Summary
Uncoating היא צעד חיוני בשלב מוקדם של מחזור HIV-1 חיים מוגדר פירוק של הקליפה capsid ואת שחרורו של המתחם ribonucleoprotein ויראלי (vRNP). כאן, אנו מדגימים טכניקות לבידוד גרעינים שלמים מן HIV-1 ו virions לכימות uncoating שלהם
Abstract
הגנום של רטרווירוסים הוא עטוף capsid מוקף במעטפת השומנים. עבור lentiviruses, כגון HIV-1, הקליפה חרוטי capsid מורכב החלבון CA מסודרים כמו סריג של משושה. Capsid סגור על ידי 7 pentamers בסוף רחב 5 בקצה הצר של חרוט 1, 2. עטוף במעטפת זו capsid הוא מורכב ribonucleoprotein ויראלי, ויחד הם מהווים את הליבה.
בעקבות איחוי של קרום ויראלי עם קרום התא היעד, HIV-1 הוא שוחרר לתוך הציטופלסמה. Capsid אז מפרק שחרור CA חינם בצורה מסיסה 3 בתהליך המכונה uncoating. המיקום והעיתוי תאיים של uncoating-HIV-1 הם הבינו היטב. חומצה אמינית בודדת החלפות ב-CA אשר משנים את יציבות capsid גם לפגוע ביכולת של HIV-1 להדביק תאים 4. זה מצביע על יציבות capsid הוא קריטי עבור הידבקות ב-HIV-1. HIV-1 uncoating כבר קשה ללמוד בשל היעדר זמינות של מבחני רגיש ואמין עבור תהליך זה. כאן אנו מתארים שיטה כמותית ללימוד uncoating במבחנה באמצעות ליבות מבודד HIV-1 חלקיקים זיהומיות. גישה כוללת הבידוד של ליבות על ידי שקיעה של virions מרוכזת באמצעות שכבה של חומר הניקוי לתוך מפל סוכרוז ליניארי, בקור. כדי לכמת uncoating, גרעינים המבודד מודגרת ב 37 מעלות במרווחים מתוזמנים שונים pelleted לאחר מכן על ידי ultracentrifugation. היקף uncoating מנותח על ידי לכימות שבריר של CA ב supernatant. גישה זו כבר מועסק על מנת לנתח את ההשפעות של מוטציות ויראליות על יציבות HIV-1 capsid 4, 5, 6. זה צריך להיות שימושית גם עבור לומד את התפקיד של גורמים הסלולר uncoating-HIV-1.
Protocol
1. הפקה של HIV-1 חלקיקים
לפני שתמשיך, אתה חייב לקבל אישור ובצע את ההנחיות ממשרד biosafety של המוסד שלך לעבוד במתקן biosafety אישר ל-HIV זיהומיות. עליך להבטיח כי טיפול נאות אמצעי בטיחות הם אחריו במהלך העבודה במעבדה biosafety.
הפקה של HIV-1 החלקיקים מתבצע בדרך כלל על ידי transfection חולף של תאים 293T עם DNA-HIV-1 proviral בעזרת סידן פוספט transfection השיטה 7, 8. כייל הנגיף גבוהה במניות גדל בתרבות של תאים T נגועים גם הם מתאימים.
- 293T התרבות התאים השתנה Dulbecco הנשר בינוני (DMEM) המכיל 10% בסרום שור עוברית (FBS) שיושלם עם אנטיביוטיקה [פניצילין (100 IU / ml) וסטרפטומיצין (100 מיקרוגרם / מ"ל)], בעמ '37 ° C, CO 5% 2 .
- ניתוק תאים מנות כמעט ומחוברות באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA וזרעי 2x10 6
- ביום הבא, monolayers התא צריך להיות בערך 25% ומחוברות ומוכן transfection. במשך שש מנות של תאים להיות transfected, להביא 120 מיקרוגרם של ה-DNA proviral עד נפח של 2.7 מ"ל עם מים סטריליים. לתערובת זו להוסיף 0.3 מ"ל של 2.5 מ 'CaCl 2 ו - 3 מ"ל של 2XBBS, ומערבבים היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה מספר פעמים. אפשר לתערובת לעמוד בטמפרטורת החדר למשך 10-20 דקות.
- הוסף 1 מ"ל של dropwise את התערובת וכתוצאה מכך למרכז של כל מנה מתערבל תוך כדי לערבב בעדינות. מניחים את הכלים הלילה (~ 16 שעות) בקבוצת באינקובטור ב 35 ° C ו 3% CO 2.
