Uma técnica simplificada para a produção de um modelo de ferida isquêmica

Summary

Nós desenvolvemos uma técnica minimamente invasiva para criar um modelo de ferida de coelho isquémica orelha dividindo a artéria central e do nervo e do feixe neurovascular craniana. Um túnel subcutâneo, em seguida, corta todos os tecidos subcutâneos. Este procedimento causa um transtorno pele mínimo e pode ser utilizado com segurança em animais diabéticos.

Abstract

Um obstáculo importante na investigação da ferida corrente diabética é a falta de um modelo de ferida isquémico que podem ser utilizados com segurança em animais diabéticos. As drogas que funcionam bem em não-isquêmicas feridas podem não funcionar em feridas diabéticas humanos porque vasculopatia é um importante fator que dificulta a cura dessas feridas. Nós publicamos um artigo em 2007 descrevendo uma orelha de coelho modelo ferida isquêmica criado por uma técnica cirúrgica minimamente invasiva. Desde então, têm ainda mais simplificado o procedimento para facilitar a operação. Em uma orelha, três pequenas incisões na pele foram feitas nos pedículos vasculares, 1-2 cm da base da orelha. A artéria central foi ligado e corte ao longo com o nervo. O pacote inteiro craniana foi cortado e ligado, deixando apenas o ramo caudal intacta. Um túnel subcutâneo circunferencial foi feita através das incisões, para cortar tecidos subcutâneos, músculos, nervos e vasos pequenos. A outra orelha foi utilizado como um controlo não-isquémica. Quatro feridas foram feitas na parte ventral of cada orelha. Esta técnica produz 4 feridas isquêmicas e 4 não-isquêmicas feridas em um animal para comparações pareadas. Após a cirurgia, a orelha isquêmica foi legal e cianótica, e mostrou o movimento reduzido e falta de pulso na artéria da orelha. A temperatura da pele da orelha isquémica foi 1-10 ° C mais baixa do que na orelha normal e esta diferença foi mantida por mais de um mês. Ear tecido conteúdo fosfatos de alta energia foram menores na orelha isquémica do que a orelha de controlo. Vezes da cicatrização de feridas eram mais longos na orelha isquémica do que no ouvido não-isquémica, quando o mesmo tratamento foi usado. A técnica foi agora utilizado em mais de 80 coelhos em que 23 eram diabéticos (tempo diabetes variando de 2 semanas a 2 anos). No coelho única desenvolveu complicações cirúrgicas, tais como hemorragia, infecção ou ruptura nas incisões na pele. O modelo tem muitas vantagens, tais como perturbação de pele pouco, tempo de isquemia, e maior taxa de sucesso, quando em comparação com muitos outros modelos. É can ser utilizado com segurança em animais com resistência reduzida, e também pode ser modificado para satisfazer os requisitos de testes diferentes.

Protocol

1. Base anatômica

A orelha de coelho tem sido um material de estudo privilegiado para o tratamento de feridas desde o ^século 20. O ouvido é fornecida por três feixes vasculares (central, cranial e caudal), o feixe central é o maior, enquanto os navios nos pacotes cranial e caudal variam em tamanho. Ocasionalmente, a artéria caudal pode estar ausente. ¹ Todos estes vasos são facilmente identificadas no lado dorsal após a orelha é raspada (Fig. 1). No lado ventral, a pele distai não recebe fornecimento de sangue a partir dos vasos proximais. Os três feixes de vasos na orelha dorsal têm numerosos ramos que penetram através da cartilagem para fornecimento de sangue para a pele distai ventral (Fig. 2). Em alguns coelhos, uma muito pequena vaso subcutânea também ocorre no lado ventral, que fornece sangue a não mais do que 1/3 da pele ventral. Em uma incisão na pele aberta circunferencial, há Essencialmente sangramento NO a partir de uma incisão ventral.

