos para limitar a menor quantidade de RNA total para uso com o protocolo T7LA a 10 ng. Além disso, o mapeamento de um gene housekeeping, GAPDH (Figura 2) mostra que todas as bibliotecas T7LA feitas com, pelo menos, 10ng de RNA a partir identificados todos os exons, incluindo os 5 extrema "exon. Comparação dos 10 ng T7LA única bibliotecas final ler e emparelhado com as bibliotecas MinAmp mostra um alto grau de similaridade (correlação de Spearman, R = 0,90 e 0,95, respectivamente, Figuras 3a e b). Também comparamos as duas bibliotecas único fim ler e emparelhado feita a partir de 10 ng de RNA total e eles tiveram um coeficiente de correlação muito alta (R = 0,92), demonstrando que ambos os tipos de bibliotecas feitas usando o protocolo T7LA produzir uma assinatura expressão muito semelhante gene ( Figura 3c.). Assim, o método T7LA é capaz de produzir bibliotecas de sequenciamento que são tão confiáveis ​​e abrangentes como as bibliotecas MinAmp, mas a partir de 1000 vezes menos material de partida.

Figura 1 Esquema de final par e protocolo de preparação única leitura da biblioteca.

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Figura 2 Uma imagem browser genoma de um gene housekeeping, GAPDH, para todas as bibliotecas único fim ler e emparelhados. A barra de escala à esquerda para as bibliotecas única leitura indica 350 Total de leituras. A barra de escala no centro para as bibliotecas final emparelhado indica 5000 Total de leituras. O eixo horizontal representa a seqüência do genoma de GAPDH.

Figura 3 Correlação de expressões de genes entre as várias bibliotecas (Spearman):. A. Entre única leia 10 ng T7LA e 10 mg biblioteca MinAmp mostra que ambas as bibliotecas têm um padrão de expressão de genes muito semelhantes (R = 0,90) B. Entre o final emparelhado 10 ng T7LA e 10 mg biblioteca MinAmp demonstra sua semelhança de perfis de expressão gênica (R = 0,95). C. Correlação de gene excompressões entre 10 ng final emparelhados e 10 ng única bibliotecas ler mostram um alto grau de semelhança entre estas bibliotecas preparadas pelo método T7LA (R = 0,92).

Figura 4 Identificação de genes5 células-tronco embrionárias humanas específicas de todas as bibliotecas único fim ler e emparelhados.

Biblioteca	Tipo °	Clusters primas	Clusters% passando filtro	Alinhando% no genoma	Taxa de erro%	Genes identificados
MinAmp 10ug	Leitura única	225.602 + / - 4952	65,48 + / - 2,58	47,61 + / - 0,53	0,62 + / - 0,06	8500
1UG T7LA	Leitura única	144.818 + / - 6513	82,21 + / - 6,45	48,09 + / - 0,27	0,42 + / - 0,03	8757
100ng T7LA	Leitura única	27.385 + / - 1818	81,33 + / - 11,75	44,46 + / - 4,53	0,49 + / - 0,10	8709
10ng T7LA	Leitura única	11.184 + / - 985	60,70 + / - 3,70	14,96 + / - 1,15	0,99 + / - 0,30	8589
1ng T7LA	Leitura única	12.695 + / - 1365	53,27 + / - 16,76	4,08 + / - 0,79	2,25 + / - 1,56	4720
100PG T7LA	Leitura única	10.390 + / - 1398	72,99 + / - 2,90	1,48 + / - 0,20	1,51 + / - 0,39	1121
MinAmp 10ug	R1 End emparelhado	95.786 + / - 12937	90,77 + / - 2,79	58,50 + / - 0,95	0,94 + / - 0,38	9267
	R2 End emparelhado	95.786 + / - 12937	90,77 + / - 2,79	58,13 + / - 1,13	0,99 + / - 0,37
1UG T7LA	R1 End emparelhado	297.669 + / - 10196	91,35 + / - 0,36	46,89 + / - 0,14	0,47 + / - 0,01	7334
	R2 End emparelhado	297.669 + / - 10196	91,35 + / - 0,36	45,52 + / - 0,12	0,51 + / - 0,01
100ng T7LA	R1 End emparelhado	205.602 + / - 9932	90,53 + / - 0,76	63,44 + / - 1,00	0,48 + / - 0,02	8011
	R2 End emparelhado	205.602 + / - 9932	90,53 + / - 0,76	61,80 + / - 8,09	0,60+ / - 0,36
10ng T7LA	R1 End emparelhado	214.622 + / - 11155	89,98 + / - 1,13	56,32 + / - 1,94	0,80 + / - 0,26	7961
	R2 End emparelhado	214.622 + / - 11155	89,98 + / - 1,13	46,41 + / - 18,39	2,48 + / - 2,68	;
1ng T7LA	R1 End emparelhado	144.951 + / - 19841	90,54 + / - 1,19	3,91 + / - 0,16	8,71 + / - 0,86	8124
	R2 End emparelhado	144.951 + / - 19841	90,54 + / - 1,19	3,27 + / - 1,21	9,11 + / - 3,52
100PG T7LA	R1 End emparelhado	187.600 + / - 11759	89,52 + / - 1,11	1,78 + / - 0,05	13,42 + / - 0,50	6623
R2 End emparelhado	187.600 + / - 11759	89,52 + / - 1,11	1,99 + / - 0,23	15,29 + / - 0,96

° R1 e R2 são frente e verso, sequências de uma tag
* ≥ 10 TPM

Tabela Informações 1. Sobre os números de cluster, genes identificados, a taxa de erro, o alinhamento por cento da única bibliotecas final ler e emparelhados.

