Summary
Een roman en zeer efficiënte twee-staps affiniteitschromatografie protocol is ontwikkeld en wordt in detail beschreven. De methode is gebaseerd op een kleine zuivering tag met twee inherente affiniteit en is van toepassing op een breed scala van target eiwitten met verschillende eigenschappen.
Abstract
Vanwege de hoge kosten in verband met de zuivering van recombinante eiwitten de protocollen moeten worden gerationaliseerd. Voor high-throughput inspanningen is er een vraag naar algemene methoden die niet nodig doeleiwit specifieke optimalisatie 1. Om dit te bereiken zijn zuivering tags die genetisch kan worden gefuseerd met het gen van belang veelgebruikte 2. De meest gebruikte affiniteit handvat is de hexa-histidine-tag, die geschikt is voor de zuivering is onder zowel autochtone als denaturerende omstandigheden 3. De metabole belasting voor het produceren van de tag is laag, maar het geeft geen zo hoog specificiteit als concurrerende affiniteitschromatografie gebaseerde strategieën 1,2.
Hier, een bispecifiek zuivering tag met twee verschillende bindingsplaatsen op een 46 aminozuur, heeft kleine eiwitdomein ontwikkeld. De albumine-bindende domein is afgeleid van streptokokken proteïne G en heeft een sterke eigen affiniteit met humaan serumalbumine(HSA). Elf oppervlak blootgestelde aminozuren, niet betrokken bij albumine-bindende 4, werden genetisch gerandomiseerd naar een combinatorische bibliotheek te produceren. Het eiwit bibliotheek met de nieuwe willekeurig gerangschikt bindend oppervlak (Figuur 1) werd tot expressie gebracht op faag deeltjes om de selectie van bindmiddelen te vergemakkelijken door faag display technologie. Door verschillende rondes van biopanning tegen een dimeer Z-domein afgeleid van Staphylococcus eiwit A 5, een klein, bispecifieke molecuul met affiniteit voor zowel HSA en de roman doel was geïdentificeerd 6.
Het nieuwe eiwit domein, aangeduid als ABDz1, werd beoordeeld als een zuivering tag voor een selectie van target eiwitten met verschillende moleculaire gewicht, oplosbaarheid en iso-elektrisch punt. Drie doelgroepen eiwitten werden tot expressie gebracht in Escherishia coli met de nieuwe tag gefuseerd met hun N-uiteinden en daarna affiniteit gezuiverd. Eerste zuivering op ofwel een kolom met geïmmobiliseerd HSA-of Z-domein resulteerde in relatiVely pure producten. In twee stappen affiniteit zuiveren met behulp van de bispecifieke tag geleid tot aanzienlijke verbetering van de proteïne zuiverheid. Chromatografische media met de Z-domein geïmmobiliseerd, bijvoorbeeld MabSelect Zeker, zijn direct beschikbaar voor het zuiveren van antistoffen en HSA kan eenvoudig chemisch worden gekoppeld aan media om de tweede matrix te bieden.
Deze methode is vooral voordelig als er een grote vraag op de zuiverheid van de herstelde doelwit eiwit. De bifunctionality van de tag kan twee verschillende chromatografische stappen die moeten worden gebruikt terwijl de metabole belasting van de uitdrukking gastheer is beperkt vanwege de geringe omvang van de tag. Het biedt een concurrerend alternatief voor de zogenaamde combinatorische tagging waar meerdere tags worden gebruikt in combinatie 1,7.
Protocol
1. Klonen van het doel gene/ABDz1-tagged fusieconstruct
- Bereid PCR-fragmenten van de ABDz1 gen geflankeerd door geschikte restrictie-plaatsen voor N-terminale ligatie van het doelwitgen in de expressie plasmide (een plasmide dat ABDz1 is vrij beschikbaar via een Material Transfer Agreement).
- Cleave gezuiverde expressievector en PCR fragmenten met gekozen restrictie-enzymen in een geschikte reactie buffer. Zuiver de producten vóór ligatie.
- Afbinden van de beperkte ABDz1 fragment in de expressievector die het gen van interesse en transformeren de ligatie product tot en met E. coli (in de originele methode van de RR1ΔM15 stam werd gebruikt 8). Verspreid getransformeerde cellen op agar platen aangevuld met geschikte antibiotica voor selectie.
- PCR-scherm een paar kolonies en volgorde controleer de resulterende expressiecassette door DNA-sequencing.
- Bereid plasmide van een 's nachts de cultuur van een reeks verifIED kolonie en om te zetten in de gewenste expressie stam (in de oorspronkelijke methode E. coli Rosetta (DE3), hosting een pRARE plasmide om de productie van eiwitten gecodeerd worden door menselijke genen te verbeteren, werden gebruikt).