- לשאוב את המדיום תרבות בעדינות להוסיף 5 מ"ל PBS.
- לשאוב PBS ולהוסיף 5 מ"ל של מדיום חדש. התרבות התאים החממה ב 37 &מעלות: C ו 5% CO 2 עבור 24-48 שעות נוספות.
- אסוף את supernatant תרבות המכילה חלקיקים נגיפיים, להעביר אותו צינור מ"ל 50 צנטריפוגות חרוטי. מערבבים את supernatants מן המנות כל צנטריפוגה XG ב 1500 עבור 5 דקות לתאי גלולה ופסולת. סינון באמצעות supernatant 0.45 נקבוביות בגודל מיקרומטר מסננים מזרק. אמצעי זהירות יש לנקוט כדי לצמצם את היווצרות תרסיס תוך כדי עבודה עם נגיף חי. זה כולל את השימוש של צינורות בצורת חרוט עם טבעות אטימה או מכסה דלי הרוטור במהלך השלב צנטריפוגה. אם זה לא אפשרי, כובעים את הבורג של צינורות צריך להיות עטוף parafilm.
2. ריכוז של HIV-1 virions ידי ultracentrifugation
- מניחים את supernatant תרבות (30 מ"ל) ב צינור 38.5 polyallomer צנטריפוגות מ"ל (עבור רוטור SW32Ti Beckman או שווה ערך). בעדינות ביסוד supernatant וירוס עם פתרון המכיל 5 מ"ל סוכרוז 20% PBS באמצעות pipet 5 מ"ל.
- צנטריפוגה במשך 3 שעות32,000 סל"ד ב 4 ° C (175,000 XG ב r מקסימום) לחלקיקים גלולה וירוס.
- הסר supernatant על ידי שאיפה, נזהרת שלא להפריע את הכדור בחלק התחתון של הצינור. הוסף 0.5 מ"ל של 1XSTE חיץ (10 mM טריס-HCl [pH 7.4], 100 mM NaCl, 1 mM EDTA) אל הצינור מקום 4 ° C למשך שעה 1 כדי לשחרר את גלולה. שימוש רחב בקוטר 1 pipet קצה מ"ל pipet בעדינות מעלה ומטה כמה פעמים לנתק את הכדור מהחלק התחתון של הצינור. לאחר מכן, להעביר את גלולה התיר את צינור 1.5 microcentrifuge מ"ל, לטפל כדי למנוע הקצפה. דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך 1-3 שעות כדי לאפשר גושים קטנים של הווירוס להתפזר. במהלך תקופה זו, להכין את שיפוע סוכרוז כפי שמתואר בשלב 3.1.
- בעדינות pipet ההשעיה וירוס מעלה ומטה מספר פעמים צנטריפוגות ב 8000 סל"ד (6,000 XG) בשעה 4 מעלות צלזיוס microfuge בקירור דקות 1 כדי להסיר גושים שיורית. שמור על קור המדגם במהלך תהליך זה.
3. סוכרוז שיפועצנטריפוגה כדי לבודד ליבות
HIV-1 ליבות מבודדים באמצעות "ספין-thru" שיטת 9 המהווה שינוי של השיטה המתוארת לעיל לטיהור של HIV-2 ליבות 10.
- הכן 12 מ"ל שיפוע ליניארי 30% עד 70% סוכרוז במאגר 1XSTE בתוך צינור 14.5 polyallomer צנטריפוגות מ"ל עבור SW32.1Ti הרוטור. כדי להכין את שיפוע, להשתמש שיפוע 20 מ"ל לשעבר: מקום 6 מ"ל של תמיסת סוכרוז 70% בצד הקרוב (קרוב ליציאת לשקע) ו 6 מ"ל של תמיסת סוכרוז 30% בצד הרחוק. ודא כי בועות אוויר לא לכודים ערוץ המחבר את שני חדרים. השתמש Densi-Flow אוטומטי הדרגתי לשעבר המשאבה הדרגתי מלמטה למעלה של שפופרת המכילה 1 מ"ל של תמיסת סוכרוז 85% בתחתית. בעדינות במקום שיפוע ב 4 ° C עד מקורר (2-4 שעות).
