Kombinasjon Strålebehandling i en Orthotopic Mouse Brain Tumor Model

Summary

Formålet med denne artikkelen er å beskrive bruk av en orthotopic glioblastoma modell for chemoradiation studier. Denne artikkelen vil gå skjønt celle behandling, implantere, og strålebehandling av musen med en intrakranial modell.

Abstract

Glioblastoma multiforme (GBM) er den vanligste og aggressive voksne primære hjernesvulster ^en. I de senere årene har det vært betydelig fremgang i forståelsen av mekanikken i tumor invasjon, og direkte intracerebral inokulering av svulst gir muligheten til å observere den invasive prosessen i en fysiologisk riktig miljø ^2. Såvidt menneskelige hjernesvulster er bekymret, er orthotopic modellene tilgjengelige etablert enten ved stereotaxic injeksjon av cellesuspensjoner eller implantasjon av et solid stykke tumor gjennom en komplisert kraniotomi prosedyre ^tre. I teknikken vår høster vi celler fra vev kultur for å skape en celle suspensjon brukes til å implantere direkte inn i hjernen. Varigheten av operasjonen er ca 30 minutter, og som musen må være i en konstant kirurgisk fly, er en injeksjon bedøvelse som brukes. Musen er plassert i en stereotaxic jigg laget av Stoetling (figur 1). AftER det kirurgiske området er ryddet og klargjort, er et snitt laget, og den bregma befinner å bestemme plasseringen av kraniotomi. Plasseringen av kraniotomi er 2 mm til høyre og 1 mm rostral til bregma. Dybden er 3 mm fra overflaten av skallen, og cellene blir injisert med en hastighet på 2 mL hver 2 minutter. Huden er sutureres med 5-0 PDS, og musen er lov å våkne opp på en varmepute. Fra vår erfaring, avhengig av cellelinje, kan behandlingen skje fra 7-10 dager etter operasjonen. Drug levering er avhengig av stoffet sammensetning. For strålebehandling musene bedøves, og satt i en spesiallaget pilken. Lead dekker musens kropp og eksponerer bare hjernen på mus. Studiet av tumorigenesis og evaluering av nye behandlingsmetoder for GBM krever nøyaktige og reproduserbare hjernesvulst dyremodeller. Derfor bruker vi denne orthotopic hjernen modell for å studere samspillet av mikromiljøet av hjernen og svulsten, for å teste effectivenESS av ulike terapeutiske agenter med og uten stråling.

Protocol

I. celleforberedelsen

1. Cellene er dyrket til samløpet i DMEM med 10% FBS om en 80% konfluent 225 cm ³ Kolben for hver 5 mus til å bli implantert.
2. Sug media ut av cellene, vask med 10 ml PBS uten kalsium og magnesium. Sug PBS utenfor cellene.
3. Trypsinize celler med 3 ml trypsin, vent 10-15 min, og nøytralisere den trypsin med 15 ml av media.
4. Pipet alle celler og medier i en 50 ml konisk. To store flasker passe inn i en 50 ml konisk.
5. Spinn cellene ved 1600 rpm for 7 min ved 4 ° C. Helt aspirer supernatanten. Resuspender cellene i 10 ml kald PBS, og skyll celler ved forsiktig pipettering opp og ned. Kontroller at cellepelleten blandes jevnt med PBS. Suspensjonen skal være skyet.
6. På denne tiden en celletall gjøres ved hjelp av en Coulter teller. Cellene sentrifugeres på nytt på 1600 rpm for 7 min ved 4 ° C.
7. Etter 2 ^ND sentrifugering av cellene, sompirat all PBS og resuspender i 1 ml PBS.
8. Cellene er spunnet i 1 ml PBS ved 3000 rpm i 10 min ved 4 ° C. PBS er aspirert, og PBS legges for å justere den endelige konsentrasjonen til 1x10 ⁶ per 5 mL for U87 celler, kan andre cellelinjer krever et annet antall og konsentrasjon av celler for optimal tumorvekst.
9. Etter den endelige volum og konsentrasjon oppnås cellene holdes på is i en Eppendorf rør.

II. Xenograft

1. Klargjøring av mus
   1. Musene er bedøvet med en injeksjon blanding av ketamin / xylazin / Saline. Blandingen er 120 mg / kg av ketamin, 16 mg / kg av Rompun og saltvann. Musene veies individuelt og gis 0,1 ml per 10 g basert på deres vekt. Narkosen gis med 26G nål festet til 1 ml sprøyte IP. Det vil ta ca 15 min for musene å nå en sovende fase for ingen smerte respons. Du kan sjekke smerter responsmus ved å klemme sin footpad.
   2. Etter at musa er helt bedøvet, er øyesalve gis til øynene for å hindre dem fra å tørke ut.
   3. Musen er plassert på sengen av stereotaxic med de fremre øvre tennene i hakket på munnen bar. Sengen blir deretter plassert i stereotaxic.
   4. Nesen vakt er plassert over musens nesen for å hindre bevegelse av hodet, og øret barene er forsiktig plassere i øregangene av musene. Vær forsiktig så du ikke å gjøre heller plassering av nesen baren eller øret barer for stramt, som skallen kan briste og / eller hindre musen fra å puste.
   5. Pass på at hodet av musen er nivået ved hjelp aksemerkene på stereotaxic er nyttig i denne prosessen.
   6. Til prep musen, alkohol og providine jod brukes rikelig på hodet av musen vekslende for totalt 3 anvendelse av alkohol og 3 anvendelser av jod. En endelig anvendelse av en alkohol pad med 70% brukes tilhodet.
2. Kirurgisk prosedyre
   1. Alle instrumenter i prosedyren skal steriliseres enten ved autoklavering eller bløtlegging instrumenter i 70% etanol før du begynner.
   2. Et snitt er laget på toppen av skallen bak høyre øye diagonalt tilbake til venstre bakre av skallen. Snittet skal være ca 10 mm til 15 mm lang.
   3. Bruk en Q-tip, langsomt skille snittet for å avdekke skallen og tørk vekk membranen som er mellom hodeskallen og huden. Bruk en Q-tip til å viske noe blod og se for overdreven blødning.
   4. Avslør toppen av skallen å visualisere bregma. Bruke Hamilton sprøyte punktet, plassere den over bregma. Riktig posisjon på hullet skal bores i skallen er 2 mm rett og 1 mm fremre av bregma (figur 2). En kirurg følte ende markør, som er kjøpt sterile, brukes til å markere plasseringen av hullet skal bores. Vær oppmerksom på at hullet er plassert nær enterior sutur linje.
   5. Neste, bore et lite hull i skallen på den markerte posisjonen ved hjelp av poenget med en 22g nål i en pin vase eller mates gjennom en 18G nål.
   6. Legg 10 mL glasset Hamilton sprøyte med 5 mL av celler. The Hamilton Sprøyten er 10 mL med en stump 30G til 33G fast nål festet til den. Pass på å blande cellene før du legger dem, enten ved å pipettere dem eller bruke en 1ml sprøyte med en 25G nål festet. Etter at Hamilton sprøyten er lastet, legg den tilbake i armen for å stille den opp med hullet i skallen.
   7. Senk bunt enden av nålen til overflaten av skallen, når nålen er på nivå med skallen, senke nålen til den er i en dybde av 3 mm under overflaten av skallen.
   8. Etter at nålen er senket, skal den forbli der i 2 minutter for å unngå noen store traumer fra nålen påvirker hjernen. Implantering av cellene er med en hastighet på 1 mL per minutt for en total av 6-8 minutter, være forsiktig med enhver backflow. Etter den siste av de cellene har blitt implantert, la kanylen på plass i ytterligere 2 minutter, slik at alle cellene til bosette seg i.
   9. Fjern kanylen fra hjernen, og rengjør hullet med en Q-tip. Fortsett å rense nålen og sprøyten med 50% Actone, 100% EtOH, og PBS, 3x i hver løsning og i den rekkefølgen.
   10. Huden på skallen er klar til å bli sutureres på dette punktet. Bruke 5-0 PBS lukke såret med ca 3 masker.
   11. La musen å våkne opp på en varme pute, og på nytt øye salve hvis nødvendig. Musen kan returneres til buret etter at det viser bevegelsen på egen hånd (dvs. løfte opp hodet eller bevege skuldrene).

