En ny og meget effektiv to-trins affinitetskromatografi protokol, er blevet udviklet og er beskrevet i detaljer. Metoden er baseret på et lille rensning tag med to iboende tilhørsforhold, og kan anvendes på en bred vifte af target-proteiner med forskellige egenskaber.
På grund af de høje omkostninger forbundet med oprensning af rekombinante proteiner de protokoller, der skal rationaliseres. For high-throughput indsats er der behov for generelle metoder, som ikke kræver target protein konkret optimerings 1. For at opnå dette, er renselse tags, som genetisk kan fusioneres til genet af interesse almindeligt anvendt 2. Den mest udbredte affinitet håndtaget er hexa-histidin tag, som er egnet til rensning under både indfødte og denaturering betingelser 3. Den metaboliske byrde for produktion af tag er lav, men den giver ikke så høj specificitet som konkurrerende affinitetskromatografi baserede strategier 1,2.
Her en bispecific rensning tag med to forskellige bindingssteder på en 46 aminosyre, der er mindre protein domæne blevet udviklet. Den albumin-bindende domæne er afledt af Streptokok protein G og har en stærk iboende affinitet til human serum albumin(HSA). Elleve overflade-eksponerede aminosyrer, ikke involveret i albumin-bindende 4 blev genetisk randomiseret til at producere en kombinatorisk bibliotek. Proteinet bibliotek med romanen tilfældigt arrangeret bindende overfladen (figur 1) blev udtrykt på fag partikler til at lette valg af bindemidler af phage display-teknologi. Gennem flere runder af biopanning mod en dimerisk Z-domæne er afledt af stafylokokker protein A-5, en lille, bispecific molekyle med affinitet til både HSA og romanen målet blev identificeret 6.
Det nye protein domæne, benævnt ABDz1, blev evalueret som en renselse tag for et udvalg af target-proteiner med forskellige molekylevægt, opløselighed og isoelektriske punkt. Tre target-proteiner blev udtrykt i Escherishia coli med romanen tag smeltet til deres N-endestationer og derefter affinitet renset. Indledende rensning på enten en kolonne med immobiliserede HSA eller Z-domæne resulterede i relatively rene produkter. To-trins affinitet rensning med de bispecific tag resulterede i betydelig forbedring af protein renhed. Kromatografiske medier med Z-domænet immobiliseret, for eksempel MabSelect Sure, er let tilgængelige til oprensning af antistoffer og HSA kan nemt være kemisk koblet til medierne til at give den anden matrix.
Denne metode er især fordelagtigt, når der er stor efterspørgsel på renheden af den gendannede target protein. Den bifunctionality af tag kan to forskellige chromatografiske skridt, der skal bruges, mens det metaboliske byrde på udtrykket værten er begrænset på grund af den beskedne størrelse af tag. Det giver et konkurrencedygtigt alternativ til såkaldte kombinatoriske tagging, hvor flere tags bruges i kombination 1,7.
Den ortogonale affinitet rensning protokol, der præsenteres her muliggør effektiv rensning af en bred vifte af target-proteiner. Ved at kombinere den iboende bindingssted af albumin-bindende domæne med en roman bindende overflade, var en lille bispecific protein tag udviklet. Det er meget ligetil at udnytte tag, da det simpelthen kan klones og udtrykkes i fusion til ethvert protein af interesse i nogen foretrukne udtryk vektor. Standard-udstyr til rådighed i de fleste laboratorier kan anvendes for de to-trins proteinoprensning. Siden funktion ABDz1 tag afhænger af korrekt foldning af det domæne til effektivt at udstille dens to bindende overflader, er metoden begrænset til proteiner udtrykt i opløselig form og ikke egnet til udrensninger under denatureringen betingelser. Reduktionsmidler bør også undgås, da de forstyrre bindingen af ABDz1 til Z-domæne på MabSelect Sure matrix.
Ortogonale affinitet rensningtion giver et nyttigt alternativ til traditionelle metoder for at opfylde kravene i højtrenset proteiner i mange krævende applikationer. På samme tid, eliminerer denne metode behovet for kombinatorisk tagging, når forskellige rensning strategier bruges i træk. Til applikationer, der kræver en indfødt target protein, kan en protease kløvningssted blive introduceret til gøre enzymatisk fjernelse af ABDz1 tag muligt 11. Desuden ABDz1 tag er den første bispecific små og foldede protein domænenavn, der er beskrevet til dato. Det er enestående, da det giver en renselse strategi, afhænger af to målrette specifikke affinitet interaktioner. I fremtiden ville det være interessant at udvide dette koncept ved at udvikle nye bispecific tags, der bærer nye bindende overflader, der er kompatible med let tilgængelig og billig kromatografiske harpiks. For eksempel ved at erstatte de aminosyrer, der er involveret i albuminbinding med grundlæggende restprodukter, et tag kompatible med ipå udveksling kromatografi kan være opnåeligt. Et lignende koncept har vist sig effektive ved at opkræve indretning af Z-domænet til at generere tags kendt som Z syre 12 og Z grundlæggende 13 kompatibel med anion-og kation udveksling, hhv.
The authors have nothing to disclose.
Dette projekt blev finansieret af Knut og Alice Wallenbergs Foundation og det svenske forskningsråd.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
E. coli RR1ΔM15 | American Type Culture Collection | 35102 |
E. coli Rosetta (DE3) | Novagen | 70954 |
Tryptic soy broth | Difco | 211822 |
Yeast extract | Difco | 212720 |
Vibra cell sonicator | Sonics and materials | – |
HSA Sepharose | Pharmacia Biotech | Former product |
HiTrap MabSelect SuRe | GE Healthcare | 11-0034-93 |
HiTrap NHS-activated HP column | GE Healthcare | 17-0716-01 |