- שימוש רחב בקוטר 1 pipet קצה מ"ל בעדינות שכבת צבע עם 0.25 מ"ל של תמיסת סוכרוז 15% STE המכיל 1% טריטון X-100. בעדינות את שכבת עם 0.25 מ"ל של תמיסת סוכרוז 7.5% ב STE שימוש רחב לשעמם 1 pipet קצה מ"ל. היזהרו שלא לערבב את השכבות.
- בעדינות עם כיסוי ההשעיה 0.5 מ"ל וירוס משלב 2.4. צעד זה צריך להתבצע בזהירות, כדי למנוע כל הפרעה השיפוע ערבוב של שכבות סוכרוז מודגשים.
- מניחים את צינורות בדלי SW32.1Ti מראש מקורר צנטריפוגות ב 32,000 סל"ד (187,000 XG ב r מקסימום) למשך הלילה (16-20 שעות) בשעה 4 ° C. כדי למנוע הפסקה של צנטריפוגות, אל תתחיל צנטריפוגה עד ואקום בצנטריפוגה מגיע 250 מיקרומטר
- איסוף שברים 1 מ"ל מלמעלה למטה של שיפוע באמצעות fractionator אוטומטי Densi-Flow הדרגתי. מניחים את הצינורות על קרח מיד עם האוסף. מערבבים את התוכן של הצינורות על ידי כמה פעמים היפוך, ולסגת 50 μl של חלק עבור כל כימות של ELISA או assay להפוך פעילות transcriptase.
4. לוקליזציה של HIV-1 ליבותואחסון של ליבות
- לפני ביצוע מבחני uncoating, חשוב כדי לקבוע אילו שברים שלמים המכילים HIV-1 ליבות. זה יכול להיקבע על ידי ELISA p24 או transcriptase הפוכה פעילות assay באמצעות 50 aliquots μl משלב 3.6.
- ההתאוששות של CA הקשורים ליבות קשורה לעתים קרובות ליציבות של גרעינים. מדד הליבה הקשורים CA על ידי ELISA p24 9 באמצעות מדגם של כל חלק. לחלופין, למדוד את פעילות transcriptase הפוכה של כל חלק. באמצעות שתי השיטות השיא צריך להיות סביב חלק 10.
- בריכת שברים המכיל ליבות. אם ליבות אינם לשמש uncoating assay מיד, aliquot ליבות אספו לתוך 0.2-0.3 aliquots מ"ל, פלאש הקפאת N2 נוזלי חנות ב -80 ° C. גרעינים קפואים בדרך זו מתאימים assay uncoating. התשואה של CA הליבה הקשורים הוא בדרך כלל 1-2 מיקרוגרם למיליליטר של לכל p24 או כ -15% מכלל virion הקשוריםp24.
5. Assay קינטי של uncoating-HIV-1
- הסכום של HIV-1 ליבות הנדרש לכל תגובה uncoating הוא כ 50 ננוגרם. כדי לבצע את assay ב uncoating חוץ גופית, predilute aliquot של ליבות עם נפח שווה של חיץ 1XSTE קר כדי להפחית את הצמיגות של ההשעיה כדי למזער שגיאות pipetting.
- בנוסף לדלל 100 μl של ליבות לתוך מ"ל של 0.15 חיץ 1XSTE קר המכיל 10 מיקרוגרם / מ"ל BSA ב צינור microcentrifuge 1.5 מ"ל. אנחנו משלימים את המאגר STE עם BSA (10 מיקרוגרם / מ"ל) כדי למזער את ספיחה של CA על הקירות של הצינור. מערבבים על ידי פעמים את הצינור היפוך מספר. אל המערבולת דגימות. דגירה הצינורות באמבט מים 37 מעלות במרווחים מתוזמנים (15, 30, 60 ו 120 דקות). צינורות צריך להיות שקוע באמבט מים לפחות עד לרמה של המדגם פנימי על מנת להבטיח אפילו התחממות.
- במהלך הדגירה, לערבב בעדינות את תוכן הצינור מעת לעת (בדרך כלל 5 -10 דק ') על ידי מצליף את הצינורית. לשליטה דקה אפס, לדלל 100 μl של ליבות לתוך מ"ל של 0.15 חיץ 1XSTE קר לדגור על הקרח לכל אורך הניסוי (120 דקות). השליטה דקה אפס נותן את הערך uncoating הבסיס, משמש לקביעת עליית uncoating ליבות מודגרות ב 37 מעלות במרווחים בעיתוי שונה.
- בתום תקופת הדגירה, לעצור את תהליך uncoating ידי הנחת צינורות קרח למשך 10 דקות.