Tabela Suplementar 1. Lista de todos os genes e seus valores de TPM para todas as amostras, leia única e emparelhado fim.

Discussion

Protocolos atuais para fazer bibliotecas final emparelhados exigem entre 1 mg ^9-2,5 mg ¹⁰ montante inicial de RNA total. Aqui apresentamos a nossa linear de amplificação T7 método (T7LA) com base para preparar a única bibliotecas final ler e emparelhado Illumina seqüenciamento e mostrar que este método permite a geração de bibliotecas de tão baixo quanto 10 ng de RNA total, produzindo dados que é comparável à de minimamente amplificado (MinAmp) bibliotecas feitas a partir de 1000 o material de partida vezes mais (10 mg RNA total). As 10 bibliotecas ng não só identificar semelhante o número total de genes, mas também produzem assinaturas de expressão gênica que são semelhantes (Figuras 3a e b). Além disso, tanto o single bibliotecas final ler e pares produzidas pelo método T7LA são muito semelhantes entre si (Figura 3c), que permite aos pesquisadores comparar os dados gerados pelas bibliotecas feitas a partir de qualquer protocolo. Uma vez que essas bibliotecas foram preparados a partir de RNA humano de células-tronco embrionárias, buscamosde 30 genes de células-tronco específicas entre as bibliotecas e descobrir que quase todos esses genes (93-100%) são identificadas pelas bibliotecas feita a partir de pelo menos 10 ng de RNA total de partida (Figura 4), validando o nosso protocolo. Acreditamos que o nosso protocolo seria muito útil para pesquisadores, especialmente em circunstâncias como as células de fluxo classificados ou a laser micro-dissecados tecidos onde o material de partida é limitante. Em tais circunstâncias, o nosso protocolo permitiria a geração de dados de expressão gênica comparável às bibliotecas feita a partir de quantidades muito maiores de partida desde o nosso protocolo produz perfis de expressão comparáveis ​​entre pelo menos 3 ordens de magnitude de RNA de partida.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fragmentation reagent	Ambion	AM8740
Liner Acrylamide	Ambion	AM9520
MEGAscript T7 Kit	Ambion	AM1334
Non DEPC treated nuclease free water	Ambion	AM9932
dNTP set	Fermentas	R0181
methylated dNTPs	Fermentas	R0431	For Single Read sample prep only
TruSeq SR Cluster Generation kit v5	Illumina	GD-203-5001	For Single Read sample prep only
TruSeq Seq Kit v5 36 cycles	Illumina	FC-104-5001
Chip Seq Sample Prep Kit	Illumina	IP-102-1001	For Single Read sample prep only. Can be replaced with NEB DNA sample prep Master Mix Set 1 Cat# E6040S
TruSeq PE Cluster Generation kit v5	Illumina	PE-203-5001	For paired end sample prep only
Paired End Sample Prep Kit	Illumina	PE-102-1001	For paired end sample prep only
1kb plus ladder	Invitrogen	10787-018
E. coli Rnase H	Invitrogen	18021-014
Rnase Out	Invitrogen	10777-019
2nd strand buffer 5x	Invitrogen	10812-014
E. coli DNA polymerase	Invitrogen	18010-017
E-gel SYBR safe 2%	Invitrogen	G521802
Superscript III (with 5X FS buffer and 0.1M DTT)	Invitrogen	18080-085
Trizol	Invitrogen	12183555
RNA quibit assay kit	Invitrogen	Q32852
dsDNA HS qubit assay kit	Invitrogen	Q32851
E. coli DNA ligase	Invitrogen	18052-019
T4 DNA Polymerase	Invitrogen	18005-025
Ultra Pure Dnase Rnase water	Invitrogen	10977-015
Superscript II double stranded cDNA synthesis kit	Invitrogen	11917-020
Random Primer (invitrogen)	Invitrogen	48190-011	For paired end sample prep only
Not1Nonamer B primer	IDT	N/A	For Single Read sample prep only
Oligo dT T7	IDT	N/A
Not1 digestion kit	New England Biolabs	R0189S	For Single Read sample prep only
Rneasy Minelute kit	Qiagen	74204
RNEasy Mini Kit (50)	Qiagen	74104
Gel purification kit	Qiagen	28604
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