Summary
En ny og meget effektiv to-trins affinitetskromatografi protokol, er blevet udviklet og er beskrevet i detaljer. Metoden er baseret på et lille rensning tag med to iboende tilhørsforhold, og kan anvendes på en bred vifte af target-proteiner med forskellige egenskaber.
Abstract
På grund af de høje omkostninger forbundet med oprensning af rekombinante proteiner de protokoller, der skal rationaliseres. For high-throughput indsats er der behov for generelle metoder, som ikke kræver target protein konkret optimerings 1. For at opnå dette, er renselse tags, som genetisk kan fusioneres til genet af interesse almindeligt anvendt 2. Den mest udbredte affinitet håndtaget er hexa-histidin tag, som er egnet til rensning under både indfødte og denaturering betingelser 3. Den metaboliske byrde for produktion af tag er lav, men den giver ikke så høj specificitet som konkurrerende affinitetskromatografi baserede strategier 1,2.
Her en bispecific rensning tag med to forskellige bindingssteder på en 46 aminosyre, der er mindre protein domæne blevet udviklet. Den albumin-bindende domæne er afledt af Streptokok protein G og har en stærk iboende affinitet til human serum albumin(HSA). Elleve overflade-eksponerede aminosyrer, ikke involveret i albumin-bindende 4 blev genetisk randomiseret til at producere en kombinatorisk bibliotek. Proteinet bibliotek med romanen tilfældigt arrangeret bindende overfladen (figur 1) blev udtrykt på fag partikler til at lette valg af bindemidler af phage display-teknologi. Gennem flere runder af biopanning mod en dimerisk Z-domæne er afledt af stafylokokker protein A-5, en lille, bispecific molekyle med affinitet til både HSA og romanen målet blev identificeret 6.
Det nye protein domæne, benævnt ABDz1, blev evalueret som en renselse tag for et udvalg af target-proteiner med forskellige molekylevægt, opløselighed og isoelektriske punkt. Tre target-proteiner blev udtrykt i Escherishia coli med romanen tag smeltet til deres N-endestationer og derefter affinitet renset. Indledende rensning på enten en kolonne med immobiliserede HSA eller Z-domæne resulterede i relatively rene produkter. To-trins affinitet rensning med de bispecific tag resulterede i betydelig forbedring af protein renhed. Kromatografiske medier med Z-domænet immobiliseret, for eksempel MabSelect Sure, er let tilgængelige til oprensning af antistoffer og HSA kan nemt være kemisk koblet til medierne til at give den anden matrix.
Denne metode er især fordelagtigt, når der er stor efterspørgsel på renheden af den gendannede target protein. Den bifunctionality af tag kan to forskellige chromatografiske skridt, der skal bruges, mens det metaboliske byrde på udtrykket værten er begrænset på grund af den beskedne størrelse af tag. Det giver et konkurrencedygtigt alternativ til såkaldte kombinatoriske tagging, hvor flere tags bruges i kombination 1,7.
Protocol
1. Kloning af målet gene/ABDz1-tagged fusion konstruere
- Forbered PCR-fragmenter af ABDz1 genet flankeret af egnede begrænsning sites for N-terminal ligatur af målet genet i udtrykket plasmid (et plasmid indeholdende ABDz1 er frit tilgængelig via et materiale transfer aftale).
- Kløve renset udtryk vektor-og PCR-fragmenter med valgte restriktionsenzymer i en passende reaktion buffer. Rense produkter før ligatur.
- Ligate begrænset ABDz1 fragment ind i udtrykket vektor, der indeholder genet af interesse og transformere ligatur produktet til E. coli (i den oprindelige metode RR1ΔM15 stammen blev brugt 8). Spred transformerede celler på agar plader suppleret med passende antibiotika til udvælgelse.
- PCR-skærmen et par kolonier og rækkefølgen kontrollere resulterende udtryk kassetten ved DNA-sekventering.
- Forbered plasmid fra en overnatning kultur af en sekvens verifIED koloni og omdanne til det foretrukne udtryk stamme (i den oprindelige metode E. coli Rosetta (DE3), vært for en pRARE plasmid at forbedre produktionen af proteiner kodet af menneskelige gener, blev brugt).
