एकल पढ़ें और बनती अंत mRNA Seq 10 कुल शाही सेना nanograms से Illumina पुस्तकालय
Summary
यहाँ हम दोनों एकल पढ़ सकते हैं और बनती जीन अभिव्यक्ति T7 रैखिक आरएनए प्रवर्धन पर आधारित विश्लेषण के लिए अंत Illumina mRNA Seq अनुक्रमण पुस्तकालयों की तैयारी के लिए एक विधि का वर्णन. इस प्रोटोकॉल कुल शाही सेना के शुरू के केवल 10 nanograms की आवश्यकता है और अत्यधिक अनुरूप पूरे टेप का प्रतिनिधित्व पुस्तकालयों उत्पन्न करता है.
Abstract
Whole transcriptome sequencing by mRNA-Seq is now used extensively to perform global gene expression, mutation, allele-specific expression and other genome-wide analyses. mRNA-Seq even opens the gate for gene expression analysis of non-sequenced genomes. mRNA-Seq offers high sensitivity, a large dynamic range and allows measurement of transcript copy numbers in a sample. Illumina’s genome analyzer performs sequencing of a large number (> 107) of relatively short sequence reads (< 150 bp).The "paired end" approach, wherein a single long read is sequenced at both its ends, allows for tracking alternate splice junctions, insertions and deletions, and is useful for de novo transcriptome assembly.
One of the major challenges faced by researchers is a limited amount of starting material. For example, in experiments where cells are harvested by laser micro-dissection, available starting total RNA may measure in nanograms. Preparation of mRNA-Seq libraries from such samples have been described1, 2 but involves significant PCR amplification that may introduce bias. Other RNA-Seq library construction procedures with minimal PCR amplification have been published3, 4 but require microgram amounts of starting total RNA.
Here we describe a protocol for the Illumina Genome Analyzer II platform for mRNA-Seq sequencing for library preparation that avoids significant PCR amplification and requires only 10 nanograms of total RNA. While this protocol has been described previously and validated for single-end sequencing5, where it was shown to produce directional libraries without introducing significant amplification bias, here we validate it further for use as a paired end protocol. We selectively amplify polyadenylated messenger RNAs from starting total RNA using the T7 based Eberwine linear amplification method, coined "T7LA" (T7 linear amplification). The amplified poly-A mRNAs are fragmented, reverse transcribed and adapter ligated to produce the final sequencing library. For both single read and paired end runs, sequences are mapped to the human transcriptome6 and normalized so that data from multiple runs can be compared. We report the gene expression measurement in units of transcripts per million (TPM), which is a superior measure to RPKM when comparing samples7.
Protocol