2. Procedimento Cirúrgico

1. O coelho é pesado e as orelhas são raspadas, juntamente com a parte de trás do pescoço.
2. Um pré-medicação de buprenorfina (0,01 mg / kg) é administrada por via IM, uma hora antes da cirurgia.
3. A anestesia é induzida por uma mistura de cetamina (50 mg / kg) e xilazina (5 mg / kg) por via IM.
4. O coelho é protegido com uma almofada de aquecimento durante a cirurgia, os olhos são protegidos com pomada, e os seus sinais vitais são monitorados durante a cirurgia.
5. O campo cirúrgico é preparado assepticamente com uma paramentação e envolto de modo que as duas orelhas estão expostos.
6. Uma orelha é processado isquémica, enquanto a outra orelha serve como um controlo emparelhado não-isquémica.
7. Os três pedículos vasculares são identificados pelas artérias e veias.
8. Usando uma lâmina # 15, três pequenas incisões verticais (1-1,5 cm) são feitas sobre os pedículos vasculares, cerca de 1-2 cm da base da orelha.
9. A veia central éisolado a partir dos tecidos circundantes e uma sutura é usado para a rodeiam para a retracção. A artéria central está ligado com suturas 4-0 e dividido.
10. O nervo acompanha central também está cortado.
11. O pedículo cranial toda é ligada e dividida.
12. O pedículo caudal é preservada.
13. Um túnel subcutâneo é feito através das 3 incisões. Isto é conseguido por meio de dissecção romba com um grampo e dissecações cortantes com uma faca e tesoura. Todos os tecidos subcutâneos, músculos, nervos e pequenos ramos vasculares são interrompidas. Os vasculatures pequena debaixo da derme são totalmente dividido. Todos os tecidos subcutâneos são cortadas ao nível da cartilagem, com a lâmina.
14. Dissecções mais nítidas e sem corte são usados ​​para limpar a base, deixando uma cartilagem nua sobre 5-10 mm de largura.
15. Este procedimento interrompe todos os ramos vasculares subcutâneas para impedi-los de rápido estabelecimento de garantias.
16. O sangramento émínima. Se não houver qualquer, é facilmente controlada por compressão de gaze, sem a necessidade de electrocauterização.
17. A pele no interior do ouvido não carrega suprimento de sangue muito e, portanto, não é incisada.
18. Os 3 incisões na pele são fechadas com suturas 4-0 ou 5-0, e coberto com gaze estéril.
19. Os resultados do procedimento em 3 pequenas incisões na pele e incorre em danos a pele muito menos de uma cirurgia aberta.
20. Quatro circulares feridas de espessura total de pele são criados no lado ventral de cada orelha com um 6-mm de aço inoxidável perfurador. A distância entre as feridas é de pelo menos 20-30 mm. A pele dentro da ferida perfurador é removido da cartilagem. O pericôndrio também é removido, com a pele ou separadamente. A base em que granulação e epitelização ter lugar é a cartilagem, mas a cartilagem não é perfurada (Fig. 3).
21. Quando as feridas em ambas as orelhas são completadas, a droga de teste é aplicado a um lado de duas feridas enquanto a droga de controlo é applied para as feridas do outro lado. Um penso oclusivo (Tegaderm, 3M) é usado para cobrir o local da ferida. Isso impede que as feridas de se tornar dessecado.
22. As feridas na porção inferior da orelha normalmente curar mais rápido do que as feridas na parte superior da orelha. Para ferida estudo de comparação de cura, é recomendado para comparar os dois feridas de um lado com as duas feridas no outro lado, ou para comparar o topo e de fundo feridas separadamente.

3. Cuidados Pós-Operatórios

1. Um adesivo Duragesic é ligado à pele de volta para libertação de fentanilo (25 ug / hora) durante 2-3 dias para reduzir a dor possível.
2. Os coelhos têm acesso livre à comida e à bebida.
3. As trocas de curativos são realizados diariamente. Os pensos antigos são removidos e as feridas são limpos com cotonetes estéreis. As fotos digitais são tiradas para comparação. Pensos novos são aplicados, e as feridas são cobertas novamente por Tegaderm. Nenhum anestésico é necessário durante a vestir changes.
4. A temperatura da pele é medida diariamente em cada orelha para comparação.
5. A circulação de sangue adicional orelha pode ser medido com um medidor de tensão transcutânea de oxigénio ou um laser caudalímetro Doppler.
6. As suturas podem ser removidos após uma semana.
7. Para animais não diabéticos, a maioria das feridas da orelha geralmente curar dentro de 2-3 semanas.

