Summary
Plasmonic Pinzette und photonischen Kristall Nanostrukturen gezeigt, nützliche Verbesserungen in der Effizienz und Orientierung Kontrolle von optisch Trapping Mikro-und Nano-Partikel zu produzieren.
Abstract
Eine Methode, um die Position und Orientierung des Submikronpartikel manipulieren destruktiv wäre ein unglaublich nützliches Werkzeug für die biologische Grundlagenforschung werden. Vielleicht ist die am weitesten verbreitete körperliche Kraft, um nicht-invasiven Manipulation von kleinen Partikeln zu erreichen hat Dielektrophorese worden (DEP). 1 Allerdings fehlt DEP auf eigene Vielseitigkeit und Präzision, die gewünschten beim Manipulieren von Zellen sind, da sie traditionell mit stationären Elektroden durchgeführt. Optische Pinzetten, die eine dreidimensionale elektromagnetische Feldgradienten Kräfte auf kleine Partikel ausüben zu nutzen, dies zu erreichen gewünschte Vielseitigkeit und Präzision. 2 Allerdings ist ein großer Nachteil dieses Ansatzes die hohe Strahlungsintensität erforderlich, um die notwendige Kraft zu erreichen, um eine Partikelfalle, die können biologische Proben Schaden 3 Eine Lösung für den Rückhalt und die Sortierung mit geringeren optischen Intensitäten ermöglicht werden optoelektronische Pinzette (OET), aber OET ist außerdem Einschränkungen mit feinen Manipulation von kleinen Partikeln,.. dass DEP-basierte Technologie setzt auch Einschränkung auf dem Grundstück der Lösung 4 , 5
Dieses Video Artikel beschreibt zwei Methoden, die die Intensität der Strahlung für die optische Manipulation von lebenden Zellen benötigt verringern und auch eine Methode zur Orientierung zu kontrollieren. Die erste Methode ist plasmonischen Pinzette, die eine zufällige Gold-Nanopartikel (AuNP) Array zu verwenden als Substrat für die Probe, wie in Abbildung 1 dargestellt. Die AuNP Array wandelt die auftreffenden Photonen in lokalisierte Oberflächenplasmonen (LSP), die von resonanten Dipolmomente, die aus strahlen und erzeugt eine gemusterte Strahlungsfeld mit einer großen Steigung in der Zelle Lösung. Erste Arbeiten zur Oberflächen-Plasmon erweitert Trapping von Righini et al und unsere eigene Modellierung haben gezeigt, den von der Plasmonen Substrat erzeugt reduzieren die anfängliche Intensität erforderlich durch die Stärkung der Gradientenfeld, dass Fallen der Teilchen. 6,7,8 Die Plasmonen Ansatz für feine erlaubt Orientierung Kontrolle von ellipsoidischen Teilchen und Zellen mit niedrigen optischen Intensitäten aufgrund der effizienteren optische Energie Umwandlung in mechanische Energie und einem Dipol-abhängige Strahlungsfeld. Diese Felder sind in Abbildung 2 dargestellt und die geringe Überfüllung Intensitäten sind in den Abbildungen 4 und 5 beschrieben. Die Hauptprobleme bei Plasmonen Pinzetten sind, dass die LSP ist eine beträchtliche Menge an Wärme zu erzeugen und die Trapping ist nur zweidimensional. Diese Wärme erzeugt konvektiven Strömungen und Thermophorese die stark genug sein, um Submikronpartikel aus der Falle zu vertreiben können. 9,10 Der zweite Ansatz, dass wir beschreiben, nutzt periodischen dielektrischen Nanostrukturen einfallendes Licht streuen sehr effizient in Beugung Modi, wie in Abbildung 6 gezeigt, . 11 Idealerweise würde man diese Struktur aus einem dielektrischen Material auf die gleiche Heizung Probleme mit der Plasmonen Pinzette erlebt zu vermeiden, aber in unserem Ansatz eine Aluminium-beschichtete Beugungsgitter ist als eine eindimensionale periodische dielektrische Nanostruktur verwendet. Obwohl es nicht ein Halbleiter, dauerte es nicht erleben eine signifikante Erwärmung und effektiv gefangen kleine Partikel mit geringer Trapping Intensitäten, wie in Abbildung 7 dargestellt. Ausrichtung der Partikel mit dem Gitter Substrat konzeptionell bestätigt die These, dass ein 2-D photonischer Kristall könnte präzise Rotation des nicht-sphärische Partikel mikrometergroßen ermöglichen. 10 Die Effizienz dieser optischen Fallen sind aufgrund der verbesserten Felder durch die Nanostrukturen beschrieben hergestellt erhöht dieser Veröffentlichung.