- צנטריפוגה צינורות ב 45,000 סל"ד (רוטור TLA-55: 125,000 XG ב r מקסימום) במשך 20 דקות 4 ° C. זו תהיה גלולה ליבות שלם CA חינם שוחרר כתוצאה uncoating ליבות יישאר supernatant. הרוטור צריך להיות precooled ב 4 ° C לפני העמסת דגימות.
- מעבירים את supernatant חדשים צינורות microfuge precooled רצוי בעזרת ג'ל טעינת טיפים המאוחסן בטמפרטורת החדר. שים לב גלולה לא יהיה גלוי לעין, כך לטפל w קיצונייםבשעה שהייתי pipetting את supernatant. Resuspend את כדורי ב 250 μl של diluent מדגם ELISA (0.5% טריטון X-100 ו - 5% התורם עגל בסרום PBS). כדי להבטיח פיזור יעיל של גלולה, מערבולת לאחר הוספת diluent מדגם ELISA. לכמת את התוכן CA של גלולה ו supernatant באמצעות ELISA p24 כפי שמתואר בסעיף הבא.
- היקף uncoating מתקבל על ידי חישוב החלק היחסי של CA נוכח supernatant.
6. Assay עבור CA על ידי ELISA p24
- רבים ערכות ELISA מסחרי זמינים וניתן להשתמש בו כדי לכמת CA. כל שימוש מסחרי או "בתוך הבית" ELISA וכוללים סטנדרטים p24 כדי לקבוע את הליניאריות של assay. דילולים של דגימות צריך להיות assayed כדי להבטיח דיוק.
- פיתחנו ELISA תוצרת בית שבו אנו משתמשים באופן שגרתי כדי assay עבור CA. ההליך מותאם מדוח הקודם 11 ו מבוצע באמצעות גלאי ללכוד נוגדנים זמין מתרומת זרע NIHS מחקר מגיב תוכנית הפניה.
7. נציג תוצאות:
דוגמה מכך מן ELISA לקביעת שברים המכיל ליבה מוצג באיור 1. לאחר איסוף שברים (1 מ"ל כל אחד), 50 μl של כל חלק מן המדגם היה להשתמש בו כדי להפוך דילולים סדרתי ונותחו על ידי ELISA. P24 הכולל מתקבל על ידי הוספת ערכים במשך שתים עשרה שברים היה 14.5 מיקרוגרם. כפי שמוצג שברים דמות 8-10 ליבות הכיל. הערך p24 עבור הליבה המכילים שברים היה 2.17 מיקרוגרם. האחוז של הליבה הקשורים p24 (14.97%) נקבע על ידי לקיחת היחס בין ערך p24 עבור שברים הליבה (2.17 מיקרוגרם) לערך p24 הכולל (14.5 מיקרוגרם). חלק 1 או 2 תמיד מכילים כמות גבוהה של p24, זה מייצג CA חינם אשר אינו משויך ליבות. זה ואחריו הפחתה הדרגתית של ערכי p24 עם חלק אחד לאחר מכן, ולאחר מכן עלייה חדה ולבסוף ירידה חדה p24הערכים. אם טיפול נאות הוא נלקח בעת טעינת שיפוע אז בשיא הליבה הקשורים CA נמצא סביב חלק 10.
תוצאה אופיינית מתקבל על ידי assaying את הקינטיקה של uncoating של HIV-1 ליבות מוצג באיור 2. הגרף מראה גידול תלוי זמן ב uncoating של wild-type HIV-1 ליבות. אחוז uncoating ערך הושג על ידי חישוב שבריר של CA נוכח supernatant. בעזרת תרגול, assay הוא לשעתקו מאוד שימושי לקביעת יציבות ליבות ויראלי במבחנה. יש לציין כי שחזור של assay תלויה מאוד בטיפול נאות של הדגימות במהלך ההליך. מאז ליבות הם חום יציב, הדגימות יש לשמור על 4 מעלות צלזיוס במשך assay למעט בתקופת הדגירה.
איור 1 צפיפות שיווי משקל הדרגתי של צנטריפוגהHIV-1 ליבות. ההשעיה וירוס מרוכז היה מוחל על החלק העליון של מדרון 30-70% סוכרוז ליניארי ועליהן 1% Triton-X-100. לאחר צנטריפוגה ולינה XG 187,000 ו 4 ° C, 1 שברים מ"ל נאספו מלמעלה (שבר 1) לתחתית (שבר 12) ו - p24 היה לכמת ידי ELISA.