1. कुल शाही सेना पृथक कोशिकाओं / ऊतक 1ml Trizol जोड़ें, और 18-22 धुंध यदि आवश्यक सुई के साथ homogenize. 200 μl, क्लोरोफॉर्म और 4 में 30 मिनट के लिए 14,000 rpm पर स्पिन ° सी. जोड़ें शीर्ष जलीय परत लो, 0.5 μl रैखिक acrylamide जोड़ते हैं, तो 500 μl isopropanol जोड़ें. 20 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर बैठ चलो. 4 डिग्री सेल्सियस, धोने गोली में 70% इथेनॉल के साथ 14,000 rpm, और सूखी वैक्यूम पर स्पिन. 1 μl nuclease मुफ्त पानी और 200 μl पीसीआर ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण में Resuspend है. 2. तैयार डबल सीडीएनए फंसे ऊपर 1 μl शाही सेना oligo-dt-T7 रिवर्स प्रतिलेखन प्राइमर (5'-GGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT '-3) 100 सुक्ष्ममापी की एक μl, 70 पर गर्मी जोड़ने ° 5 मिनट, और बर्फ पर शांत तस्वीर के लिए सी (गर्मी ब्लॉक). 1 μl 5x एफएस बफर, 0.5 μl डीटीटी, 0.5 μl dNTP मिश्रण और 0.5 μl RnaseOUT (सुपरस्क्रिप्ट द्वितीय किट से) जोड़ें. से 42 गर्मीडिग्री सेल्सियस पीसीआर मशीन में 1 मिनट के लिए, तो 0.5 μl सुपरस्क्रिप्ट द्वितीय रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस जोड़ने. 42 पर 1 घंटे के लिए सेते डिग्री सेल्सियस 70 में हीट ° 10 मिनट के लिए सी, शांत करने के लिए 4 डिग्री सेल्सियस बर्फ पर, ऊपर प्रतिक्रिया के लिए निम्नलिखित जोड़ें: Nuclease मुफ्त पानी – 22.75 μl 5X दूसरा कतरा बफर – 7.5 μl dNTP मिश्रण 0.75 μl – – ई. कोलाई डीएनए ligase 0.25 μl ई. कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ – 1 μl RnaseH – 0.25 μl 16 पर 2 घंटा के लिए सेते ° सी तो एक μl टी -4 डीएनए पोलीमरेज़ जोड़ने के लिए, और 16 पर अतिरिक्त 10 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस 1.5 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूब के लिए स्थानांतरण, और 80 μl पानी जोड़ें. रैखिक acrylamide का 0.5 μl जोड़ें. 72 μl 3 एम NH4OAc और ठंड 100% इथेनॉल 480 μl जोड़ें. -20 डिग्री सेल्सियस पर 1 घंटे के लिए वेग 14,000 rpm पर 4 पर स्पिन ° सी 30 मिनट के लिए, 1 एमएल 70% इथेनॉल के साथ धोने, 2 के लिए 14,000 rpm पर अपकेंद्रित्रमिनट, और के बारे में 10 मिनट के लिए सूखी वैक्यूम. 3. इन विट्रो प्रतिलेखन में से पाली – एक mRNA बढ़ाना 3.5 μl nuclease मुफ्त पानी में ऊपर सीडीएनए Resuspend. इसके बाद के संस्करण के लिए एक μl dNTPs के प्रत्येक (कुल 4 μl), 1 10X प्रतिक्रिया बफर के μl और T7 पोलीमरेज़ का 1 μl, और Megascript किट से RnaseOUT 0.5 μl जोड़ें. 37 सेते ° सी में पीसीआर मशीन रातोंरात. अगले कदम के लिए तैयार है. -80 पर संग्रहीत किया जा सकता डिग्री सेल्सियस 4. प्रवर्धित पाली mRNA के विखंडन ऊपर प्रतिक्रिया और 4 μl 10x विखंडन अभिकर्मक के लिए पानी की 26 μl जोड़ें. हीट पीसीआर मशीन में 70 डिग्री बिल्कुल 7 मिनट के लिए सी. विखंडन बंद बफर के 5 μl जोड़ें, बर्फ पर नमूना डाल दिया. 5. आरएनए साफ उपरोक्त प्रतिक्रिया करने के लिए, 60 μl पानी और Rneasy MinElute किट से बफर RLT 350 μl और pipetting द्वारा मिश्रण जोड़ें. स्पिन स्तंभ में 250 μl इथेनॉल, pipetting द्वारा मिश्रण है, और विंदुक जोड़ें. 8000 आरसीएफ में 20 सेकंड के लिए स्पिन. RPE, 20 सेकंड के लिए स्पिन के साथ एक बार धो, 80% EtOH 2 मिनट के लिए स्पिन, और 5 मिनट स्पिन के साथ सूखी स्तंभ के साथ दूसरी बार धोने. 10 μl nuclease मुफ्त पानी में Elute आरएनए. 