Protocol
1. Zufällige Au Nanopartikel Array Fabrication 8,10,12,14
- Die Au-Nanopartikel-Arrays ist, indem zunächst eine Vorlage, die von einer dichten Schicht von zufällig adsorbierten Latex-Kugeln mit mittleren Durchmesser von 454 nm vorgenommen wird. Hierzu wird zunächst verdampft Gold auf einem Deckglas zu einer Dicke von 20 nm unter Verwendung von Chrom als Haftschicht erreicht.
- Die Polystyrol-Kugel Monoschicht wird dann, indem man die gold-beschichteten Substrat eine Mischung aus selbstorganisierten 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimid Hydrochlorid (EDC), Latex-Bereich Fahrwerk und de-ionisiertem Wasser.
- Das Adsorptionsverfahren ist berechtigt, für etwa eine Stunde dauern und die nicht absorbierte Kugeln sind weg mit viel Wasser gewaschen.
- Die gebildeten Monoschicht an der Luft getrocknet.
- Schließlich ist ein weiterer 20 nm Gold auf dem Latex Kugel Monoschicht eingedampft, um die zufällige Gold-Nanopartikel-Arrays zu bilden.
- Wenn ein SEM verfügbar ist, können die AuNP Array unter dem SEM gesehen werden, wie in Abbildung 1 und ein Diagramm des Prozesses ist in Abbildung 8 gezeigt aussehen.
2. Biologische Probenvorbereitung 9,11
- Probenvorbereitung für die optisch Trapping Maus Zellkerne wird nun angezeigt.
- 3T3 Maus-Zellkernen mit Acridinorange-Farbstoff markiert wurden aus dem Tewari Gruppe am Fred Hutchinson Cancer Research Center erhalten.
- 10 (BSA:: Maus Zellkerne) 10% Rinderserumalbumin (BSA) in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) ist es, die Maus Zellkerne in einer Konzentration von etwa 1 gegeben. Die BSA hilft, die Kerne ein Verkleben mit dem Substrat zu verhindern.
- Mischen Sie die Lösung mit Ultraschall.
- 5 UL unserer Lösung wird auf die Aluminium-Gitter Array Deckglas aufgebracht. Es ist besser, diesen Schritt mit dem Aluminium-Gitter auf das Mikroskop der Bühne, so dass Sie nicht über den Probentransport nach der Lösung abgeschieden wird.
- Zwei Stapel aus zwei 1 "von 1" Deckgläser werden verwendet, um ein Fünftel Deckglas durch welche die Probe betrachtet wird unterstützt.
- Position der Probe unter dem Mikroskop betrachten.
3. Verfahren zur Überfüllung
- Die optische Pinzette, indem er eine 35 mW Helium-Neon-Laser durch ein Zeiss Axio Imager.D1M mit einem GFP-17 Filter gesetzt, die so modifiziert, dass für 633 nm Laserstrahlung der Probe erreichen ist ausgestattet gebaut.
- Ein Zeiss LD EC Epiplan - NEOFLUAR 50fach Objektiv wird verwendet, um Bild die Zellkerne, die etwa 5 Mikrometer im Durchmesser sind.
- Nachdem die Probe unter dem Objektiv angebracht ist, konzentrieren das Mikroskop auf die Gold-Nanopartikel-Arrays oder Beugungsgitter.
- Übersetzen Mikroskop vertikal bis Fokus auf die Kerne, die Sie wünschen, trap erreicht wird.
- Position Laserfalle Ort über Partikel-und des Teilchens sollte dann seine Position in der Laserspot, auch wenn die Bühne übersetzt wird.
4. Repräsentative Ergebnisse:
Die zufällige Gold-Nanopartikel-Arrays Verfahren sollten Hinterlegung einer Monoschicht AuNP ist, dass unter einem SEM angesehen werden kann, um wie in Abbildung 1 aussehen. Die Klemmkraft durch diese Plasmonen Pinzette erstellt wurden, können 10-20 mal die Kraft, die durch herkömmliche optische Pinzette erzeugt werden. Die minimale Intensität der Plasmonen Pinzette benötigt, um Teilcheneinschluss zu erreichen sind für Partikel unterschiedlicher Größe in Abbildung 4 dargestellt. 9,10 Das Beugungsgitter erreicht Ausrichtung und Abfangen mit 20-fach höheren Wirkungsgrad als Trapping das Gold Nanodots und konnte erreichen, Trapping mit möglichst wenig als 17 uW / um 2 (Abbildung 7). 11
Abbildung 1 10 (a) REM-Aufnahme des selbstorganisierten Gold-Nanopartikeln. Der Durchmesser der einzelnen Gold-Nanopartikel beträgt etwa 450 nm. (B) NSOM Bild der Plasmonen Substrat, wo die Nanopartikel Verteilung ist spärlich, zeigt die Nahfeld-Strahlung. Die Wellenlänge der Anregung Laser 633 nm. (C) Hohe Vergrößerung Blick auf den Bereich mit dem roten Quadrat in (b) gekennzeichnet. (D) Streuung Effizienz Spektrum der Plasmonen Substrat, zeigt der Peak bei 624 nm. (E) Absorption Effizienz Spektrum der Plasmonen Substrat, zeigt der Peak bei 668 nm.