2. Eiwitexpressie
- Inoculeren een enkele bacteriële kolonie in 10 ml van tryptische soja bouillon aangevuld met 5 g / l gistextract en de juiste antibiotica. Incubeer bij 150 tpm bij 37 ° C gedurende de nacht.
- Inoculeren 1 ml overnacht cultuur in 100 ml vers medium en induceren proteïne-expressie (oorspronkelijk 1 mM isopropyl-β-D-thiogalactoside bij een lac operon werd gebruikt), wanneer de cellen bereiken de logaritmische groeifase.
- Incubeer bij 150 tpm bij 25 ° C gedurende de nacht en de oogst cellen door centrifugeren.
3. Orthogonale affiniteitszuivering
- Resuspendeer de pellet in 25 ml lopen buffer (25 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,05% (w / v) Tween 20, pH 8,0) en verstoren ee cellen door sonicatie op 60% amplitude en 1.0/1.0 pulsen gedurende 3 minuten. Centrifugeer het monster en filter het doelwit eiwit bevattende supernatant (0,45 pm) voor verdere zuivering.
- Equilibreren ofwel een 1 ml HSA Sepharose kolom of een NHS-geactiveerde column, die eerder samen met HSA volgens de leverancier de aanbevelingen, met 10 kolomvolumes (CV) van het runnen van buffer bij 1 ml / min op een geschikte eiwitzuivering systeem. Laad de bacteriële lysaat bij 0,5 ml / min en vervolgens het debiet weer op 1 ml / min.
- Was de kolom met 5 CV van lopende buffer, gevolgd door 5 CV van wassen buffer (5 mM NH 4 Ac, pH 5,5).
- Elueer het monster met elutiebuffer (0,5 M HAc, pH 2,5) op 1 ml / min en het verzamelen van fracties, monitor absorptie bij 280 nm tot fracties van de geëlueerde piek voor verdere zuivering te selecteren.
- Zwembad de fracties met de hoogste eiwitconcentratie, verdunnen twee keer in SuRe lopen buffer (20 mM fosfaat, 150 mM NaCl, pH 7,2) enZorg ervoor dat de pH-waarde is ongeveer neutraal. Voeg 1 M Tris-HCl pH 8 tot pH, indien nodig te verhogen.
- Laad de steekproef op 0,5 ml / min op een 1 ml HiTrap MabSelect SuRe kolom die is geëquilibreerd met 10 CV van Sure draait buffer is op 1 ml / min. Reset het debiet tot 1 ml / min na het laden.
- Was de kolom met 5 CV van Sure lopen buffer (stap 5) en elueer de eiwitten met 0,2 M HAc, pH 2,7. Voor gevoelige doeleiwitten het eluaat kan direct worden geneutraliseerd bij de inzameling door toevoeging van Tris-HCl.
Als de chromatografische stappen omgekeerd het eluaat uit de MabSelect SuRe kolom kan worden verdund in rijklare buffer (stap 3.1) en de pH verhoogd tot ongeveer 8 door toevoeging van 1 M Tris-HCl. In het algemeen worden smaller pieken waargenomen wanneer de Sure matrix is werkzaam in de tweede stap.
4. Evaluatie van de zuiverheid natriumdodecylsulfaat polyacrylamide gel elektroforese (SDS-PAGE)
- Laad de gezuiverde fracties op eenreducerende SDS-PAGE en, indien gewenst, het molecuulgewicht van het gezuiverde product te analyseren met behulp van massaspectrometrie. Het is belangrijk om volledig te verminderen, omdat het monster een gratis cysteine in ABDz1 kan dimerisatie van het product veroorzaken onder niet-reducerende omstandigheden.
5. Representatieve resultaten:
Als een proof of principle, was orthogonale affiniteitszuivering vergemakkelijkt door het ABDz1 tag beoordeeld op drie menselijke doeleiwitten vertegenwoordigers van verschillende oplosbaarheid klassen, molecuulgewichten en iso-elektrische punten (tabel 1). De ABDz1 gen werd genetisch gefuseerd met het doel genen en de constructen werden uitgedrukt in E. coli, Figuur 2 toont een stroomschema voor alle stappen in de methode achtereenvolgens. Na zuivering door de orthogonale protocol, werden monsters verzameld op verschillende punten geanalyseerd door SDS-PAGE (figuur 3). De resultaten tonen duidelijk het nut van een dual-tag en twee zeer specifieke zuiveringsstappen. Ook al redelijk zuiver is achieved na de eerste zuiveringsstap gezien vanaf de gels, de opeenvolgende stap resulteert in een zeer zuiver product geschikt voor veeleisende toepassingen.
Figuur 1. Ontwerp van de combinatorische bibliotheek wordt gebruikt voor de selectie van het bispecifieke ABDz1 tag.