6. सीडीएनए संश्लेषण पहले एकल पढ़ा पुस्तकालय के लिए कतरा संश्लेषण: एक पीसीआर ट्यूब में निम्नलिखित जोड़ें: खंडित mRNA पाली ए – 10 μl चना रैंडम nonamer प्राइमर – 1 μl Thermocycler में 5 मिनट, और बर्फ पर ठंड जल्दी के लिए 70 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. चना Nonamer प्राइमर (5'-TGAATTCGCGGCCGCTCAAGCAGAAGACGGCATACGAGCTCTTCCGATCT NNNNNNNNN -3). 5 'समीपस्थ अनुक्रम चना प्रतिबंध साइट है, जबकि यादृच्छिक क्षेत्र तक अगले अनुक्रम चिप Seq किट से Illumina एडाप्टर बी अनुक्रम के पूरक रिवर्स है. <ol= "2" शुरू> ऊपर करने के लिए, बर्फ पर निम्नलिखित (सुपरस्क्रिप्ट III किट से) जोड़ें: 5X पहली कतरा बफर -4 μl डीटीटी – 2 μl dNTP मिश्रण * – 1.5 μl 2 मिनट के लिए thermocycler पर 42 ° रखो सी, 1 सुपरस्क्रिप्ट III रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के μl जोड़ने के लिए, और 1hr के लिए 42 ° सी में सेते हैं. * DCTP के बजाय, 5 – मिथाइल dCTP dNTP मिश्रण में इस्तेमाल किया गया था. बनती अंत लायब्रेरी के लिए पहले कतरा संश्लेषण: एक पीसीआर ट्यूब में निम्नलिखित जोड़ें: खंडित mRNA पाली ए – 10 μl रैंडम hexamer प्राइमर – 1 μl Thermocycler में 5 मिनट, और बर्फ पर ठंड जल्दी के लिए 65 ° सी में सेते हैं. ऊपर करने के लिए, बर्फ पर निम्नलिखित (सुपरस्क्रिप्ट firststrand III किट से) जोड़ें: 5X पहली कतरा बफर – 4 μl डीटीटी – 2 μl dNTPs (से) किट – 1.5 μl 45 पर 1 मिनट के लिए thermocycler पर रखो ° सी, 1 सुपरस्क्रिप्ट III रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस के μl जोड़ने के लिए, और 1 घंटे के लिए 45 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं. दूसरा कतरा संश्लेषण (दोनों पुस्तकालयों के लिए): ऊपर करने के लिए, बर्फ पर निम्नलिखित (सुपरस्क्रिप्ट द्वितीय किट से) जोड़ें: (RNase) मुक्त जल – 91 μl 5X दूसरा Strand बफर – 30 μl dNTPs (किट से) – 3 μl – ई. कोलाई डीएनए ligase 1 μl ई. कोलाई डीएनए पोलीमरेज़ – 4 μl Μl 1 – ई. कोलाई RNase एच उलटा द्वारा मिश्रण ट्यूब, 2 घंटा के लिए एक छोटी स्पिन और 16 में सेते ° सी दे. 7. सीडीएनए शुद्ध शुद्ध Zymo एकल और बनती अंत लायब्रेरी के लिए पानी की 30 μl पढ़ने के लिए, स्तंभ पानी की 40 μl में elute के साथ सीडीएनए का नमूना. 8. अंत मरम्मत एकल पढ़ा लायब्रेरी के लिए: <p cलड़की = "jove_content"> (Illumina चिप Seq नमूना प्रस्तुत करने का किट का उपयोग करें) सीडीएनए के ऊपर 40 μl जोड़ने: 10mm एटीपी के साथ टी -4 डीएनए ligase बफर – 5 μl dNTP मिश्रण μl 2 – टी -4 डीएनए पोलीमरेज़ – 1 μl Klenow एंजाइम (पानी के साथ 01:05 1U / μl को पतला) – 1 μl टी -4 PNK – 1 μl 20 पर 30 मिनट के लिए थर्मल cycler में सेते डिग्री सेल्सियस बनती अंत लायब्रेरी के लिए: (Illumina बनती अंत नमूना प्रस्तुत करने किट का उपयोग करें) जोड़ने के लिए, ऊपर 30 सीडीएनए μl: RNase DNase मुफ्त पानी – 45 μl 10mm एटीपी के साथ टी -4 डीएनए ligase बफर – 10 μl 10mm dNTP मिश्रण – 4 μl टी -4 डीएनए पोलीमरेज़ – 5 μl Klenow एंजाइम μl – 1 टी -4 PNK – 5 μl 20 पर 30 मिनट के लिए थर्मल cycler में सेते डिग्री सेल्सियस 9. सीडीएनए सफाई सी सीडीएनए का उपयोग Zymo स्तंभों दुबला. एकल पढ़ने के लिए और बनती अंत लायब्रेरी के लिए EB के 32 μl EB के 34 μl में Elute. 