4. Complicações potenciais e como evitá-los

Esta cirurgia minimamente invasiva é seguro e as complicações são raras. Exceto por um período de transição pós-operatório edema de orelha leve, nenhum dos nossos coelhos teve quaisquer complicações graves cirúrgicos. No entanto, existem diversas complicações potenciais para este procedimento:

1. Sangramento. A hemorragia pode ocorrer nas incisões se hemostasia é incompleta ou se um vaso de sangue maior (tal como um dos vasos principais pediculares) está danificado. Isso é facilmente evitada por dissecção cuidadosa. Para além das três principais feixes vasculares, ali umre muitos ramos menores subcutâneos vasculares. Quando o túnel subcutâneo é feita, estes vasos estão a ser cortado, mas não amarrar é necessário. A hemostasia pode ser alcançada simplesmente pressionando gaze. Isto é feito facilmente através da inserção de um canto da gaze para dentro do túnel durante alguns minutos. Antes de fechar a incisão, certifique-se sem sangramento ativo está presente.
2. Infecção da ferida e deiscência: Estas complicações podem ocorrer se as incisões são contaminados. Isto pode ser evitado pelo uso de uma técnica asséptica rigorosas e nenhum antibiótico é necessário. No entanto, se a infecção ocorre drenagem, apropriado e mudanças de pensos são necessários.
3. Edema de orelha: Devido à ligadura vascular e interrupção da circulação linfática, edema de orelha leve podem apresentar por alguns dias. No entanto, desaparece por si só e não é necessário tratamento.

5. Os resultados representativos

Desde 2007, temos usado este procedimento em mais de 70 coelhos, incluindo 23 diabéticos umimals. No grupo de diabéticos, a cirurgia foi realizada em dois tempos diabéticos diferentes: sete coelhos tiveram duas semanas de tempo diabético, quatro tinham dois meses, dez tinham 12 meses e 2 tinha 24 meses de tempo de diabetes.

Imediatamente após a cirurgia, a orelha isquêmica pareceu fria e cianótica, com edema leve. A orelha mais importante da artéria central da artéria--tinha um forte impulso na orelha normal, mas este pulso não estava presente no ouvido isquémico. Movimento orelha foi reduzida, mas não desaparecer totalmente. A pele mostrou depressões claros ao longo do túnel, mas sem isquemia ou necrose foi encontrada em qualquer animal (Fig. 4).

As temperaturas da pele das orelhas normais e isquêmicas foram medidas com um termômetro digital (por Omron Omron Healthcare, Bannockburn, IL, ou um tipo K termômetro infravermelho local por Fisher Scientific, Pittsburgh, PA). As diferenças de temperatura entre a orelha não-isquémica e isquémica variou de 1 a 10 ° C, with a maioria dos coelhos que caem dentro da gama de 2-6 ° C. Fig. 5 mostra as diferenças de temperatura média de 30 coelhos. A diferença de temperatura foi maior nos primeiros dias após a cirurgia, decresceu gradualmente após dia 15, mas foi ainda mantido no fim de um mês.

Conteúdo de tecidos de alta energia de fosfato foram medidos em alguns animais depois de terem sido sacrificados. Seis amostras de tecido foram tomadas de cada ouvido e conteúdo de alta energia de fosfato foram medidos por HPLC. Tanto o ATP e as concentrações totais de energia eram mais elevados nos ouvidos normais do que nos ouvidos isquémicos. Fig. 6 mostra um exemplo de um coelho sacrificados 23 dias após a cirurgia. O conteúdo de tecidos médios de ATP foram 0,349 ± 0,047 mmol / g (média ± DP) na orelha normal vs 0,237 ± 0,059 mmol / g no ouvido isquêmica (p <0,005). A energia média (ATP + ADP + AMP) foi 0,882 ± 0,137 mmol / g, na orelha normal versus 0,556 ± 0,115 mmol / g, na isquemia microfone auricular (p <0,001).

Tempos de cura de feridas eram sempre mais longo para o ouvido isquémica do que para o ouvido não-isquémica em todos os grupos (não-diabéticos ou diabética). Fig. 7 mostra uma comparação de cura entre 26 pares de feridas nas orelhas isquémicos e não-isquémica. Tempos de cura variou de 13 a 18 dias, com média de 14,9 ± 1,6 dias) nas orelhas normais vs 17 a 27 dias, com média de 20,5 ± 3,4 dias) nas orelhas isquêmica (p = 0,001). Vezes cicatrização de feridas em coelhos idade e diabético foram muito mais tempo, especialmente quando o tempo diabética era mais do que 12 meses.

Nestes coelhos, todas as incisões curadas normalmente sem quaisquer complicações, incluindo os coelhos com 24 meses de tempo de diabético. A Figura 8 é uma amostra que mostra a histologia curado túnel subcutâneo em que o músculo está ausente e é substituído por tecido fibroso. No entanto, a pele está intacta.