III. Behandling av IC implantatet ved stråling and Drug

1. Strålebehandling
   1. Avhengig av cellelinje, kan behandling av musene skje 5 til 7 dager etter implantat. Vår avdeling benytter en orthovoltage strålebehandling enhet for stråling godbitutvikling.
   2. Imaging som BLI (bioluminesens Imaging), MR eller CT kan brukes til å visualisere svulsten før randomisering (figur 3A).
   3. Musene er bedøvet med Ketamin / xylazin / saltvann cocktail som før, og øyesalve brukes på øynene.
   4. Musene er plassert i en spesiallaget stråling pilk som er konfigurert som en pai hjul, der lederne for de mus peker mot sentrum. Likene av musene er skjermet fra strålingen med bly.
   5. Medikamentell behandling kan gis enten før eller stråling gjennom ulike levering ruter, dvs. SQ, IP og IV.

IV. Resultater

Musen bør våkne opp fra prosedyren innen 45-60 minutter etter anestesi injeksjon. Hvis musa har så lett å våkne opp etter inngrepet og tid har overskredet en ½ time etter inngrepet, kan musen ikke gjenopprette og aktiv dødshjelp kan være et effektivt alternativ. Hvis there er overdreven blødning eller skallen blir sprakk på noe tidspunkt under prosedyren dødshjelp anbefales. Hvis alt går bra og avhengig cellelinje, bør en svulst begynner å danne innen 2-4 uker etter inngrepet har skje. Ved bruk av intrakraniale xenograft modeller, er terapeutisk effekt vanligvis målt som overlevelse etter implantasjon ^5. Men da dette er en IC modell tegn og symptomer vil oppstå før døden. Noen av de fysiske tegnene på musen kan utvise er en krum holdning, tap av kroppsvekt, og inaktivitet. Noen av de nevrologiske tegn kan være anfall, hode vipping og tap av balanse. Figur 3B viser en HE flekk av en svulst på dødelighet. En Kaplan-Meier plott brukes til å evaluere dataene (figur 4). Antall dager med overlevelse på 50% beregnes og sammenlignet med kontrollgruppen. Hvis kombinasjonen gruppen levde lenger enn tilsetning av den enkelte stråling og narkotika armer kombinasjonen var vellykket.

Figur 1. Den Stoelting Stereotaxic utstyr.

Figur 2. Et diagram av plasseringen av bore hull i musen skallen.

Figur 3A. BLI bildebehandling etter GBM implantasjon.

Figur 3B. H og E av GBM svulst på dødelighet.

Figur 4. Resultater fra U87 IC implantater injisert med PARP hemmer 7 dager etter operasjonen.

Discussion

Ondartede hjernesvulster, slik som glioblastoma multiforme, representerer de vanligste primære hjernesvulster og har en dyster prognose ^fire. Overlevelse av pasienter rammes av GBM har holdt seg omtrent uendret de siste ti årene (dvs. 9-12 måneder etter diagnose) til tross for fremskritt innen kirurgi, stråling og kjemoterapi ^5. Funksjonene i en passende modell for studiet av glioma behandling bør inkludere en reproduserbar svulst beliggenhet og vekst av celler som en relativt diskret svulst; cellene skal ligne så nært som mulig de histologiske trekk av menneskelige hjernesvulst, og det bør være en forutsigbar vekst rate av svulsten, bør muligheten til å vokse svulsten i vev kultur og modellen være i et lite dyr å redusere kostnader ^seks. Effektive behandlinger avhenger eksperimentelle modeller som tett ligner menneskelige GBM egenskaper for uttesting av ny terapi og gir en nøyaktig forståelse av det molekylære grunnlaget for widesprEAD glioma invasjonen ^7. Etterforskning biologi hjernesvulster har også rutinemessig brukt cellelinjer dyrket eller vedlikeholdes in vitro å få informasjon ^8. Hemming av tumor invasjon og angiogenese er et hovedmål i utviklingen av nye terapeutiske strategier mot ondartet hjernesvulst ^9. De begrensede behandlinger alternativene for glioblastom har drevet en intensiv søk i de genetiske forandringer som ligger bak denne dødelige kreft, med sikte på å utvikle mer rasjonelle og mer effektive behandlingsformer ^10.