2. Protein udtryk
- Inokulere en enkelt bakterie koloni i 10 ml tryptic soja bouillon suppleret med 5 g / l gærekstrakt og passende antibiotika. Inkuber ved 150 rpm ved 37 ° C natten over.
- Podes 1 ml af overnattende kultur i 100 ml frisk substrat og fremkalde protein udtryk (oprindeligt 1 mm isopropyl-β-D-thiogalactoside når en lac operon blev udnyttet), når cellerne når den logaritmiske vækstfase.
- Inkuber ved 150 rpm ved 25 ° C natten over og høste celler ved centrifugering.
3. Ortogonale affinitet rensning
- Resuspender pellet i 25 ml flydende buffer (25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% (w / v) Tween 20, pH 8,0) og forstyrre the celler ved hjælp af sonikering på 60% amplitude og 1.0/1.0 impulser i 3 min. Centrifugér prøven og filtrere target proteinet indeholder supernatant (0,45 μm), før yderligere rensning.
- Ligevægt enten en 1 ml HSA Sepharose kolonne eller en NHS-aktiveret kolonne, tidligere kombineret med HSA i henhold til leverandørens anbefalinger, med 10 kolonne volumen (CV) for at køre buffer ved 1 ml / min på et egnet proteinoprensning system. Læg den bakterielle lysat til 0,5 ml / min, og derefter nulstille flow til 1 ml / min.
- Kolonnen udvaskes med 5 CV for at køre buffer efterfulgt af 5 CV vaskebuffer (5 mM NH 4 Ac, pH 5,5).
- Elueres prøven med eluering buffer (0,5 M HAc, pH 2,5) ved 1 ml / min og indsamle fraktioner, overvåge absorption ved 280 nm for at vælge fraktioner fra de elueres højdepunkt for yderligere rensning.
- Pool fraktionerne med den højeste protein koncentration, fortyndes to gange i Sure kører buffer (20 mM fosfat, 150 mM NaCl, pH 7,2) ogSørg for, at pH er omkring neutral. Tilsæt 1 M Tris-HCl pH 8 til at forøge pH hvis det er nødvendigt.
- Læg prøven på 0,5 ml / min på en 1 ml HiTrap MabSelect Sure kolonne, der har været i ligevægt med 10 CV på Sure kører buffer ved 1 ml / min. Reset flowet til 1 ml / min efter læsningen.
- Kolonnen udvaskes med 5 CV på Sure kører buffer (trin 5) og elueres proteiner med 0,2 M HAc, pH 2,7. For følsomme target-proteiner eluatet kan neutraliseres direkte efter indsamling ved tilsætning af Tris-HCl.
Hvis de chromatografiske trin er vendt eluatet fra MabSelect Sure kolonnen kan fortyndes i rindende buffer (trin 3.1) og pH steg til omkring 8 ved tilsætning af 1 M Tris-HCl. Generelt er smallere toppe observeret, når Sure matrix er ansat i det andet trin.
4. Evaluering af renhed på natrium-dodecylsulfat polyacrylamid gel elektroforese (SDS-PAGE)
- Læg den rensede fraktioner på enreduktion af SDS-PAGE og, hvis det ønskes, analysere molekylvægten af det rensede produkt ved massespektrometri. Det er vigtigt fuldt ud at reducere prøven, da en fri cystein i ABDz1 kan forårsage dimerisering af produktet under ikke-reducerende forhold.
5. Repræsentative resultater:
Som et proof of principle, blev ortogonale affinitet rensning lettes ved ABDz1 tag evalueret i tre Human Target proteiner, der repræsenterer forskellige opløselighed klasser, molekylvægt og isoelektriske punkter (Tabel 1). Den ABDz1 genet var genetisk smeltet til målet gener og konstruerer blev udtrykt i E. coli, Figur 2 viser et flow chart for alle trin i metoden fortløbende. Efter rensning af den retvinklede protokollen, blev prøver indsamlet på forskellige punkter analyseres ved SDS-PAGE (Figur 3). Resultaterne viser tydeligt nytten af en dobbelt-tag og to meget specifikke rensningsprocesser trin. Selvom rimelig renhed er AChieved efter den indledende rensning skridt set fra geler, de successive trin giver et meget rent produkt velegnet til meget krævende applikationer.
