Det omvända genetik systemet för Rift Valley-feber-virus MP-12 vaccinstam är ett användbart verktyg för att skapa ytterligare MP-12 mutanter med ökad dämpning och immunogenicitet. Vi beskriver protokollet att generera och karaktärisera NSS muterade stammar.
Rift Valley-feber-virus (RVFV), som orsakar hemorragisk feber, neurologiska störningar eller blindhet hos människor, och en hög grad abort och fosterskador hos idisslare 1, har klassificerats som en HHS / USDA överlappning välja agent och en riskgrupp 3 patogen. Det tillhör släktet Phlebovirus i familjen Bunyaviridae och är en av de mest virulenta medlemmar av denna familj. Flera omvänd genetik system för RVFV MP-12 vaccinstammen 2,3 samt vildtyp RVFV stammar 4-6, inklusive ZH548 och ZH501, har utvecklats sedan 2006. MP-12-stam (som är en riskgrupp 2 patogen och en icke-select agent) är mycket försvagade av flera mutationer i sitt M-och L-segment, men ändå bär virulenta S etapper RNA 3, som kodar en funktionell virulens faktor, NSS. Den rMP12-C13type (C13type) transporterar 69% i-frame radering av NSS ORF saknar alla kända NSS funktioner, medan den replikerar som efficma liksom MP-12 i VeroE6 celler som saknar typ I IFN. NSS inducerar en avstängning av värd transkription inklusive interferon (IFN)-beta mRNA 7,8 och främjar nedbrytningen av dubbelsträngat RNA-beroende proteinkinas (PKR) på posttranslationella nivå. 9,10 IFN-beta är transkriptionellt uppregleras av interferon reglerande faktor 3 (IRF-3), NF-kB och aktivator protein-1 (AP-1), och bindningen av IFN-beta för att IFN-alpha/beta receptor (IFNAR) stimulerar transkription av IFN-alfa gener eller andra interferon stimuleras gener (ISGs) 11, som inducerar värd antivirala aktiviteter, medan värd transkription förtryck inklusive IFN-beta genen av NSS förhindrar genen upregulations av dessa ISGs svar på virusreplikationen även IRF-3, NF-kB och aktivator protein-1 (AP-1) kan aktiveras genom RVFV7. . Således är NSS ett utmärkt mål för att ytterligare dämpa MP-12, och öka värd medfödda immunförsvaret genom att avskaffa IFN-beta undertryckande funktion. HärBeskriver vi ett protokoll för att skapa en rekombinant MP-12 kodning muterat NSS, och ger ett exempel på en screening metod för att identifiera NSS mutanter som saknar funktion för att undertrycka IFN-beta mRNA-syntes. Förutom sin viktiga roll i medfödd immunitet, är typ I IFN viktiga för mognaden av dendritiska celler och induktion av ett adaptivt immunsvar 12-14. Således NSS mutanter framkalla typ I-IFN är ytterligare dämpas, men samtidigt är mer effektiva på att stimulera värd immunsvar än vildtyp MP-12, vilket gör dem idealiska kandidater för vaccination metoder.
Omvänd genetik system för RVFV har utvecklats av flera grupper genom att använda T7 promotorn 2,4,5 eller mus 3 eller mänsklig 4 Pol-I promotor. I detta manuskript, beskriver vi ett protokoll för att generera rekombinant RVFV MP-12 stammar genom att använda BHK/T7-9 celler 15 som stabilt uttrycka T7 RNA-polymeras. Effektiviteten av viral återhämtning varierat beroende på skick BHK/T7-9 celler, mängden plasmider, antalet transfekterade celler och så vidare. Vi först…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete har finansierats av licensnummer 5 U54 AI057156-07 via Western Regional Center of Excellence (WRCE), 1 R01 AI08764301-A1 från National Institute of Allergy och infektionssjukdomar, och en intern finansiering från Sealy Centrum för utvecklingen av vaccin vid University of Texas Medical Branch.
Name of the reagent | Company | Catalogue number | Comments (optional) |
Minimum Essential Medium (MEM)-alpha | Invitrogen | 32561037 | |
Dulbecco’s modified minimum essential medium | Invitrogen | 11965092 | |
Modified Eagle Medium (MEM 2x) | Invitrogen | 11935046 | |
Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
Hygromycin B | Cellgro | 30-240-CR | |
Tryptose phosphate broth | MP biomedicals | 1682149 | |
Noble agar | VWR | 101170-362 | |
TransIT-LT1 | Mirus | MIR2300 | |
Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | |
Aerosol tight lid | Eppendorf | C-2223-25 | |
0.33% neutral red solution | Sigma Aldrich | N2889-100ML | |
C57/WT MEF cells | InvivoGen | mef-c57wt | |
Blasticidin S | InvivoGen | Ant-bl-1 | |
Zeocin | InvivoGen | ant-zn-1 | |
QUANTI-Blue | InvivoGen | rep-qb1 | |
BHK/T7-9 cells15 | Gifu university, Japan | ||
Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |