שילוב הקרנות של מודל העכבר Orthotopic המוח גידול

Summary

מטרת מאמר זה היא לתאר את השימוש במודל גליובלסטומה orthotopic ללימודי chemoradiation. מאמר זה יהיה ללכת על פי עיבוד בתא, השתלה, והקרנות של העכבר באמצעות המודל תוך גולגולתי.

Abstract

Multiforme גליובלסטומה (GBM) הם הנפוצים ביותר גידולים אגרסיביים בוגרים במוח העיקרי ^1. בשנים האחרונות חלה התקדמות משמעותית בהבנת המכניקה של הפלישה הגידול, חיסון intracerebral ישירה של הגידול מספק הזדמנות להתבונן בתהליך פולשני בסביבה מתאימה מבחינה פיזיולוגית ^2. עד כמה גידולים במוח האדם מודאגים, המודלים orthotopic זמין כרגע מבוססים או על ידי הזרקת תאים stereotaxic של המתלים או ההשתלה של פיסת מוצק של הגידול בהליך craniotomy מסובך ^3. בטכניקה שלנו אנחנו קוצרים תאים בתרבית רקמה ליצירת ההשעיה תא נהג להשתיל ישירות לתוך המוח. משך הניתוח הוא כ 30 דקות, כמו עכבר שצריך להיות במטוס כירורגית מתמיד, זריקות הרדמה משמש. העכבר ממוקם לנענע stereotaxic על ידי Stoetling (איור 1). בירכתי הספינהאה באזור הניתוח הוא ניקה והכין, מבצעים חתך, ועל גבחת נמצא כדי לקבוע את המיקום של craniotomy. מיקום craniotomy הוא 2 מ"מ ימינה, 1 מ"מ מקורי כדי גבחת. העומק הוא 3 מ"מ מפני השטח של הגולגולת, ותאי מוזרקים בשיעור של μl 2 כל 2 דקות. העור מאוחה על ידי תפירה עם 5-0 PDS, והעכבר מותר להעיר על כרית חימום. מניסיוננו, בהתאם לקו הסלולרי, הטיפול יכול להתבצע בין 7-10 ימים לאחר הניתוח. משלוח סמים תלויה בהרכב התרופה. לטיפול בקרינה העכברים מורדמים, והכניסו מותאם אישית עשה לנענע. עופרת מכסה את גופו של העכבר חושף רק את המוח של העכבר. המחקר של tumorigenesis ואת ההערכה של טיפולים חדשים עבור GBM דורשים מדויקות לשחזור גידול במוח במודלים של בעלי חיים. לכן אנו משתמשים במודל המוח orthotopic ללמוד את האינטראקציה של microenvironment של המוח הגידול, על מנת לבחון את effectivenESS של סוכני טיפוליות שונות עם וללא קרינה.

Protocol

I. הכנה Cell

1. התאים גדלים על המפגש ב DMEM עם FBS 10% על בקבוק 1 80% confluent 225 ³ ס"מ על כל 5 העכברים להיות מושתלים.
2. Aspirate התקשורת הנחה של התאים, לשטוף עם 10 מ"ל של PBS ללא סידן או מגנזיום. Aspirate PBS מחוץ לתאים.
3. Trypsinize תאים עם 3 מ"ל של טריפסין, לחכות 10-15 דקות, ולנטרל טריפסין עם 15 מ"ל של התקשורת.
4. Pipet כל התאים ומדיה לתוך 50 מ"ל חרוטית. שתי צלוחיות גדולות להתאים 1 50 מ"ל חרוטית.
5. ספין תאים בסל"ד 1600 דקות 7 ב 4 ° C. לחלוטין לשאוב supernatant. Resuspend תאים 10 מ"ל של קר PBS, ולשטוף תאים על ידי pipetting בעדינות מעלה ומטה. ודא כי התא גלולה מעורבב באופן אחיד עם PBS. ההשעיה צריך להיות מעונן.
6. בשלב זה מספר התא נעשית באמצעות מונה קולטר. התאים centrifuged שוב 4 ° C. בסל"ד 1600 דקות 7
7. לאחר צנטריפוגה 2 ^nd של התאים, כמופיראט כל PBS ו resuspend ב 1 מ"ל של PBS.
8. התאים הסתובב 1ml של PBS ב -3000 סל"ד ב 10 דקות 4 ° C. PBS היא להישאף, ו PBS נוסף כדי להתאים את הריכוז הסופי של 1x10 ⁶ ל μl 5 ל U87 תאים, שורות תאים אחרים עשויים לדרוש מספר ריכוז שונה של תאים עבור הגידול האופטימלי.
9. אחרי נפח הריכוז הסופי מתקבל התאים מוחזקים על קרח בצינור eppendorf.

השנייה. Xenograft

1. הכנת עכבר
   1. עכברים הם הרדים באמצעות הזרקה של תערובת קטמין / Xylazine / מלוחים. התערובת היא 120 מ"ג / ק"ג של קטמין, 16 מ"ג / ק"ג של Rompun מליחים. העכברים נשקלים בנפרד ונתן 0.1 מ"ל לכל 10 גרם לפי המשקל שלהם. ההרדמה ניתנת באמצעות מחט 26G מחוברים IP 1 מ"ל במזרק. זה ייקח בערך 15 דקות על העכברים להגיע לשלב השינה לתגובה כאב. אתה יכול לבדוק את תגובת הכאב שלעכברים על ידי שודד דרכים צובט שלהם.
   2. אחרי סמן העכבר נמצא בהרדמה מלאה, משחת עיניים ניתנת עיניהם כדי למנוע מהם להתייבש.
   3. העכבר מונח על המיטה של ​​stereotaxic עם השיניים העליונות הקדמיות של החריץ בשורת הפה. המיטה ממוקמת אז stereotaxic.
   4. השומר אף ממוקם מעל אפו של העכבר כדי למנוע תנועה של הראש, ואת הברים אוזניים בעדינות למקם את תעלת האוזן של העכברים. להיזהר לא לעשות או מיקום של סרגל האף או ברים אוזניים חזק מדי, כמו הגולגולת עשויה שבר ו / או למנוע את העכבר מן הנשימה.
   5. ודא כי הראש של העכבר הוא ברמה באמצעות השנתות על stereotaxic מועיל תוך כדי התהליך.
   6. כדי הכנה יוד, עכבר אלכוהול providine מוחל בנדיבות על ראשו של העכבר לסירוגין עבור סכום כולל של 3 יישום של יישומים אלכוהול ו 3 של יוד. אחד היישומים הסופית של משטח אלכוהול עם 70% יחול עלראש.
2. הליך כירורגי
   1. כל המכשירים בהליך יש לעקר או על ידי השריית מעוקר או מכשירים באתנול 70% לפני תחילת ההליך.
   2. מבצעים חתך בחלק העליון של הגולגולת מאחורי העין הימנית באלכסון חזרה האחורי השמאלי של הגולגולת. החתך צריך להיות כ - מ"מ 10-15 מ"מ אורך.
   3. שימוש Q-עצה, לאט להפריד את החתך לחשוף את הגולגולת למחות את הממברנה כי הוא בין הגולגולת ואת העור. השתמש Q-עצה כדי לספוג את הדם ולראות לדימום יתר.
   4. לחשוף את החלק העליון של הגולגולת לדמיין גבחת. באמצעות נקודת מזרק המילטון, למקם אותה על גבחת. מיקום נכון של החור לקידוח בגולגולת הוא הנכון 2 מ"מ 1 מ"מ הקדמי של גבחת (איור 2). הרגשתי שקצהו של המנתח דה מרקר, כאלה שנרכשו סטרילית, נעשה שימוש כדי לסמן את מיקומו של החור לקידוח. יש לציין כי החור ממוקם קרובקו תפר terior.
   5. לאחר מכן, לקדוח חור קטן בגולגולת במיקום המסומן באמצעות חוד המחט 22g באגרטל סיכה או הפד באמצעות מחט 18G.
   6. טען 10 μl זכוכית המילטון מזרק עם 5 μl של תאים. מזרק המילטון הוא 10 μl עם 30G בוטה מחט קבועה 33G קשור אליו. יש להקפיד לערבב את התאים לפני טעינת אותם, בין אם על ידי pipetting אותם או באמצעות מזרק עם מחט 1ml 25 גרם המחובר. לאחר מזרק המילטון נטען, למקם אותו בזרוע להסתדר זה עם חור בגולגולת.
   7. מנמיכים את סוף bunt של המחט אל פני השטח של הגולגולת, פעם מחט הוא ברמה עם הגולגולת; להוריד את המחט עד שהיא בעומק של 3 מ"מ מתחת לפני השטח של הגולגולת.
   8. לאחר שהמחט יורדת, היא תישאר שם למשך 2 דקות, כדי למנוע כל טראומה קשה מהמחט להשפיע על המוח. השתלת התאים הוא בשיעור של μl 1 לדקה עבור סכום כולל של 6-8 דקות, להיזהר בכל backfloW. לאחר שאחרון התאים כבר מושתל, להשאיר את המחט במקום עוד 2 דקות, כדי לאפשר את כל התאים להתיישב בו
   9. הסר את המחט מהמוח, ולנקות את החור עם Q-עצה. להמשיך לנקות את המחט במזרק עם 50% Actone, EtOH 100% ו PBS, 3x בפתרון כל בסדר הזה.
   10. עור הגולגולת הוא מוכן להיות איחוי בשלב זה. שימוש 5-0 PBS לסגור את החתך עם כ 3 תפרים.
   11. אפשר העכבר להתעורר על משטח חום, ולהחיל מחדש משחת עיניים במידת הצורך. העכבר ניתן להחזיר לכלוב אחרי זה מראה תנועה בפני עצמה (כלומר, הרמת את הראש או להזיז את הכתפיים).

ג. הטיפול של השתל IC על ידי קרינה והתרופות

1. קרינה טיפול
   1. בהתאם לקו התא, טיפול העכברים יכולים להתקיים 5 עד 7 ימים לאחר השתל. המחלקה שלנו משתמשת יחידת הקרנות orthovoltage עבור לטפל קרינהment.
   2. הדמיה כגון BLI (הדמיה ביולומינציה), MRI או CT יכול לשמש כדי לחזות את הגידול לפני אקראיות (איור 3 א).
   3. עכברים הם הרדים עם קוקטייל קטמין / Xylazine / מלוחים כמו בעבר, משחת עיניים מוחל על עיניהם.
   4. העכברים מוצבים לנענע קרינה מותאם אישית עשה המוגדר כמו גלגל עוגה, בהם ראשי העכברים להצביע לכיוון המרכז. גופותיהם של העכברים מוגן מפני קרינה עם עופרת.
   5. הטיפול התרופתי יכול להינתן לפני או קרינה דרך נתיבי מסירה שונים, כלומר מ"ר, ה-IP ו-IV.

IV. תוצאות

העכבר צריך להתעורר ההליך בתוך 45-60 דקות לאחר הזרקת הרדמה. אם העכבר יש המתקשים להתעורר לאחר הניתוח וזמן חרג ½ 1 שעות לאחר ההליך, העכבר לא יכול להתאושש המתת חסד עשוי להיות חלופה יעילה. אם ההוא פה דימום מוגזם או הגולגולת הופך סדוק בכל שלב במהלך הליך המתת חסד מומלץ. אם הכל ילך כשורה ובהתאם קו התא, הגידול צריך להתחיל להרכיב בתוך 2-4 שבועות לאחר הניתוח יש לקחת את המקום. בעת שימוש במודלים xenograft תוך גולגולתי, היעילות הטיפולית נמדד בדרך כלל ההישרדות לאחר ההשתלה ^5. עם זאת, כפי זהו מודל משולבים סימנים ותסמינים תתרחש לפני מותו. חלק מהסימנים הפיזיים העכבר עשוי להפגין הם יציבה כפופה, אובדן משקל הגוף, חוסר פעילות. חלק מהסימנים נוירולוגיות יכול להיות התקפים, להטות את הראש, ואיבוד שיווי משקל. איור 3 ב מציג HE כתם של הגידול על תמותה. העלילה Kaplan-Meier משמש להערכת הנתונים (איור 4). מספר הימים של הישרדות של 50% מחושבים לעומת שליטה. אם קבוצת שילוב חיו זמן רב יותר מאשר תוספת של קרינה הפרט נשק סמים שילוב זה הצליח.

באיור 1. ציוד Stereotaxic Stoelting.

איור 2. תרשים של מיקום לקדוח חור בגולגולת העכבר.

איור 3 א. BLI הדמיה לאחר ההשתלה GBM.

איור 3 ב. H ו E של הגידול GBM על התמותה.

איור 4. תוצאות U87 שתלים משולבים הזריק עם מעכבי PARP 7 ימים שלאחר הניתוח.

Discussion

גליומות ממאירות, כגון multiforme glioblastoma, לייצג את הגידולים השכיחים ביותר במוח יסודי בעלי פרוגנוזה עגומה ^4. ההישרדות של חולים שנפגעו GBM נשארה כמעט ללא שינוי בעשור האחרון (כלומר, 9-12 חודשים לאחר האבחון) למרות ההתקדמות ניתוח, הקרנות וכימותרפיה ^5. התכונות של הדגם המתאים לחקר הטיפול glioma לכלול מיקום הגידול בצמיחה לשחזור של התאים כגידול דיסקרטית יחסית, התאים צריכה להיות דומה ככל האפשר את תכונות היסטולוגית של gliomas אדם, לא אמורה להיות צמיחה צפויה קצב הגידול, היכולת להגדיל את הגידול בתרבות רקמות המודל צריך להיות חיה קטנה כדי לצמצם את הוצאות ^6. טיפולים יעילים תלוי מודלים ניסיוניים מקרוב מאפיינים דומים GBM, אדם לבדיקת טיפול חדש ומתן הבנה מדויקת של הבסיס המולקולרי של widesprEAD glioma הפלישה ^7. חקירות הביולוגיה של גידולים במוח יש גם בשימוש שגרתי שורות תאים בוגרים או נשמר במבחנה כדי לקבל מידע ^8. עיכוב אנגיוגנזה הפלישה הגידול הוא יעד מרכזי בהתפתחות של אסטרטגיות טיפוליות חדשניות נגד gliomas ממאיר ^9. את טיפולי אפשרויות מוגבלות עבור גליובלסטומה הניעו בחיפוש אינטנסיבי לתוך נגעים גנטיים בבסיס זה סרטן קטלני, במטרה לפתח טיפולים רציונלי יותר ויעיל יותר ^10.