एक Orthotopic माउस ब्रेन ट्यूमर मॉडल में संयोजन रेडियोथेरेपी

Summary

इस अनुच्छेद के प्रयोजन लिए chemoradiation अध्ययन के लिए एक orthotopic glioblastoma के मॉडल के उपयोग का वर्णन है. यह आलेख हालांकि सेल प्रसंस्करण जाना, दाखिल होगा, और माउस एक intracranial मॉडल का उपयोग कर के रेडियोथेरेपी.

Abstract

Glioblastoma मल्टीफार्मी (जीबीएम) सबसे आम है और आक्रामक वयस्क प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमर ^1. हाल के वर्षों में काफी प्रगति ट्यूमर आक्रमण की यांत्रिकी समझने में किया गया है, और ट्यूमर का प्रत्यक्ष intracerebral टीका physiologically उपयुक्त वातावरण में ² इनवेसिव प्रक्रिया देख के अवसर प्रदान करता है. के रूप में दूर के रूप में मानव मस्तिष्क ट्यूमर का संबंध है, orthotopic वर्तमान में उपलब्ध मॉडल या तो एक जटिल कपाल - उच्छेदन प्रक्रिया के माध्यम से ³ सेल ट्यूमर का एक ठोस टुकड़ा के निलंबन या आरोपण के stereotaxic इंजेक्शन द्वारा स्थापित कर रहे हैं. हमारी तकनीक में हम टिशू कल्चर से कोशिकाओं की फसल के लिए एक सेल मस्तिष्क में सीधे प्रत्यारोपण के लिए इस्तेमाल किया निलंबन बनाने. सर्जरी की अवधि लगभग 30 मिनट है, और के रूप में माउस के लिए एक निरंतर शल्य विमान में की जरूरत है, एक इंजेक्शन संवेदनाहारी प्रयोग किया जाता है. माउस एक stereotaxic Stoetling (संख्या 1) द्वारा किए गए जिग में रखा गया है. पिछाड़ीएर शल्य चिकित्सा के क्षेत्र को साफ है और तैयार है, एक चीरा किया जाता है, और शीर्षस्थान कपाल - उच्छेदन के स्थान का निर्धारण करने के लिए स्थित है. कपाल - उच्छेदन के स्थान 2 सही मिमी और 1 मिमी शीर्षस्थान के लिए विजय - स्तम्भ है. खोपड़ी की सतह से 3 मिमी गहराई है, और कोशिकाओं μl 2 हर 2 मिनट की दर पर इंजेक्ट कर रहे हैं. त्वचा 5-0 पीडीएस के साथ sutured है, और माउस के लिए एक हीटिंग पैड पर जाग की अनुमति दी है. हमारे अनुभव से, सेल लाइन पर निर्भर करता है, इलाज सर्जरी के बाद 7-10 दिनों से जगह ले सकते हैं. दवा वितरण दवा संरचना पर निर्भर है. विकिरण उपचार के लिए चूहों anesthetized हैं, और एक जिग बनाया कस्टम में डाल दिया. लीड माउस शरीर को शामिल किया गया है और केवल माउस के मस्तिष्क को उजागर करता है. tumorigenesis के और जीबीएम लिए नए उपचारों के मूल्यांकन के अध्ययन सटीक और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ब्रेन ट्यूमर पशु मॉडल की आवश्यकता है. इस प्रकार हम इस orthotopic मस्तिष्क मॉडल का उपयोग करने के लिए मस्तिष्क और ट्यूमर का microenvironment की बातचीत का अध्ययन, effectiven परीक्षणविभिन्न चिकित्सीय एजेंटों के साथ और विकिरण के बिना ईएसएस.

Protocol

I. सेल तैयार

1. कोशिकाओं के साथ एक 80% संगामी हर 5 प्रत्यारोपित किया जा चूहों के लिए 225 ³ सेमी फ्लास्क के बारे में 10% FBS DMEM में संगम के लिए बड़े हो रहे हैं.
2. कोशिकाओं के बंद मीडिया महाप्राण (व्यंजन), कैल्शियम मैग्नीशियम या बिना पीबीएस के 10 मिलीग्राम के साथ धो. महाप्राण (व्यंजन) पीबीएस बंद कोशिकाओं.
3. Trypsin के 3 मिलीग्राम के साथ कोशिकाओं Trypsinize, 10-15 मिनट रुको, और मीडिया के 15 मिलीग्राम के साथ trypsin बेअसर.
4. Pipet सभी कोशिकाओं और मीडिया एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार में. दो बड़े बोतल एक 50 मिलीलीटर शंक्वाकार में फिट.
5. 7 मिनट के लिए 1600 rpm पर 4 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं स्पिन पूरी तरह से सतह पर तैरनेवाला महाप्राण (व्यंजन). ठंड पीबीएस के 10 मिलीलीटर में कोशिकाओं Resuspend, और धीरे से ऊपर pipetting और नीचे से कोशिकाओं कुल्ला. सुनिश्चित करें कि सेल गोली समान पीबीएस के साथ मिलाया जाता है. निलंबन बादल होना चाहिए.
6. इस समय एक सेल गिनती एक कल्टर काउंटर का उपयोग किया जाता है. कोशिकाओं को फिर से 7 मिनट के लिए 1600 rpm पर 4 डिग्री सेल्सियस पर Centrifuged
7. कोशिकाओं के 2 ^{एन डी} centrifugation, के रूप में के बादसमुद्री डाकू सब पीबीएस और पीबीएस के 1 मिलीग्राम में resuspend.
8. कोशिकाओं पीबीएस की 1ml में 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 3000 rpm पर काता कर रहे हैं पीबीएस aspirated होता है, और PBS U87 कोशिकाओं के लिए 5 μl प्रति ⁶ 1x10 करने के लिए अंतिम एकाग्रता को समायोजित करने के लिए जोड़ा जाता है, अन्य सेल लाइनों को एक अलग और इष्टतम ट्यूमर के विकास के लिए कोशिकाओं की संख्या एकाग्रता की आवश्यकता हो सकती है.
9. अंतिम मात्रा और एकाग्रता के बाद प्राप्त की है कोशिकाओं एक Eppendorf ट्यूब में बर्फ पर रखा जाता है.

द्वितीय. Xenograft

1. माउस की तैयारी
   1. चूहों Ketamine / Xylazine / खारा इंजेक्शन मिश्रण का उपयोग संवेदनाहृत हैं. मिश्रण 120 / Ketamine, 16 मिलीग्राम / किलो Rompun और खारा किलो मिलीग्राम है. चूहों व्यक्तिगत तौल रहे हैं और उनके वजन के आधार पर 10 ग्राम प्रति 0.1 मिलीग्राम दिया. संवेदनाहारी 26G 1 मिलीलीटर सिरिंज आईपी संलग्न सुई के साथ दिया जाता है. यह चूहों के लिए लगभग 15 मिनट लेने के लिए कोई दर्द प्रतिक्रिया के लिए सो चरण तक पहुंच जाएगा. आप का दर्द की प्रतिक्रिया की जाँच कर सकते हैंउनके लुटेरा बन्द रखो द्वारा चूहों.
   2. बाद माउस पूरी तरह संवेदनाहृत है, नेत्र मरहम उनकी आँखों के लिए प्रशासित किया जाता है बाहर सुखाने से उन्हें रोकने.
   3. माउस stereotaxic के बिस्तर पर निशान में सामने ऊपरी दांत के साथ मुँह पट्टी पर रखा गया है. यह बिस्तर तो stereotaxic में रखा गया है.
   4. नाक गार्ड माउस नाक पर रखा जाता है सिर के आंदोलन को रोकने के लिए, और कान सलाखों धीरे चूहों के कान नहरों में जगह कर रहे हैं. नाक पट्टी या कान भी तंग सलाखों के या तो स्थान नहीं सावधान रहो, के रूप में खोपड़ी अस्थिभंग और / या साँस लेने से रोकने के माउस.
   5. सुनिश्चित करें कि माउस के सिर स्तर stereotaxic पर टिक के निशान का उपयोग करते हुए इस प्रक्रिया के दौरान उपयोगी है.
   6. प्रस्तुत करने का माउस शराब, और providine के आयोडीन आयोडीन की शराब और 3 अनुप्रयोगों के 3 आवेदन के एक कुल के लिए बारी माउस के सिर पर उदारतापूर्वक लागू किया जाता है. एक 70% के साथ एक शराब पैड के अंतिम आवेदन के लिए लागू किया जाता हैसिर.
2. शल्य चिकित्सा की प्रक्रिया
   1. प्रक्रिया में सभी उपकरणों वाष्पदावी विसंक्रण या भिगोने प्रक्रिया शुरू होने से पहले 70% इथेनॉल में उपकरणों या तो निष्फल होना चाहिए.
   2. खोपड़ी के शीर्ष पर एक चीरा सही तिरछे वापस खोपड़ी के बाईं पीछे आंख के पीछे किया जाता है. चीरा 10 मिमी से 15 लंबे समय से मिमी के बारे में होना चाहिए.
   3. एक क्यू की नोक का प्रयोग, धीरे धीरे चीरा अलग खोपड़ी का पर्दाफाश करने के लिए और दूर पोंछ झिल्ली है कि खोपड़ी और त्वचा के बीच है. एक क्यू की नोक का प्रयोग किसी भी खून के दाग और अत्यधिक रक्तस्राव के लिए घड़ी.
   4. खोपड़ी के शीर्ष बेनकाब शीर्षस्थान कल्पना. हैमिल्टन सिरिंज बिंदु का उपयोग करते हुए, यह शीर्षस्थान पर स्थिति. खोपड़ी में छेद drilled किया की सही स्थिति 2 मिमी सही और 1 मिमी शीर्षस्थान के पूर्वकाल (2 आंकड़ा) है. एक सर्जन मार्कर महसूस किया इत्तला दे दी है, कि बाँझ खरीदी है drilled किया छेद के स्थान चिह्नित करने के लिए प्रयोग किया जाता है. कृपया ध्यान दें कि छेद एक करीब स्थित हैterior सीवन लाइन.
   5. अगले, एक पिन या एक 18G सुई के माध्यम से फूलदान खिलाया में एक 22G सुई के बिंदु का उपयोग कर के रूप में चिह्नित की स्थिति में एक खोपड़ी में एक छोटा सा छेद ड्रिल.
   6. लोड कोशिकाओं के 5 μl साथ 10 μl कांच हैमिल्टन सिरिंज. हैमिल्टन सिरिंज 33G निश्चित इसे से जुड़े सुई कुंद 30g के साथ 10 μl है. यकीन है कि उन्हें लोड करने से पहले कोशिकाओं मिश्रण, या तो उन्हें pipetting या एक 25G संलग्न सुई के साथ एक 1ml सिरिंज का उपयोग कर के द्वारा. हैमिल्टन सिरिंज के बाद भरी हुई है, यह जगह वापस हाथ में यह खोपड़ी में छेद के साथ रेखा.
   7. खोपड़ी की सतह के लिए सुई के निचले हिस्से में बंट अंत, एक बार सुई खोपड़ी के साथ स्तर है, सुई कम जब तक यह खोपड़ी की सतह के नीचे 3 मिमी की गहराई में है.
   8. सुई के बाद कम है, यह वहाँ 2 मिनट के लिए रहने के लिए मस्तिष्क को प्रभावित सुई से किसी भी प्रमुख आघात से बचने जाएगा. कोशिकाओं दाखिल 6-8 मिनट की कुल के लिए प्रति मिनट 1 μl की दर पर है, कोई backflo सावधानडब्ल्यू. के बाद पिछले कोशिकाओं के प्रत्यारोपित किया गया है, एक और 2 मिनट के लिए जगह में सुई छोड़, सभी कोशिकाओं के अंदर व्यवस्थित करने के लिए अनुमति
   9. मस्तिष्क से सुई निकालें, और एक क्यू की नोक के साथ छेद साफ है. 50% ACTONE, 100% EtOH, और PBS, प्रत्येक समाधान में और उस क्रम में 3x के साथ सुई और सिरिंज साफ आगे बढ़ना.
   10. खोपड़ी पर त्वचा के लिए इस बिंदु पर sutured किया जा करने के लिए तैयार है. 5-0 का प्रयोग पीबीएस के बारे में 3 टांके के साथ चीरा बंद.
   11. एक गर्मी पैड पर माउस को जागृत करने के लिए अनुमति दें, और पुन: लागू नेत्र मरहम अगर जरूरत है. माउस पिंजरे को लौट जा सकता है के बाद यह अपने आप ही आंदोलन से पता चलता है (यानी सिर ऊपर उठाना या कंधे चलती).

