En ny och mycket effektiv i två steg affinitetskromatografi protokoll som har utvecklats och beskrivs i detalj. Metoden bygger på en liten rening tag med två inneboende tillhörighet och gäller ett brett spektrum av målproteiner med olika egenskaper.
På grund av de höga kostnaderna i samband med rening av rekombinanta proteiner protokollen måste rationaliseras. För hög genomströmning ansträngningar finns det en efterfrågan på generella metoder som inte kräver målprotein specifika optimering 1. För att uppnå detta är rening taggar som genetiskt kan förenas med den gen av intresse vanliga 2. Den mest använda affinitet handtaget är hexa-histidin-tagg, som är lämplig för rening under både infödda och denaturering villkor 3. Den metabolisk belastning för att producera taggen är låg, men det ger inte så hög specificitet som konkurrerande affinitetskromatografi strategier 1,2.
Här, en bispecific rening tag med två olika bindningsställen på en 46 aminosyra har litet protein domänen utvecklats. Det albumin-bindande domän kommer från Streptokocker protein G och har en stark inneboende affinitet till humant serumalbumin(HSA). Elva yta exponerad aminosyror, inte deltar i albumin-bindande 4, var genetiskt randomiserades för att producera en kombinatoriska bibliotek. Proteinet bibliotek med romanen slumpmässigt ordnade bindande yta (figur 1) uttrycktes på fag partiklar för att underlätta val av bindemedel med phage display teknik. Genom flera omgångar Biopanning mot en dimeriskt Z-domänen från Staphylococcal protein A 5, en liten, bispecific molekyl med affinitet för både HSA och romanen målet identifierades 6.
Romanen protein domän, kallad ABDz1, bedömdes som ett rening tagg för ett urval av målproteiner med olika molekylvikt, löslighet och isoelektriska punkt. Tre målproteiner uttrycktes i Escherishia coli med romanen taggen smält till deras N-Termini och därefter affinitetsrenad. De första rening på antingen en kolumn med orörlig HSA eller Z-domän resulterade i relatitivt rena produkter. Två-stegs affinitet rening med bispecific taggen resulterade i tydliga förbättringar av protein renhet. Kromatografiska media med Z-domänen orörlig, till exempel MabSelect Visst, är lätt tillgängliga för rening av antikroppar och HSA kan enkelt kemiskt kopplas till media för att ge den andra matrisen.
Denna metod är särskilt fördelaktigt när det finns en stor efterfrågan på renhet av det återvunna målprotein. Den bifunctionality av taggen kan två olika kromatografiska steg för att användas när den metaboliska belastningen på uttrycket värd är begränsad på grund av den begränsade storleken på taggen. Det ger ett konkurrenskraftigt alternativ till så kallade kombinatoriska tagga där flera taggar används i kombination 1,7.
Den ortogonala affinitet rening protokollet presenteras här möjliggör effektiv rening av ett brett spektrum av målproteiner. Genom att kombinera den inneboende bindningsställe av albumin-bindande domän med ett nytt bindande yta, var en liten bispecific protein tag utvecklas. Det är mycket enkelt att använda taggen eftersom det kan helt enkelt vara klonas och uttryckas i fusion till något protein av intresse i valfri uttryck vektor. Standardutrustning som finns i de flesta laboratorier kan användas för att i två steg proteinrening. Eftersom funktionen av ABDz1 taggen är beroende på korrekt vikning av domänen för att effektivt exponera sina två bindande ytorna är metoden begränsad till proteiner som uttrycks i löslig form och inte lämpar sig för reningar i denaturering villkor. Reduktionsmedel bör också undvikas eftersom de stör bindning av ABDz1 till Z-domänen på MabSelect Visst matrisen.
Ortogonal affinitet reningning ger ett användbart alternativ till traditionella metoder för att uppfylla kraven av renade proteiner i många krävande tillämpningar. Samtidigt eliminerar denna metod behovet av kombinatorisk taggning när olika renings-strategier används i följd. För applikationer som kräver en infödd målprotein, kan ett proteas klyvningsställe införas för att göra enzymatisk borttagning av ABDz1 taggen möjliga 11. Dessutom är ABDz1 taggen första bispecific liten och vek protein domän som hittills beskrivits. Det är unikt eftersom det ger en rening strategi som beror på två mål viss affinitet interaktioner. I framtiden skulle det vara intressant att utvidga detta koncept genom att utveckla nya bispecific taggar som bär nya bindande ytor som är kompatibla med lättillgänglig och billig kromatografiska hartser. Till exempel genom att ersätta aminosyror som ingår i albuminbindning med grundläggande rester, en tagg kompatibel med iom utbyte kromatografi kan uppnås. Ett liknande koncept har visat sig effektiv genom att ladda konstruktion av Z-domänen för att skapa taggar som kallas Z-syra 12 och Z grundläggande 13 kompatibel med anjon-och katjonbytet, respektive.
The authors have nothing to disclose.
Detta projekt har finansierats av Knut och Alice Wallenbergs stiftelse och Svenska Vetenskapsrådet.
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
E. coli RR1ΔM15 | American Type Culture Collection | 35102 |
E. coli Rosetta (DE3) | Novagen | 70954 |
Tryptic soy broth | Difco | 211822 |
Yeast extract | Difco | 212720 |
Vibra cell sonicator | Sonics and materials | – |
HSA Sepharose | Pharmacia Biotech | Former product |
HiTrap MabSelect SuRe | GE Healthcare | 11-0034-93 |
HiTrap NHS-activated HP column | GE Healthcare | 17-0716-01 |