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Figura 1. A orelha de coelho é fornecido por três feixes vasculares. O central é o maior, o crânio é menor, eo feixe é o menor caudal. Estes vasos são facilmente visíveis na superfície após o ouvido é raspada.

Figura 2. Os três feixes de vasos no sangue dorsal da orelha de abastecimento não só para a pele dorsal, mas também para a pele ventral através dos vasos penetrantes. A seta mostra os vasos penetrantes através da cartilagem. Os shows de inserção seção transversal destes navios.

Figura 3. Quatro 6 mm-feridas são criados no lado ventral da orelha, eo pericôndrio também é removida. A base em que granulação e epitelização ter lugar é a cartilagem, mas a cartilagem não é perfurada. O smal 3 incisões na pele l estão fechados com o rompimento da pele muito pouco.

Figura 4. Após as incisões na pele estão fechados, o recuo ao longo do túnel subcutâneo é claramente visto.

Figura 5. A diferença de temperatura média da pele entre a orelha normal e isquémica em 30 coelhos. As gamas de diferença iniciais a partir de 7 ° C a 10 ° C após a cirurgia. A diferença diminui gradualmente, mas ainda mantido no fim de um mês.

Figura 6. Ouvido tecido conteúdo fosfatos de alta energia são reduzidos no ouvido isquêmico, em comparação com não-isquêmica ouvido em 23 dias após a cirurgia (p <0,001).

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Figura 7. Tempo de cura de feridas é mais tempo nas orelhas isquémicas do que as orelhas não-isquêmicos (26 feridas cada). A cura é definida como a restauração da integridade dos tecidos danificados, ie, a reepitelização completa dos locais de feridas.

Figura 8. Histologia exemplo mostrando a porção de orelha contendo túnel subcutâneo. O tecido curado é mais fino do que orelha normal, o músculo esquelético inicial está ausente e é substituído por tecido fibroso. No entanto, a pele está intacta.

Discussion

Diabetes afeta 23,6 milhões de pessoas em os EUA, ^2,3 e 15-20% desses pacientes desenvolvem úlceras nos pés em sua vida, ^4,5, a um custo anual de tratamento de mais de US $ 25 bilhões. ^3,6 No entanto, mesmo o melhor disponível tratamentos alcançar somente uma taxa de cura de 50% e esta é geralmente temporária, ^7, com taxas de recorrência tão altos quanto 66% em diabéticos ^3,6. Quando ocorrer úlceras em pacientes diabéticos, as principais complicações, como infecção e aumento amputação dramaticamente. Apesar de quase um século de uma extensa pesquisa e ao desenvolvimento de milhares de produtos para curativos, nenhum foi ainda comprovada eficácia. A afirmação de que "úlceras Velho em 1830 serão as úlceras mais velhos em 1860", feito em um dos primeiros trabalhos que descrevem o tratamento de feridas crônicas, ainda se aplica hoje. ⁸ Encontrar um modelo animal apropriado para o estudo de feridas tem sido um grande desafio para os cientistas como bem como para os clínicos. Muitos modelos animais foram criadosou sugeridas para um estudo cuidado da ferida, mas um modelo comparável a uma ferida crônica, a ferida não cura humana é inexistente. ^9,10 Isso porque todas as feridas diabéticas humanos têm uma combinação de isquemia tecidual, hiperglicemia crônica, estresse oxidativo, neuropatia e colonização bacteriana. A isquemia pode não ser a primeira causa de úlceras do pé diabético, mas é a principal razão para a persistência dessas feridas, ^11. Isto é porque não curar feridas no tecido que não sangrar, enquanto que eles quase sempre curar no tecido que sangra extensivamente. ^12-15 Infelizmente, nenhum dos animais actualmente utilizados modelos de feridas isquémicos foi ainda usado com sucesso em animais diabéticos, e este criou um obstáculo importante para o ensaio de drogas da ferida. Em pequena escala de ensaios clínicos de factores de crescimento, como o bFGF, têm mostrado que eles sejam altamente eficazes, mas eles são ineficazes na hipóxicas modelos úlcera dérmicos. ^16,17