איור 2 כמובן זמן של uncoating HIV-1 במבחנה. מטוהרים HIV-1 ליבות היו בדילול וטופחו על 37 מעלות צלזיוס במשך מרווחי הזמן המצוין. המדגם דקות אפס הודגר על הקרח לכל אורך הניסוי. לאחר דגירה, דגימות היו ultracentrifuged ב XG 125,000 למשך 20 דקות ב 4 ° C. Supernatant וכדוריות הופרדו ונותחו על ידי ELISA p24. היקף uncoating נקבע כמתואר בטקסט פרוטוקול. התגובה של כל uncoating בוצעה לשכפל, ברים שגיאה תוחלת בטווח של שני ערכים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
השיטה המתוארת כאן כדי לטהר HIV-1 ליבות ללמוד uncoating במבחנה שימושי ללמוד את השלב הזה של מחזור HIV-1 החיים, בעיקר בשל חוסר זמינות של שיטה לנתח תוקף HIV-1 uncoating בתאי המטרה. אמנם שיטה זו משתמשת ultracentrifugation שיווי משקל לטהר ליבות, אחרים השתמשו pelleting ישיר לאחר תמוגה קצרה עם 1% טריטון X-100-12, 13 או pelleting באמצעות כרית סוכרוז ועליהן 0.1% טריטון X-100-14, 15.
ההתאוששות של ליבות שהושגו בשיטה זו כפופה וריאציה ניסיוני. משתנה ההצלחה של פרוטוקול זה הוא יעילות transfection. בדרך כלל אנו לטעון כמות של הנגיף שווה ערך ל מיקרוגרם לפחות 7 של p24 על השיפוע. המעבדה שלנו משתמשת סידן פוספט transfection שיטה לייצור וירוס. בעוד שיטות transfection אחרים עשויים גם להיות מתאים, אנחנו לא העריכו אותם לבידוד של ליבות. Var חשובים נוספיםiables המשפיעים על התשואה הליבה הטיפול נלקח ביישום שכבות הדרגתי ובהתאם דגימות הקרה. בזהירות רבה יש לנקוט בעת הכנת הדרגתיים סוכרוז, כדי למנוע ערבוב של שיפוע. כל הפרעה תוך יישום ההשעיה וירוס מרוכז עלול להוביל מגע רצויים מוקדם של virions עם חומר ניקוי מתחת לשכבת סוכרוז מכשול; במגע ממושך כזה עלול להתפרק ליבות שברירי להוביל מופחת capsid העמותה. כמו כן, חשוב לא פחות לשמור על צפיפות סוכרוז שיפוע והקור ההשעיה וירוס לאורך ההליך. הנוהל כבר שולט בשימוש בהצלחה על ידי מדענים שונים במעבדה שלנו.
HIV-1 ליבות הם חום יציב 4, ולכן חשוב מאוד הדרגתי סוכרוז fractionate כאשר הוא קר למקום שברים שנאספו באופן מיידי על הקרח. מאז uncoating ליבות תלוי גם pH וריכוז מלח למאגר4, מומלץ מאוד למדוד את pH של חיץ STE לפני שתמשיך assay. שיעור uncoating עשוי להשתנות מעט עם כל אצווה של ליבות. תגובות Uncoating צריכה להתבצע בשני עותקים, ואם ערכים שונים על ידי יותר מ -15%, אז את התגובות צריך להתבצע בשלושה עותקים עד עקביות מושגת. חלבון חינם CA יש נטייה להיצמד לקירות הפנימיים של הצינורות, ולכן קיים הכרח לכלול BSA בריכוז סופי של 10 מיקרוגרם / מ"ל בתערובת התגובה למזער ספיחה של CA על הקירות של החצוצרות.
כאמור, assay uncoating המתואר כאן יכול לשמש כדי לזהות המחקר גורמים המשפיעים uncoating הסלולר. היא עשויה גם לשמש כדי לחקור את ההשפעה של תרכובות מיקוד capsid וגורמים הסלולר על שעתוק הפוך ליבות באמצעות assay אנדוגני שעתוק לאחור. בידוד של HIV-1 ליבות בכמויות מספיקות עשוי גם לאפשר ניתוחהאינטראקציות של capsid עם גורמים הסלולר על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים immunogold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין ניגודי אינטרסים הכריז.