10. डीएनए टुकड़े के 3 'अंत तक' ए 'अड्डों जोड़ें एकल पढ़ा लायब्रेरी के लिए: निम्नलिखित प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार: डीएनए नमूना – 34 μl Klenow बफर μl 5 – dATP – 10 μl Klenow exo – μl 1 37 पर 30 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस बनती अंत लायब्रेरी के लिए: निम्नलिखित प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार: डीएनए नमूना – 32 μl Klenow बफर μl 5 – dATP – 10 μl Klenow exo μl 3 – 37 पर 30 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस 11. सीडीएनए सफाई सीडीएनए का उपयोग zymo स्तंभों को साफ करें. EB के 10 μl में Elute. 12. एडाप्टर ligation jove_step "> एकल पढ़ा लायब्रेरी के लिए: (Illumina चिप Seq नमूना प्रस्तुत करने का किट का उपयोग करें) निम्नलिखित प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार: डीएनए नमूना – 10 μl एडाप्टर oligo मिक्स – μl 1 2X डीएनए ligase μl बफर–15 डीएनए ligase μl 4 – कमरे के तापमान पर 15 मिनट के लिए सेते हैं. एडेप्टर बर्फ और पतला 1:20 पर thawed किया जाना चाहिए. बनती अंत लायब्रेरी के लिए: (Illumina बनती अंत नमूना प्रस्तुत करने किट का उपयोग करें) निम्नलिखित प्रतिक्रिया मिश्रण तैयार: डीएनए नमूना – 10 μl पीई एडाप्टर oligo मिक्स – 10 μl 2X डीएनए ligase बफर – 25 μl डीएनए ligase μl 5 – 20 पर 15 मिनट के लिए सेते डिग्री सेल्सियस एडेप्टर बर्फ और पतला 1:20 पर thawed किया जाना चाहिए. 13. Ligation प्रतिक्रिया साफ साफ ligation प्रतिक्रिया का उपयोग zyमो स्तंभों. एकल पढ़ा पुस्तकालय और EB के 6 μl बनती अंत पुस्तकालय के लिए EB के 5 μl में एक क्षालन द्वारा पीछा के लिए पानी की 44 μl में Elute. चना पाचन प्रदर्शन, केवल एक को पढें लायब्रेरी के लिए सीडीएनए – 44 μl चोंच बफर 3 – 5 μl BSA – 0.5 μl चना – 1 μl 37 डिग्री सेल्सियस, और शुद्ध zymo स्तंभ का उपयोग कर प्रतिक्रिया पर 2 घंटा के लिए रात भर के लिए सेते हैं. बफर EB के 6 μl के साथ Elute EB के 5 μl के साथ एक दूसरे क्षालन द्वारा पीछा किया. 14. साइज शुद्धि / चयन जेल निम्नलिखित Invitrogen से एक 2% Sybr सुरक्षित ई – जेल का उपयोग कर प्रदर्शन. 0-PreRun कार्यक्रम 2 मिनट चलाएँ. प्लस Invitrogen पतला 01:04 से 1kb सीढ़ी लोड, और 10 μl लोड. डीएनए नमूने के सभी लोड, और पानी की 10 μl के साथ खाली गलियों भरने. कार्यक्रम चलाने 1 EGel 2% 28 मिनट चलाएँ. साइज 200-300 बीपी जेल slic का चयन करेंएक ताजा रेजर ब्लेड के साथ ई. 15. जेल टुकड़ा से Elute डीएनए जेल टुकड़ा वजन, और जेल के 1 मात्रा (Qiagen से उपयोग जेल निकालना किट) के लिए Qg बफर के 3 खंडों को जोड़ने 50 में सेते डिग्री सेल्सियस 10 मिनट के लिए या जब तक जेल टुकड़ा घुल. 1 ispropanol की मात्रा, और उलटा या pipetting द्वारा मिश्रण जोड़ें. स्तंभ स्पिन, अधिकतम गति से 1 मिनट के लिए जोड़ें, और प्रवाह के माध्यम से त्यागें. स्तंभ के लिए Qg बफर के 500 μl, अधिकतम गति से 1 मिनट के लिए स्पिन जोड़ें, और के माध्यम से प्रवाह त्यागें. स्तंभ बफर पीई के 750 μl जोड़ें करने के लिए, अधिकतम गति से 1 मिनट के लिए स्पिन, और के माध्यम से प्रवाह त्यागें. अधिकतम गति से 1 मिनट के लिए अपकेंद्रित्र. एकल पढ़ने के लिए और बनती अंत पुस्तकालय के लिए 23 μl EB EB के 36 μl में Elute. 