Abbildung 2 13 (a) Au Nanokügelchen zufällig auf einem 2D-Domain 1 verteilt x 1 &mgr; m 2. Jeder blaue Punkt stellen die Mitte der Nanokügelchen (a = 60 nm). Scattering Feldverteilungen auf der Beobachtung Ebenen, die parallel zu den zufälligen Nanokugel Array sind in (b) gezeigt - (e). Die Nanokugel Array wird gleichmäßig durch eine ebene Welle mit der Wellenlänge von 540 nm beleuchtet. Der Brechungsindex des umgebenden Mediums ist 1,33. Die polarization Richtung der ebenen Welle entlang der X-Achse (horizontal in (a)). Die Größe des einfallenden elektrischen Feld ist mit 1 angenommen in die Berechnung ein. Die Trennung zwischen der Beobachtungsebene und die Nanokugel Array ist als h. definiert b) h = a. c) h = 2a. d) h = λ. e) h = 2λ.
Abbildung 3 9 Schematische Darstellung der kundenspezifischen Fluoreszenzmikroskop Konfiguration mit einem umgangen Anregungsfilter und ersetzt dichroitische Strahlteiler. Dies ist die Konfiguration für die simultane Einfangen und Fluoreszenz-Bildgebung verwendet.
Abbildung 4 10 Die minimale Laserintensität, um die Falle als eine Funktion der Strömungsgeschwindigkeit der umgebenden Flüssigkeit Nutzung plasmonischen Trapping erhalten. Alle optischen Intensitäten sind auf Probenebene unter dem Mikroskop Ziel gemessen. (A) - (f) zeigen die Messergebnisse für einzelne Polystyrol-Kügelchen mit einem Durchmesser von 7,3, 6,3 (nicht-sphärische), 5,0, 3,9, 2,5 und 1,1 um beträgt. Die Einschübe zeigen die entsprechenden mikroskopischen Bilder der Teilchen. Die Maßstäbe in allen Bildern vertreten 5 mu m in der Länge.
Abbildung 5 10 Die Steigung der Ausgleichsgerade durch Herkunft in Abb.. 4 gegen Partikelgröße für plasmonischen Trapping. Die Fehlerbalken zeigen die Standardabweichungen der linearen passt. Die Steigung der Ausgleichsgerade (Verhältnis zwischen der optischen Intensität Schwellen-und Durchfluss) in Abb.. 4 hat ein annähernd linearer Zusammenhang mit der Partikelgröße als in dieser Figur gezeigt, was darauf hinweist den Vorteil, dass Plasmonen Trapping insbesondere für kleine Teilchen.
Abbildung 6 11 (a) Schematische Darstellung des erweiterten optischen Fallen nutzen 1-D periodischen Nanostrukturen. Der einfallende Strahl gebeugt wird durch die periodische Nanostruktur bei weitem Feld. (B) Die Intensitätsverteilung des Lichtes mit zwei orthogonalen Polarisationen Nanostruktur bei weitem Feld. (B) Die Intensitätsverteilung des Lichtes mit zwei orthogonalen Polarisationen an der Oberfläche eines Aluminium-Gitter mit einer 417 nm Periode unter Verwendung FDTD-Simulationen. Die Verteilung ist die Intensität auf einer flachen Aluminium-Oberfläche normalisiert. (C) und (d) Trapping Potenzial für Partikel direkt über dem Gitter Oberfläche im Vergleich Lage des Teilchens für (c) eine 350 nm Polystyrol-Kügelchen und (d) eine 1 um Polystyrolkugel. Die weißen Kreise zeigen die Größe der Partikel. Einschübe zeigen die Trapping-Potential über eine flache Aluminium-Oberfläche für die gleiche Partikelgröße als Vergleiche. Die Werte werden für jede Partikelgröße normalisiert. Für alle FDTD Simulation Figuren das Sichtfeld ist 10 x 8 &mgr; m 2.