Figur 1. Design af kombinatoriske bibliotek anvendes til udvælgelse af bispecific ABDz1 tag.
De 46 aminosyre albumin-bindende domæne folder sig til et stabilt tre helix bundt, og den indeholder et bindingssted for human serum albumin hovedsageligt placeret på den anden helix. Ved genetisk randomizing elleve overflade, der udsættes aminosyrer ligger i første og tredje helix, var en ny bindende overflade manipuleret. De elleve positioner er angivet i figuren og nummereret i henhold til Kraulis et al. 9. Efter biopanning mod en dimer af Z-domæne af stafylokokker protein A med kombinatorisk bibliotek udtrykkes på fag, var det bispecific ABDz1 molekylet identificeret.
Figur 2. En forenklet flowdiagram for den retvinklede affinitet rensning protokol.
En PCR-fragment indeholdende ABDz1 sekvensen er ligated (N-terminalt) med et gen interesse i en passende vektor. Den ligatur Produktet er omdannet til E. coli til sekvensen verifikation og plasmid forberedelse. Efter omdannelsen til et udtryk vært, er en storstilet kultur for rekombinant protein udtryk oprettet fra en indledende natten kultur. Bakterier er høstet ved centrifugering og lyseres ved hjælp af sonikering at producere bakteriel lysat indeholder målet protein. Efter en filtrering skridt til at fjerne rester af faste partikler, er lysat udsættes for ortogonale affinitet oprensning på en flydende håndtering af systemet ved at gennemgå to rensning skridt i træk. Elueres toppe fra begge rensningstrin udtages og evalueret af SDS-PAGE til at vurdere renheden og i forhold til than lysat inden rensning.
Figur 3. SDS-PAGE analyse af target-proteiner udtrykt og renset i fusion med ABDz1.
Prøver taget fra den bakterielle lysat af tre proteiner udtrykt i fusion til ABDz1, der repræsenterer forskellige egenskaber, og ABDz1 tag selv blev indsamlet sammen med prøver fra den tilsvarende toppe fra anlæg til rensning på et HSA-kolonne, efterfulgt af en MabSelect Sure-kolonne (A) . Lanes 1-4 repræsenterer prøver fra lysates før rensning, baner 5-8 fra HSA-rensning (første trin) og baner 9-12 fra MabSelect Sure rensning (andet trin). Prøver er indlæst i følgende rækkefølge: ABDz1-141377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 og ABDz1. Desuden blev prøver erhvervet fra samme lysates renset i omvendt rækkefølge på de samme kolonner analyserede (B). Lanes 1-3 repræsenterer prøver fra lysates før rensning, stræder 4-6 from MabSelect Sure-rensning (første trin) og baner 7-9 fra HSA-rensning (andet trin). Prøverne blev lagt i samme rækkefølge som i (A), men tag i sig selv er ikke inkluderet. Ud fra disse resultater er det klart, at denne to-trins metode giver højt oprensede proteiner, uanset i hvilken rækkefølge de trin, der anvendes.
| Navn b | Target protein UniProt c | Molekylær vægt (kDa) | Opløselighed Klasse D | Molekylvægt af fusionsenergi produkt (kDa) | Isoelektriske punkt af fusionsenergi produkt |
| 141377 | B7Z315 | 17,4 | 4 | 23,7 | 8,5 |
| HT875 | P01040 | 10,8 | 3 | 17,1 | 4,9 |
| HT2375 | P00740 | 8,9 | 5 | 15,2 | 6,8 |
- Molekylvægt af ABDz1 tag alene er 6,3 kDa, isoelektriske punkt 6.7.
- Target protein repræsenterer en del af UniProt protein.
- http://www.uniprot.org .
- Opløselighed klasse af protein fragment med N-terminal Hans 6 ABP 10.