16. पीसीआर एकल पढ़ा लायब्रेरी के लिए: (Illumina चिप Seq नमूना प्रस्तुत करने का किट का उपयोग करें) Followin तैयारजी पीसीआर प्रतिक्रिया मिश्रण: डीएनए – 36 μl 5X Phusion बफर – 10 μl dNTP मिश्रण 1.5 μl – पीसीआर 1.1 प्राइमर – 1 μl पीसीआर प्राइमर 2,1 – 1 μl Phusion पोलीमरेज़ – 0.5 μl निम्नलिखित पीसीआर प्रोटोकॉल का प्रयोग करें: 98 पर 30 सेकंड डिग्री सेल्सियस 10 चक्रों: 98 पर 10 सेकंड डिग्री सेल्सियस 65 में 30 सेकंड डिग्री सेल्सियस 72 सी सेंटीग्रेड पर 30 सेकंड 72 पर 5 मिनट डिग्री सेल्सियस 4 में रुको डिग्री सेल्सियस * पहली बार है कि किट का प्रयोग किया जाता है, EB बफर के साथ पीसीआर प्राइमरों 01:02 पतला. बनती अंत लायब्रेरी के लिए: (Illumina बनती अंत नमूना प्रस्तुत करने किट का उपयोग करें) निम्न पीसीआर प्रतिक्रिया तैयार: डीएनए – 23 μl Phusion डीएनए पोलीमरेज़ – 25 μl पीसीआर प्राइमर 1.1 पीई – 1 μl पीसीआर प्राइमर पीई 2.1 -1 μl निम्नलिखित पीसीआर प्रोटोकॉल का उपयोग बढ़ाना: 98 पर 30 सेकंड डिग्री सेल्सियस 10 चक्रों: 98 पर 10 सेकंड डिग्री सेल्सियस 65 में 30 सेकंड डिग्री सेल्सियस 72 सी सेंटीग्रेड पर 30 सेकंड 72 पर 5 मिनट डिग्री सेल्सियस 4 में रुको डिग्री सेल्सियस * पहली बार है कि किट का प्रयोग किया जाता है, EB बफर के साथ पीसीआर प्राइमरों 01:02 पतला. 17. पुस्तकालय साफ Zymo स्तंभों का उपयोग पुस्तकालय साफ. EB के 12 μl में Elute 18. Quantitate पुस्तकालय Quantitate पुस्तकालय का उपयोग Qubit. यह अनुक्रमण के लिए तैयार है. Illumina एकल पढ़ा क्लस्टर पीढ़ी V4 या एकल लायब्रेरी पढ़ा और Illumina बनती अंत क्लस्टर पीढ़ी V4 या बनती अंत पुस्तकालय के लिए उच्च किट के लिए उच्च किट से प्राइमरों अनुक्रमण का प्रयोग करें. 19. डेटा विश्लेषण 6 bowtie मीटर करने के लिए इस्तेमाल किया गया थाएपी RefSeq जीन सेट (NCBI गठन 36.1) पढ़ता है. एकल अंत (30 nucleotides) पढ़ता है और जोड़ी के अंत (42 nucleotides) पढ़ता थे जीन सेट करने के लिए 10 मैचों के लिए अनुमति है, और को पढें प्रति दो बेमेल के लिए अनुमति मैप. प्रति लाख मूल्यों (TPM) देखिए RSEM 7 (Seq – उम्मीद – मैक्ज़िमाइज़ेशन द्वारा शाही सेना) का उपयोग करने के लिए जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए प्राप्त किया गया. 20. प्रतिनिधि परिणाम: हम दोनों एकल पढ़ सकते हैं और बनती 1 μg, 100 μg, 10 μg, 1 μg और 100 स्नातकोत्तर कुल शाही सेना (चित्रा 1) शुरू से अंत रन T7LA पुस्तकालयों के लिए बनाया है. हमारे प्रोटोकॉल के मूल्यांकन के लिए, हम एकल पढ़ा और बनती T7 शाही सेना से 10 μg कुल इन नियंत्रण पुस्तकालयों शाही सेना, "MinAmp" करार दिया शुरू प्रवर्धन के बिना अंत पुस्तकालयों, न्यूनतम प्रवर्धन है. केवल प्रवर्धन वे गुजरना प्रोटोकॉल के अंत के पास 10 पीसीआर के चक्र Illumina अनुक्रमण एडेप्टर, कटी घमनी को बांधना सभी पुस्तकालयों के लिए आम कदम हैं. सभी आरएनए प्रयोग किया जाता H14 से अलग किया गयामानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं 8. हम पहले विभिन्न पुस्तकालयों (1 टेबल और पूरक तालिका 1) द्वारा की पहचान की जीन की संख्या का मूल्यांकन. दोनों एकल पढ़ सकते हैं और बनती अंत पुस्तकालयों के लिए, 10 एनजी T7LA पुस्तकालयों 10 μg MinAmp पुस्तकालयों के रूप में 10 या अधिक की एक TPM के साथ जीनों के लगभग एक ही नंबर, पहचान. एकल पढ़ा पुस्तकालयों के मामले में, 10 एनजी T7LA पुस्तकालय 8500 10 μg unamplified पुस्तकालय द्वारा की पहचान की जीन के 100% पहचान की. बनती अंत पुस्तकालयों के लिए, 10 एनजी T7LA पुस्तकालय 10 μg unamplified लायब्रेरी (7961 9267 जीन) द्वारा की पहचान की जीन