De 46 aminozuur albumine-bindend domein vouwen tot een stabiele drie helix bundel en het bevat een bindingsplaats voor menselijk serum albumine voornamelijk gelegen aan de tweede helix. Door genetisch randomizing elf oppervlak blootgesteld aminozuren zich in de eerste en de derde helix, was een nieuw bindend oppervlak ontworpen. De elf posities zijn aangegeven in de figuur en genummerd volgens Kraulis et al.. 9. Naar aanleiding van biopanning tegen een dimeer van het Z-domein van Staphylococcus proteïne A met de combinatorische bibliotheek tot expressie gebracht op faag, het bispecifieke ABDz1 molecule werd geïdentificeerd.
Figuur 2. Een vereenvoudigd stroomschema voor de orthogonale affiniteitszuivering protocol.
Een PCR-fragment dat het ABDz1 volgorde wordt geligeerd (N-terminaal) met een gen van interesse in een geschikte expressievector. De ligatie product wordt getransformeerd tot E. coli voor sequentie verificatie en plasmide voorbereiding. Na transformatie naar een uitdrukking host, is een grootschalig cultuur voor recombinant eiwit expressie opgezet vanuit een eerste overnachting cultuur. Bacteriën worden geoogst door centrifugeren en gelyseerd door sonicatie om bacteriële lysaat die het doelwit eiwit te produceren. Na een filtratie stap om resterende vaste deeltjes te verwijderen, is het lysaat onderworpen aan orthogonale affiniteit zuivering op een liquid handling systeem door het ondergaan van twee zuiveringsstappen achter elkaar. Geëlueerd pieken van beide zuivering stappen zijn bemonsterd en beoordeeld door SDS-PAGE om zuiverheid te beoordelen en ten opzichte van thij lysaat vóór de zuivering.
Figuur 3. SDS-PAGE-analyse van target eiwitten tot expressie gebracht en gezuiverd in de fusie met ABDz1.
Monsters genomen van de bacteriële lysaat van drie eiwitten, uitgedrukt in fusie te ABDz1, die verschillende eigenschappen, en de ABDz1 tag zelf zijn verzameld, samen met monsters van de overeenkomstige pieken van de reiniging op een HSA-kolom gevolgd door een MabSelect Sure-kolom (A) . Rijstroken 1-4 vertegenwoordigen monsters van lysaten vóór de zuivering, lanen 5-8 van de HSA-zuivering (eerste stap) en steegjes 9-12 van de MabSelect SuRe zuivering (tweede stap). Monsters zijn geladen in de volgende volgorde: ABDz1-141377, ABDz1-HT875, ABDz1-HT2375 en ABDz1. Daarnaast werden monsters verkregen uit dezelfde lysaten gezuiverd in de omgekeerde volgorde op dezelfde kolommen geanalyseerd (B). Lanen 1-3 vertegenwoordigen monsters van lysaten vóór de zuivering, lanen 4-6 from MabSelect Sure-zuivering (eerste stap) en lanen 7-9 van de HSA-zuivering (tweede stap). Monsters werden geladen in dezelfde volgorde als in (A), maar de tag zelf is niet inbegrepen. Uit deze resultaten is het duidelijk dat deze twee-staps methode sterk gezuiverde eiwitten levert, ongeacht de volgorde waarin de stappen worden toegepast.
| Naam b | Doelwiteiwit Uniprot c | Moleculair gewicht (kDa) | Oplosbaarheid Klasse D | Moleculair gewicht van fusie-product (kDa) | Iso-elektrische punt van fusie-product |
| 141377 | B7Z315 | 17,4 | 4 | 23,7 | 8.5 |
| HT875 | P01040 | 10,8 | 3 | 17,1 | 4.9 |
| HT2375 | P00740 | 8.9 | 5 | 15,2 | 6.8 |
- Moleculair gewicht van ABDz1 tag alleen al is 6,3 kDa, iso-elektrisch punt 6.7.
- Doelwit eiwit vertegenwoordigt een deel van de Uniprot eiwit.
- http://www.uniprot.org .
- Oplosbaarheid klasse van eiwitfragment met N-terminale Zijn 6 ABP 10.
Tabel 1. Target eiwitten en fusion producten met ABDz1 tag een geëvalueerd in een proof of principle studie.
Drie unieke humane eiwitten met verschillende moleculair gewicht, oplosbaarheid en iso-elektrisch punt werden gekozen voor expressie en zuivering door de orthogonale affiniteit aanpak.