Tabel 1. Target-proteiner og fusion produkter med ABDz1 mærke en evalueret i et proof of principle undersøgelse.
Tre unikke menneskelige proteiner med forskellige molekylevægt, opløselighed og isoelektriske punkt blev valgt for at udtrykke sig og rensning af ortogonale affinitet tilgang.
Discussion
Den ortogonale affinitet rensning protokol, der præsenteres her muliggør effektiv rensning af en bred vifte af target-proteiner. Ved at kombinere den iboende bindingssted af albumin-bindende domæne med en roman bindende overflade, var en lille bispecific protein tag udviklet. Det er meget ligetil at udnytte tag, da det simpelthen kan klones og udtrykkes i fusion til ethvert protein af interesse i nogen foretrukne udtryk vektor. Standard-udstyr til rådighed i de fleste laboratorier kan anvendes for de to-trins proteinoprensning. Siden funktion ABDz1 tag afhænger af korrekt foldning af det domæne til effektivt at udstille dens to bindende overflader, er metoden begrænset til proteiner udtrykt i opløselig form og ikke egnet til udrensninger under denatureringen betingelser. Reduktionsmidler bør også undgås, da de forstyrre bindingen af ABDz1 til Z-domæne på MabSelect Sure matrix.
Ortogonale affinitet rensningtion giver et nyttigt alternativ til traditionelle metoder for at opfylde kravene i højtrenset proteiner i mange krævende applikationer. På samme tid, eliminerer denne metode behovet for kombinatorisk tagging, når forskellige rensning strategier bruges i træk. Til applikationer, der kræver en indfødt target protein, kan en protease kløvningssted blive introduceret til gøre enzymatisk fjernelse af ABDz1 tag muligt 11. Desuden ABDz1 tag er den første bispecific små og foldede protein domænenavn, der er beskrevet til dato. Det er enestående, da det giver en renselse strategi, afhænger af to målrette specifikke affinitet interaktioner. I fremtiden ville det være interessant at udvide dette koncept ved at udvikle nye bispecific tags, der bærer nye bindende overflader, der er kompatible med let tilgængelig og billig kromatografiske harpiks. For eksempel ved at erstatte de aminosyrer, der er involveret i albuminbinding med grundlæggende restprodukter, et tag kompatible med ipå udveksling kromatografi kan være opnåeligt. Et lignende koncept har vist sig effektive ved at opkræve indretning af Z-domænet til at generere tags kendt som Z syre 12 og Z grundlæggende 13 kompatibel med anion-og kation udveksling, hhv.
Disclosures
Ingen interessekonflikter erklæret.
Acknowledgments
Dette projekt blev finansieret af Knut og Alice Wallenbergs Foundation og det svenske forskningsråd.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli RR1ΔM15 | American Type Culture Collection | 35102 | |
| E. coli Rosetta (DE3) | Novagen, EMD Millipore | 70954 | |
| Tryptic soy broth | Difco Laboratories | 211822 | |
| Yeast extract | Difco Laboratories | 212720 | |
| Vibra cell sonicator | Sonics and Materials, Inc. | - | |
| HSA Sepharose | Pharmacia Corporation (Pfizer) | Former product | |
| HiTrap MabSelect SuRe | GE Healthcare | 11-0034-93 | |
| HiTrap NHS-activated HP column | GE Healthcare | 17-0716-01 |
References
- Waugh, D. S. Making the most of affinity tags. Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).
- Hedhammar, M. Protein engineering strategies for selective protein purification. CET. 28, 1315-1325 (2005).
- Porath, J. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258, 206-213 (1975).
- Linhult, M. Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin. Protein Sci. 11, 206-213 (2002).
- Nilsson, B. A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein. A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).
- Alm, T. A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification. Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).
- Nilsson, J. Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins. J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).
- Rüther, U. pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts. Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).
- Kraulis, P. J. The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study. FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).
- Hedhammar, M. Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein. J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).
- Carter, P. Site-specific proteolysis of fusion proteins. ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).
- Hedhammar, M. Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery. PEDS. 17, 779-786 (2004).
- Gräslund, T. Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery. Protein Eng. 13, 703-709 (2000).