Nós publicamos uma arteICLE em 2007 que descreve um modelo de ferida de coelho isquémica orelha que foi usado com sucesso em animais diabéticos. ^18. A técnica é um pouco difícil de realizar por causa uma dissecação cuidadosa do feixe neurovascular craniana é necessária. Como esses vasos são pequenos, sua contribuição para a recuperação pós-operatória é desprezível. Desde então, temos simplificou o procedimento, cortando o feixe neurovascular todo craniano. Para comparar com o procedimento no qual o feixe craniano foi preservada, não houve diferença na cicatrização de feridas ou complicações da orelha. Este procedimento modificado minimamente invasiva tem as seguintes vantagens: 1). É simples, seguro e tem uma alta taxa de sucesso, que reduz a dor e sofrimento para os animais. Nenhuma complicação cirúrgica ocorreu nestes animais, incluindo alguns coelhos com 24 meses de tempo de diabetes, 2). Ele tem um longo período de tempo isquémico. Nossas medições indicaram uma diferença de temperatura da pele, no final de um mês. É possível que the dissecção tecidual subcutânea sem a necessidade de sutura os resultados de volta tecidos em formação garantia atraso; 3). É muito flexível. Porque os três feixes vasculares são todos sob controlo cirúrgica, este modelo pode facilmente ser feito para imitar várias feridas crónicas (ver abaixo), e 4). Ao contrário da pele em outros locais, estas feridas não têm folículos pilosos no leito da ferida. A cura é totalmente a partir do bordo da ferida; 5). Este procedimento cria 4 feridas isquêmicas e 4 não-isquêmicas feridas no mesmo coelho para comparação pareada, reduzindo variações individuais; 6). Contracção da pele é mínima. Enquanto a pele dorsal da orelha de coelho tem alguma mobilidade, a pele ventral é ferulizados por cartilagem, permitindo estudo mais precisa de re-epitelização; ¹⁹ 7). Os coelhos são geralmente tímidas e não-agressiva. Anestésicos são necessários somente durante a cirurgia ferimento. Isso pode reduzir os potenciais fatores de confusão que podem afetar os processos de cicatrização de feridas e 8). É também very económico porque até 8 feridas pode ser feita em um coelho. 9). Em contraste com alguns relatos anteriores, nós não vimos nenhuma formação de cicatriz hipertrófica tanto em coelhos não diabéticos ou diabéticos observados por mais de 24 meses após a cirurgia. O mecanismo ainda é incerto.

Várias abordagens podem ser tomadas para modificar a operação para satisfazer os requisitos de testes diferentes. 1). Prorrogação de tempo de isquemia. Os nossos resultados actuais mostram que a diferença de temperatura da pele é mantida, pelo menos, um mês. Se algum material inerte (tal como silicone) é usado para encher o túnel, para retardar a formação de garantia, o tempo isquémica pode ser estendido. Nós tentamos esta técnica em alguns coelhos e encontrou reação tecidual muito pouco, 2). Denervação total da espiga. Nossa técnica corta os nervos nos dois pedículos vasculares (central e do crânio), deixando o ramo caudal intacta. Se a desnervação ferida total é necessário, o ramo do nervo no pedículo caudal também pode ser cortado à medida quell, 3). Se a inoculação bacteriana ferida é necessário, ele pode ser aplicado à ferida. Como a base da ferida é cartilagem da orelha, que tem o potencial para obter a infecção e à perfuração. Para evitar complicações da cartilagem, a inoculação bacteriana deve ser aplicado após a cartilagem é coberta por um tecido de granulação. Deve notar-se que a contaminação bacteriana é feita facilmente e pode prolongar significativamente o tempo de cura. No entanto, o estabelecimento de biofilme em feridas agudas é mais difícil. Utilizando material clínico e do estado-da-arte da tecnologia, o biofilme foi mostrado para ser estabelecido em apenas 6% de feridas agudas, enquanto que em feridas crónicas, a incidência é de dez vezes superior (60%); ²⁰ A nossa experiência tem mostrado que, quando vezes diabéticos atingir dois anos, a maioria das feridas na orelha isquémico podem ser infectados, mesmo com uma técnica asséptica rigorosa. 4). As úlceras de pressão ocorrem frequentemente em pacientes com danos do nervo central ou periférico devido à perda de sensação. Usando esse modelo, um pressuúlcera re também podem ser criados por métodos de compressão diferentes. ^21,22

Materials

For monitoring during surgery

A heating pad to maintain normal temperature. A transcutaneous oxygen monitor. A temperature monitor.

For surgery

A #3 knife with #15 blade. Two pairs of forceps (one for skin and another for other soft tissues). 2-3 pairs of small clamps. One or two pairs of micro scissors (for tissue cutting). One pair of small scissors (for cutting sutures). A needle holder. A few stainless steel punches (for making wounds).