के 86% की पहचान की. कम से कम 10 एनजी से बने पुस्तकालय के लिए कई जीनों के रूप में पहचान करने में सक्षम नहीं थे. उदाहरण के लिए, एकल को पढें प्रोटोकॉल में, 1 एनजी पुस्तकालय केवल पहचान ~ 10 μg MinAmp पुस्तकालय द्वारा की पहचान की जीन के 50%, 10 एनजी T7LA प्रोटोकॉल के साथ प्रयोग के लिए हमें कुल शाही सेना की न्यूनतम राशि को सीमित करने के लिए उत्साह. इसके अलावा, गृह व्यवस्था जीन की मैपिंग, GAPDH (चित्रा 2) से पता चलता है कि सभी T7LA पुस्तकालयों शुरू शाही सेना के कम से कम 10ng साथ किए गए सभी exons पहचान चरम 5 'एक्सॉन सहित है. 10 एनजी T7LA एकल पढ़ सकते हैं और बनती MinAmp पुस्तकालयों के साथ अंत पुस्तकालयों की तुलना समानता के एक उच्च डिग्री (भाला धारण करनेवाला सिपाही सहसंबंध, आर = 0.90 और 0.95 क्रमशः आंकड़े 3a और ख) से पता चलता है. हम भी दो सिंगल पढ़ सकते हैं और बनती अंत 10 एनजी कुल शाही सेना से बनाया पुस्तकालयों की तुलना में और वे एक बहुत ही उच्च सहसंबंध गुणांक (नि. = 0.92) था, प्रदर्शन है कि दोनों प्रकार के पुस्तकालयों के T7LA प्रोटोकॉल का उपयोग कर एक बहुत ही इसी तरह जीन की अभिव्यक्ति हस्ताक्षर का उत्पादन किया ( चित्रा -3 सी). इसलिए, T7LA विधि अनुक्रमण पुस्तकालयों कि के रूप में विश्वसनीय और MinAmp पुस्तकालयों के रूप में व्यापक कर रहे हैं उत्पादन करने में सक्षम है, लेकिन से 1000 गुना कम सामग्री शुरू. चित्रा 1 बनती अंत के स्कीमा और एकल पढ़ा पुस्तकालय तैयारी प्रोटोकॉल. "jove_content> चित्रा 2 एक गृह व्यवस्था जीन, सभी एकल पढ़ सकते हैं और बनती अंत पुस्तकालयों के लिए GAPDH, एक जीनोम ब्राउज़र तस्वीर . एकल पढ़ा पुस्तकालयों के लिए बाईं तरफ के पैमाने पर पट्टी इंगित करता है 350 कुल पढ़ता है. बनती अंत पुस्तकालयों के लिए केंद्र में पैमाने पर पट्टी इंगित करता है 5000 कुल पढ़ता है. क्षैतिज अक्ष GAPDH के जीनोम अनुक्रम का प्रतिनिधित्व करता है. चित्रा विभिन्न पुस्तकालयों (भाला धारण करनेवाला सिपाही) के बीच जीन अभिव्यक्ति के सहसंबंध 3: ए के बीच एकल 10 एनजी T7LA और 10 μg MinAmp पुस्तकालय से पता चलता है कि इन दोनों पुस्तकालयों एक बहुत ही इसी तरह जीन की अभिव्यक्ति पैटर्न (नि. = 0.90) बी पढ़ा बनती अंत के बीच 10 एनजी T7LA और 10 μg MinAmp पुस्तकालय जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल की उनकी समानता (नि. = 0.95) जीन पूर्व सी. सहसंबंध को दर्शाता है.10 एनजी बनती अंत और 10 एनजी एकल पढ़ा पुस्तकालयों के बीच pressions T7LA विधि (नि. = 0.92) द्वारा तैयार इन पुस्तकालयों के बीच समानता के एक उच्च डिग्री दिखा. सभी एकल पढ़ सकते हैं और बनती अंत पुस्तकालयों से मानव भ्रूण स्टेम सेल विशिष्ट genes5 के 4 पहचान चित्रा. पुस्तकालय प्रकार ° कच्चे क्लस्टर % फ़िल्टर गुजर क्लस्टर जीनोम को संरेखित% % त्रुटि दर जीन की पहचान की MinAmp 10ug सिंगल को पढें 225,602 + / – 4952 65.48 + / – 2.58 47.61 + / – 0.53 0.62 + / – 0.06 8500 1ug T7LA सिंगल को पढें +१,४४,८१८ + / – 6513 82.21 + / – 6.45 48.09 + / – 0.27 0.42 + / – 0.03 8757 100ng T7LA सिंगल को पढें 27,385 + / – 1818 81.33 + / – 11.75 44.46 + / – 4.53 0.49 + / – 0.10 8709 10ng T7LA सिंगल को पढें 11,184 + / – 985 60.70 + / – 3.70 14.96 + / – 1.15 0.99 + / – 0.30 8589 1ng T7LA सिंगल को पढें 12,695 + / – 1365 53.27 + / – 16.76 4.08 + / – 0.79 2.25 + / – 1.56 4720 100pg T7LA सिंगल को पढें 10,390 + / – 1398 72.99 + / – 2.90 1.48 + / – 0.20 1.51 + / – 0.39 1121 MinAmp 10ug बनती अंत R1 ९५,७८६ + / – 12937 90.77 + / – 2.79 58.50 + / – 0.95 0.94 + / – 0.38 9267 बनती अंत R2 ९५,७८६ + / – 12937 90.77 + / – 2.79 58.13 + / – 1.13 0.99 + / – 0.37 1ug T7LA बनती अंत R1 297,669 + / – 10196 91.35 + / – 0.36 46.89 + / – 0.14 0.47 + / – 0.01 7334 बनती अंत R2 297,669 + / – 10196 91.35 + / – 0.36 45.52 + / – 0.12 0.51 + / – 0.01 100ng T7LA बनती अंत R1 205,602 + / – 9932 90.53 + / – 0.76 63.44 + / – 1.00 0.48 + / – 0.02 8011 बनती अंत R2 205,602 + / – 9932 90.53 + / – 0.76 61.80 + / – 8.09 0.60+ / – 0.36 10ng T7LA बनती अंत R1 214,622 + / – 11155 89.98 + / – 1.13 56.32 + / – 1.94 0.80 + / – 0.26 7961 बनती अंत R2 214,622 + / – 11155 89.98 + / – 1.13 46.41 + / – 18.39 2.48 + / – 2.68 ; 1ng T7LA बनती अंत R1 १,४४,९५१ + / – 19841 90.54 + / – 1.19 3.91 + / – 0.16 8.71 + / – 0.86 8124 बनती अंत R2 १,४४,९५१ + / – 19841 90.54 + / – 1.19 3.27 + / – 1.21 9.11 + / – 3.52 100pg T7LA बनती अंत R1 187,600 + / – 11759 89.52 + / – 1.11 1.78 + / – 0.05 13.42 + / – 0.50 6623 </p> बनती अंत R2 187,600 + / – 11759 89.52 + / – 1.11 1.99 + / – 0.23 15.29 + / – 0.96 ° R1 और R2 आगे रहे हैं और एक टैग के दृश्यों रिवर्स * 10 ≥ TPM टेबल क्लस्टर नंबर पर सूचना 1. जीनों की पहचान की है, त्रुटि दर, एकल पढ़ सकते हैं और बनती अंत पुस्तकालयों का प्रतिशत संरेखण . पूरक तालिका 1. सभी और सभी नमूनों के लिए जीन उनके TPM मूल्यों की सूची, एक पढ़ा और अंत बनती.
Discussion
1 μg 9 से 2.5 μg 10 कुल शाही सेना के शुरू राशि के बीच बनती अंत पुस्तकालयों बनाने के लिए वर्तमान प्रोटोकॉल की आवश्यकता है. यहाँ हम हमारे रैखिक T7 प्रवर्धन आधारित (T7LA) विधि दोनों एकल पढ़ सकते हैं और बनती अंत Illumina अनुक्रमण पुस्तकालयों और दिखाने को तैयार है कि इस विधि की अनुमति देता है मौजूद कुल शाही सेना के रूप में कम के रूप में 10 एनजी से पुस्तकालयों, डेटा है कि के बराबर है उत्पादन की पीढ़ी न्यूनतम प्रवर्धित (MinAmp) 1000 गुना अधिक प्रारंभिक सामग्री (10 μg कुल शाही सेना) से बनाया पुस्तकालयों. 10 एनजी पुस्तकालयों इसी तरह जीन की कुल संख्या केवल पहचान नहीं है, लेकिन यह भी जीन की अभिव्यक्ति हस्ताक्षर है कि समान हैं (आंकड़े 3a और ख) का उत्पादन. इसके अलावा, दोनों एकल पढ़ सकते हैं और बनती अंत पुस्तकालयों T7LA विधि द्वारा उत्पादित प्रत्येक (चित्र -3 सी) अन्य, जो शोधकर्ताओं या तो प्रोटोकॉल से बनाया पुस्तकालयों द्वारा उत्पन्न डेटा की तुलना करने के लिए अनुमति देता है बहुत समान हैं. चूंकि इन पुस्तकालयों मानव भ्रूण स्टेम सेल शाही सेना से तैयार थे, हम खोजापुस्तकालयों के बीच 30 स्टेम सेल विशिष्ट जीन के लिए और पाते हैं कि लगभग सभी इन जीनों के (93-100%) कुल शाही सेना (चित्रा 4) शुरू करने की कम से कम 10 एनजी से किए गए पुस्तकालयों द्वारा पहचाने जाते हैं, इस प्रकार हमारे प्रोटोकॉल मान्य. हम मानते हैं हमारे प्रोटोकॉल बहुत उपयोगी है, शोधकर्ताओं के लिए प्रवाह सॉर्ट किया गया कोशिकाओं या लेजर सूक्ष्म dissected ऊतक जहां सीमित है सामग्री शुरू करने के रूप में ऐसी परिस्थितियों में, विशेष रूप से होगा. ऐसी परिस्थितियों में, हमारे प्रोटोकॉल डाटा जीन की अभिव्यक्ति की पीढ़ी बहुत बड़ा शुरू मात्रा से बनाया के बाद से हमारे प्रोटोकॉल अभिव्यक्ति शुरू शाही सेना के परिमाण के कम से कम 3 आदेश भर तुलनीय प्रोफाइल उत्पादन पुस्तकालयों के लिए तुलनीय की अनुमति होगी.