Discussion
De orthogonale affiniteitszuivering protocol hier gepresenteerde maakt een efficiënte zuivering van een breed scala van target eiwitten. Door het combineren van de inherente bindingsplaats van de albumine-bindende domein met een nieuwe binding oppervlak, was een klein bispecifiek eiwit-tag ontwikkeld. Het is heel eenvoudig om de tag te gebruiken, omdat het kan eenvoudig worden gekloond en uitgedrukt in fusie met een eiwit van interesse in elke gewenste expressievector. Standaard uitrusting beschikbaar in de meeste laboratoria kan worden toegepast voor de twee-staps eiwitzuivering. Omdat de functie van de ABDz1 tag is afhankelijk van de juiste vouwing van het domein op efficiënte wijze bloot te leggen zijn twee bindende oppervlakken, is de methode beperkt tot de eiwitten die in oplosbare vorm en niet geschikt voor zuiveringen onder denaturerende omstandigheden. Reductiemiddelen moet ook worden vermeden omdat ze interfereren met de binding van ABDz1 aan de Z-domein op de MabSelect SuRe matrix.
Orthogonale affiniteit zuiveringTIE biedt een bruikbaar alternatief voor de traditionele methoden om aan de eisen van zeer gezuiverde eiwitten in tal van veeleisende toepassingen voldoen. Tegelijkertijd is deze methode elimineert de noodzaak voor combinatorische tagging wanneer verschillende zuivering strategieën worden gebruikt in successie. Voor toepassingen die een eigen target proteïne, kan een protease-splitsingplaats worden geïntroduceerd om enzymatische verwijdering van de ABDz1 tag mogelijk 11 te maken. Bovendien is de ABDz1 tag is de eerste bispecifieke kleine en gevouwen eiwitdomein beschreven. Het is uniek omdat het een zuivering strategie die hangt af van twee richten zich op specifieke affiniteit interacties. In de toekomst zou het interessant zijn om dit concept uit te breiden door het ontwikkelen van nieuwe bispecifieke tags die nieuwe, bindende oppervlakken die compatibel zijn met direct beschikbaar en goedkope chromatografische harsen dragen. Bijvoorbeeld door het vervangen van de aminozuren die betrokken zijn bij de binding aan albumine met basische residuen, een tag compatibel is met iover de uitwisseling chromatografie kan worden bereikt. Een soortgelijk concept is bewezen effectief door de lading engineering van de Z-domein naar tags bekend als Z-zuur 12 en Z basic 13 compatibel met anion-en kation-uitwisseling te genereren, respectievelijk.
Disclosures
Geen belangenconflicten verklaard.
Acknowledgments
Dit project werd gefinancierd door de Knut en Alice Wallenberg Foundation en de Zweedse Research Council.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| E. coli RR1ΔM15 | American Type Culture Collection | 35102 | |
| E. coli Rosetta (DE3) | Novagen, EMD Millipore | 70954 | |
| Tryptic soy broth | Difco Laboratories | 211822 | |
| Yeast extract | Difco Laboratories | 212720 | |
| Vibra cell sonicator | Sonics and Materials, Inc. | - | |
| HSA Sepharose | Pharmacia Corporation (Pfizer) | Former product | |
| HiTrap MabSelect SuRe | GE Healthcare | 11-0034-93 | |
| HiTrap NHS-activated HP column | GE Healthcare | 17-0716-01 |
References
- Waugh, D. S. Making the most of affinity tags. Trends Biotechnol. 23, 316-320 (2005).
- Hedhammar, M. Protein engineering strategies for selective protein purification. CET. 28, 1315-1325 (2005).
- Porath, J. Metal chelate affinity chromatography, a new approach to protein fractionation. Nature. 258, 206-213 (1975).
- Linhult, M. Mutational analysis of the interaction between albumin-binding domain from streptococcal protein G and human serum albumin. Protein Sci. 11, 206-213 (2002).
- Nilsson, B. A synthetic IgG-binding domain based on staphylococcal protein. A. Protein Eng. 1, 107-113 (1987).
- Alm, T. A small bispecific protein selected for orthogonal affinity purification. Biotechnol. J. 5, 605-617 (2010).
- Nilsson, J. Multiple affinity domains for the detection, purification and immobilization of recombinant proteins. J. Mol. Recognit. 9, 585-594 (1996).
- Rüther, U. pUR 250 allows rapid chemical sequencing of both DNA strands of its inserts. Nucleic Acids Res. 10, 5765-5772 (1982).
- Kraulis, P. J. The serum albumin-binding domain of streptococcal protein G is a three-helical bundle: a heteronuclear NMR study. FEBS Lett. 378, 190-194 (1996).
- Hedhammar, M. Novel flow cytometry-based method for analysis of expression levels in E coli giving information about precipitated and soluble protein. J. Biotechnol. 119, 133-146 (2005).
- Carter, P. Site-specific proteolysis of fusion proteins. ACS Sympos. Ser. 427, 181-193 (1990).
- Hedhammar, M. Negatively charged purification tags for selective anion-exchange recovery. PEDS. 17, 779-786 (2004).
- Gräslund, T. Charge engineering of a protein domain to allow efficient ion-exchange recovery. Protein Eng. 13, 703-709 (2000).