III. आईसी प्रत्यारोपण के विकिरण और ड्रग करके उपचार

1. विकिरण उपचार
   1. सेल लाइन पर निर्भर करता है, चूहों के इलाज के 7 के बाद प्रत्यारोपण के दिनों के लिए 5 जगह ले सकते हैं. हमारे विभाग के विकिरण उपचार के लिए एक orthovoltage रेडियोथेरेपी इकाई का उपयोग करता हैजाहिर है.
   2. Bioluminescence इमेजिंग BLI, एमआरआई या सीटी के रूप में इमेजिंग ट्यूमर randomization (आंकड़ा 3A) के लिए पूर्व कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
   3. चूहों से पहले के रूप में Ketamine / Xylazine / खारा कॉकटेल के साथ anesthetized हैं, और आँख मरहम उनकी आँखों के लिए लागू किया जाता है.
   4. चूहों एक कस्टम मेड विकिरण जिग है कि एक पाई पहिया, जो चूहों के सिर में केंद्र की ओर इंगित की तरह कॉन्फ़िगर किया गया है में तैनात हैं. चूहों के शरीर के नेतृत्व के साथ विकिरण से परिरक्षित हैं.
   5. नशीली दवाओं के उपचार अलग वितरण मार्गों, यानी वर्ग, आईपी और चतुर्थ के माध्यम से या तो पहले या विकिरण दिया जा सकता है.