Acknowledgments
HIV-1 מחקרים uncoating במעבדה אייקן נתמכו על ידי NIH מענקים AI40364, AI50423 ו AI076121. חומרים מרכזיים, כולל חומרים כימיים המשמשים את ELISA p24, סופקו על ידי איידס NIH מחקר תוכנית הפניה, אגף איידס, NIAID, NIH.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Cellgro | 10-013-CV | |
| PBS | Cellgro | 21-031-CV | |
| Triton-X-100 | Mallinckrodt Baker Inc. | 9002-93-1 | |
| Tween 20 | Acros Organics | 9005-64-5 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Cellgro | 25-053-CI | |
| 2XBBS | Composition: 50mM BES [pH 6.95], 280 mM NaCl and 1.5 mM Na2HPO4. Adjust pH to 6.95 at room temperature. Filter sterilize & store in aliquots at -20°C. | ||
| Coating antibody: Monoclonal antibody to p24 (183-H12-5C) | National Institutes of Health | 3537 | |
| Primary antibody: HIV-Ig (hyperimmune human patient serum) | National Institutes of Health | 3957 | |
Secondary antibody: Goat anti-human IgG, peroxidase conjugated |
Pierce, Thermo Scientific | 31130 | |
| HRP substrate | KPL Inc | 50-76-11 | |
| Immulon 2HB 96 well plates | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 3455 | |
| SW32Ti and SW32.1 Ti rotors and compatible ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| TLA-55 rotor and tabletop ultracentrifuge | Beckman Coulter Inc. | ||
| High speed microfuge tubes | Beckman Coulter Inc. | 326823, 358123, 357448 | |
| Auto-Densi Flow density gradient fractionator | Labconco Corp. | 4517000 | |
| Gradient Former | CBS Scientific Co. Inc. | GM-20 | |
References
- Ganser, B. K., Li, S., Klishko, V. Y., Finch, J. T., Sundquist, W. I. Assembly and analysis of conical models for the HIV-1 core. Science. 283, 80-83 (1999).
- Li, S., Hill, C. P., Sundquist, W. I., Finch, J. T. Image reconstructions of helical assemblies of the HIV-1 CA protein. Nature. 407, 409-413 (2000).
- Aiken, C. Viral and cellular factors that regulate HIV-1 uncoating. Curr. Opin. HIV. AIDS. 1, 194-199 (2006).
- Forshey, B. M., Schwedler, U. von, Sundquist, W. I., Aiken, C. Formation of a human immunodeficiency virus type 1 core of optimal stability is crucial for viral replication. J. Virol. 76, 5667-5677 (2002).
- Forshey, B. M., Aiken, C. Disassembly of human immunodeficiency virus type 1 cores in vitro reveals association of Nef with the subviral ribonucleoprotein complex. J. Virol. 77, 4409-4414 (2003).
- Wacharapornin, P., Lauhakirti, D., Auewarakul, P. The effect of capsid mutations on HIV-1 uncoating. Virology. 358, 48-54 (2007).
- Chen, C., Okayama, H. High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).
- Aiken, C. Methods in Molecular Biology. Prasad, V. R., Ganjam, K. V. 485, 41-53 (2009).
- Kotov, A., Zhou, J., Flicker, P., Aiken, C. Association of Nef with the human immunodeficiency virus type 1 core. J. Virol. 73, 8824-8830 (1999).
- Kewalramani, V. N., Emerman, M. Vpx association with mature core structures of HIV-2. Virology. 218, 159-168 (1996).
- Wehrly, K., Chesebro, B. p24 antigen capture assay for quantification of human immunodeficiency virus using readily available inexpensive reagents. Methods. 12, 288-293 (1997).
- Welker, R., Hohenberg, H., Tessmer, U., Huckhagel, C., Kräusslich, H. G. Biochemical and structural analysis of isolated mature cores of human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 74, 1168-1177 (2000).
- Briggs, J. A., Wilk, T., Welker, R., Kräusslich, H. G., Fuller, S. D. Structural organization of authentic, mature HIV-1 virions and cores. EMBO J. 22, 1707-1715 (2003).
- Auewarakul, P., Wacharapornin, P., Srichatrapimuk, S., Chutipongtanate, S., Puthavathana, P. Uncoating of HIV-1 requires cellular activation. Virology. 337, 93-101 (2005).
- Accola, M. A., Ohagen, A., Göttlinger, H. G. Isolation of human immunodeficiency virus type 1 cores: retention of Vpr in the absence of p6(gag. J. Virol. 74, 6198-6202 (2000).