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम अनुसंधान और विस्कॉन्सिन फाउंडेशन विश्वविद्यालय के लिए Morgridge संस्थान से धन के द्वारा समर्थित किया गया था. हम संपादकीय सहायता के लिए क्रिस्टा ईस्टमैन धन्यवाद.
Materials
| Company | Kit/Reagent | Catalog # | Special Comments |
| Ambion | Fragmentation reagent | AM8740 | |
| Ambion | Liner Acrylamide | AM9520 | |
| Ambion | MEGAscript T7 Kit | AM1334 | |
| Ambion | Non DEPC treated nuclease free water | AM9932 | |
| Fermentas | dNTP set | R0181 | |
| Fermentas | methylated dNTPs | R0431 | For Single Read sample prep only |
| Illumina | TruSeq SR Cluster Generation kit v5 | GD-203-5001 | For Single Read sample prep only |
| Illumina | TruSeq Seq Kit v5 36 cycles | FC-104-5001 | |
| Illumina | Chip Seq Sample Prep Kit | IP-102-1001 | For Single Read sample prep only. Can be replaced with NEB DNA sample prep Master Mix Set 1 Cat# E6040S |
| Illumina | TruSeq PE Cluster Generation kit v5 | PE-203-5001 | For paired end sample prep only |
| Illumina | Paired End Sample Prep Kit | PE-102-1001 | For paired end sample prep only |
| Invitrogen | 1kb plus ladder | 10787-018 | |
| Invitrogen | E. coli Rnase H | 18021-014 | |
| Invitrogen | Rnase Out | 10777-019 | |
| Invitrogen | 2nd strand buffer 5x | 10812-014 | |
| Invitrogen | E. coli DNA polymerase | 18010-017 | |
| Invitrogen | E-gel SYBR safe 2% | G521802 | |
| Invitrogen | Superscript III (with 5X FS buffer and 0.1M DTT) | 18080-085 | |
| Invitrogen | Trizol | 12183555 | |
| Invitrogen | RNA quibit assay kit | Q32852 | |
| Invitrogen | dsDNA HS qubit assay kit | Q32851 | |
| Invitrogen | E. coli DNA ligase | 18052-019 | |
| Invitrogen | T4 DNA Polymerase | 18005-025 | |
| Invitrogen | Ultra Pure Dnase Rnase water | 10977-015 | |
| Invitrogen | Superscript II double stranded cDNA synthesis kit | 11917-020 | |
| Invitrogen | Random Primer (invitrogen) | 48190-011 | For paired end sample prep only |
| IDT | Not1Nonamer B primer | N/A | For Single Read sample prep only |
| IDT | Oligo dT T7 | N/A | |
| NEB | Not1 digestion kit | R0189S | For Single Read sample prep only |
| Qiagen | Rneasy Minelute kit | 74204 | |
| Qiagen | RNEasy Mini Kit (50) | 74104 | |
| Qiagen | Gel purification kit | 28604 | |
| Qiagen | Dnase set | 79254 | |
| Qiagen | Rneasy MinElute kit | 74204 | |
| Zymo Research | DNA clean and concentrator (250X) | D4014 |
References
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Sengupta, S., Bolin, J. M., Ruotti, V., Nguyen, B. K., Thomson, J. A., Elwell, A. L., Stewart, R. Single Read and Paired End mRNA-Seq Illumina Libraries from 10 Nanograms Total RNA. J. Vis. Exp. (56), e3340, doi:10.3791/3340 (2011).