चतुर्थ. परिणाम

माउस संज्ञाहरण इंजेक्शन के बाद 45-60 मिनट के भीतर प्रक्रिया से जगाना चाहिए. अगर माउस तकलीफ प्रक्रिया के बाद जागने और समय 1 पार कर गया है आधा प्रक्रिया के बाद घंटा, माउस ठीक नहीं है और इच्छामृत्यु एक प्रभावी विकल्प हो सकता है हो सकता है. यदि वेंअरे अत्यधिक खून बह रहा है या खोपड़ी प्रक्रिया इच्छामृत्यु के दौरान किसी भी बिंदु पर टूट हो जाता है की सलाह दी है. यदि सब कुछ अच्छी तरह से और सेल लाइन के आधार पर चला जाता है, एक ट्यूमर 2-4 सप्ताह के भीतर बनाने शुरू करने के बाद प्रक्रिया जगह ले चाहिए. जब अंतःकपालीय xenograft मॉडल का उपयोग कर, चिकित्सीय प्रभावकारिता आमतौर पर ⁵ आरोपण के बाद अस्तित्व के रूप में मापा जाता है. हालांकि, के रूप में यह एक आईसी मॉडल संकेत और लक्षण मौत से पहले घटित होगा. शारीरिक लक्षण माउस प्रदर्शन कर सकते हैं की कुछ hunched आसन शरीर के वजन की हानि, और निष्क्रियता हैं. स्नायविक लक्षण के कुछ दौरे, सिर झुकाव, और संतुलन की हानि हो सकती है. चित्रा 3B से पता चलता है वह मृत्यु दर में एक ट्यूमर का दाग. एक साजिश Kaplan-Meier (आंकड़ा 4) डेटा का मूल्यांकन करने के लिए प्रयोग किया जाता है. 50% में अस्तित्व के दिनों की संख्या की गणना कर रहे हैं और नियंत्रण की तुलना में. यदि संयोजन समूह व्यक्तिगत विकिरण और दवा हथियारों के अलावा की तुलना में अब रहते संयोजन सफल रहा था.

चित्रा 1 Stoelting Stereotaxic उपकरण.

चित्रा 2 माउस खोपड़ी में छेद ड्रिल के स्थान का एक चित्र है.

चित्रा 3A BLI जीबीएम आरोपण के बाद इमेजिंग.

चित्रा 3B. एच और मृत्यु दर में जीबीएम ट्यूमर की ई.

चित्रा 4 U87 आईसी PARP अवरोध करनेवाला 7 दिनों के बाद सर्जरी के साथ इंजेक्शन प्रत्यारोपण परिणाम.

Discussion

Glioblastoma मल्टीफार्मी के रूप में घातक gliomas, सबसे आम प्राथमिक मस्तिष्क ट्यूमर का प्रतिनिधित्व करते हैं और एक निराशाजनक पूर्वानुमान ⁴ है. जीबीएम से प्रभावित रोगियों की जीवन रक्षा पिछले दशक के दौरान लगभग अपरिवर्तित बनी हुई है (यानी, 9-12 महीने के बाद निदान शल्य चिकित्सा, विकिरण, और ⁵ रसायन चिकित्सा के क्षेत्र में प्रगति के बावजूद). कोशिकाओं के रूप में बारीकी से संभव के रूप में मानव gliomas के histological सुविधाओं के समान होना चाहिए, वहाँ एक उम्मीद के मुताबिक विकास होना चाहिए glioma उपचार के अध्ययन के लिए एक उपयुक्त मॉडल की सुविधाओं एक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य ट्यूमर स्थान और कोशिकाओं के विकास को एक अपेक्षाकृत असतत ट्यूमर के रूप में शामिल होना चाहिए ट्यूमर की दर, ऊतक संस्कृति और मॉडल में ट्यूमर विकसित करने की क्षमता एक छोटे जानवर में ⁶ खर्च को कम करना चाहिए. प्रभावी उपचार प्रयोगात्मक मॉडल है कि निकट नई चिकित्सा परीक्षण और widespr की आणविक आधार की सही समझ प्रदान करने के लिए मानव जीबीएम विशेषताओं के समान पर निर्भरead glioma ⁷ आक्रमण. ब्रेन ट्यूमर के जीव विज्ञान की जांच भी नियमित सेल हो या इन विट्रो में बनाए ⁸ जानकारी हासिल की लाइनों का इस्तेमाल किया. ट्यूमर आक्रमण और angiogenesis के निषेध घातक gliomas के खिलाफ ⁹ उपन्यास चिकित्सात्मक रणनीतियों के विकास में एक प्रमुख लक्ष्य है. glioblastoma के लिए सीमित उपचार के विकल्प अधिक तर्कसंगत और अधिक प्रभावी उपचार के ¹⁰ विकासशील उद्देश्य के साथ इस घातक कैंसर अंतर्निहित आनुवंशिक घावों में एक गहन खोज संचालित है.