Abbildung 7 11 (a) Trap Effizienz und minimale Trapping Intensität für Polystyrol-Kügelchen in verschiedenen Größen mit Strahlpolarisation senkrecht zur Gitter-Linien gemessen. Inset zeigt trap Asymmetrie in Trapping Effizienz für die Übersetzung eines 3,87 um Polystyrolkugel senkrecht und parallel zu den Regeln des Gitters. Die durchgezogene Linie (große Asymmetrie) ist mit dem einfallenden Licht polarisiert senkrecht zu den Gitterlinien erhalten, und die gestrichelte Linie (kleine Asymmetrie) ist mit dem einfallenden Licht parallel zu dem Gitter erhalten. Das Gerät ist in (pN [mW / um 2] -1). (B) - (d) Trapping Demonstration eines fluoreszierenden 590 nm Polystyrol-Kügelchen. Der rote Kreis zeigt die Position des Laserspots wie das Laserlicht zu schwach zu sehen war. Zunächst werden die Teilchen innerhalb der Stelle mit höherer Leistung gefangen, als die Macht der Brownschen Bewegung des Teilchens überwindet die Klemmkraft verringert wird, so dass die Partikel zu entkommen. (E) - (g) Trapping Demonstration eines fluoreszierenden Eierstockkrebs Zellkern. Die minimale Intensität erforderlich, um Überfüllung zu initiieren war 16 mW / &mgr; m 2 unter Verwendung eines 20x Objektiv.
Abbildung 8 14 Fabrication Verfahren des kappenförmigen Gold-Nanopartikeln: a) Die Verdampfung des Cr und Au dünne Schicht auf dem Deckglas. b) Die Exposition gegenüber dem Polystyrol Kugel Federung und Adsorption von Kugeln für 1 Stunde. c) Entfernung von nicht-adsorbierten Polystyrolkügelchen und Trocknung der Oberfläche. d) Verdampfen von einer weiteren Schicht Au auf der Vorlage Sphären. e) Schematische Darstellung des kappenförmigen Au-Nanopartikel-Arrays, wo Au deckt nur die Oberseite der Vorlage Sphären.
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Discussion
Die Bedeutung dieser Fangmethoden ist, dass sie die optische Intensität notwendig für eine nachhaltige Fang von irgendwo Rückgang in der Größenordnung von 10 3 mW / um 2 bis irgendwo in der Größenordnung von 10 mW / &mgr; m 2. 10,11 Die Beschränkungen dieser Techniken werden, dass die Gold-Nanopartikel-Arrays Heizung Probleme, die überwunden werden müssen Erfahrungen. Zur Überwindung dieses Problems kann ein 2D-photonischen Kristall-Struktur, die aus einem dielektrischen Material verwendet wird. Eine solche Struktur könnte theoretisch zu produzieren Trapping auf geringe optische Intensitäten und Kontrolle der Mikro-und Nano-Partikel Rotation und Position in einer präzisen Art und Weise durch die Kontrolle der Ein-Polarisation. Das Gitter Ergebnisse in den Abbildungen 6 und 7 zeigen, dass dies für die 1D-Fall wahr. Der nächste Schritt wäre, eine 2D-photonischen Kristall erzeugen und zeigen einen photonischen Kristall Pinzette Array, dass viele biologische Forschung Anwendungen erleichtern würde.
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Disclosures
Keine Interessenskonflikte erklärt.
Acknowledgments
Wir möchten auch Xiaoyu Miao und Ben Wilson für die Entwicklung der meisten der beschriebenen Methoden innerhalb danken. Diese Arbeit wurde vom National Science Foundation (DBI 0454324) und dem National Institute of Health (R21 EB005183) und PHS NRSA T32 GM07270 aus NIGMS zu ECK finanziert.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material Name | Company | Catalog Number | Comment |
| Axio Imager Microscope (D1M) | Carl Zeiss, Inc. | D1M | Zeiss Axio Imager.D1M |
| Microscope Objective (50x/0.55) | Carl Zeiss, Inc. | LD EC Epiplan - NEOFLUAR 50x/0.55 HD DIC | |
| Zeiss Microscope Camera (AxioCam MRc) | Carl Zeiss, Inc. | ||
| Helium Neon Laser (35 mW) | Research Electro-Optics | ||
| Continuously Variable Attenuator | Thorlabs Inc. | NDC-100C-4M | For adjusting microscope intensity |
| Zeiss Filter Set #17 | Carl Zeiss, Inc. | 488017-9901-000 | Filter Set #17 |
| Microscope Slides, 0.5 mm thickness | VWR international | ||
| 3T3 mouse cell nuclei | Fred Hutchinson Cancer Research Center | Store as cold as possible | |
| Acridine Orange dye | Fred Hutchinson Cancer Research Center | ||
| Bovine Serum Albumin, 1 to 10 ration in PBS | Fred Hutchinson Cancer Research Center | ||
| 454 nm polystyrene latex spheres | Polysciences, Inc. | ||
| carbodiimide hydrochloride (EDC) - 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) | G-Biosciences | BC25-1 | |
| gold (for deposition) | |||
| Reflective ruled diffraction grating | Edmund Scientific | ||
| Dulbecco’s Phosphate-Buffered Saline (D-PBS) (1X) | Invitrogen | 14190-144 |
References
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