Summary
Системы обратного генетике лихорадка Рифт-Валли Вирус MP-12 вакцинный штамм является полезным инструментом для создания дополнительных MP-12 мутантов с повышенной ослабления и иммуногенности. Мы опишем протокол для получения и характеристики АПЛ мутантных штаммов.
Abstract
Вирус Рифт-Валли (RVFV), что вызывает геморрагическую лихорадку, неврологические расстройства или слепоты у людей, и высокое число абортов и пороков развития плода у жвачных 1, была классифицирована как HHS / USDA перекрытия выбрать агента и группы риска 3 возбудителя. Он принадлежит к роду Phlebovirus в семье буньявирусов и является одним из наиболее опасных членов этой семьи. Несколько систем обратного генетике RVFV MP-12 вакцинного штамма 2,3, а также дикого типа RVFV штаммы 4-6, в том числе и ZH548 ZH501, были разработаны с 2006 года. MP-12 штамма (который группа риска 2 возбудителя и без выбора агента) сильно ослаблена несколькими мутациями в М-и L-сегментов, но все еще несет вирулентных S-сегмента РНК 3, который кодирует функциональный вирулентности фактор, НЗ. RMP12-C13type (C13type) проведение 69% в рамке удаление АПЛ ORF не хватает все известные функции АПЛ, в то время как она воспроизводит efficэтом удобно так же как и МП-12 в клетках не хватает VeroE6 типа я ИФН. АПЛ вызывает запорной принимающих транскрипции в том числе интерферона (ИФН)-бета-мРНК 7,8 и способствует деградации двухцепочечной РНК-зависимой протеинкиназы (PKR) в пост-трансляционной уровне. 9,10 ИФН-бета транскрипционно upregulated интерфероном регуляторного фактора 3 (IRF-3), NF-Кб и активатором белка-1 (AP-1), а также связывание ИФН-бета IFN-alpha/beta рецепторов (IFNAR) стимулирует транскрипцию интерферона-альфа генов или других интерферонов стимулировали генов (ISGs) 11, который индуцирует хост противовирусных мероприятий, в то время как хозяин транскрипции в том числе подавление ИФН-бета гена АПЛ предотвращает гена upregulations тех ISGs в ответ на вирусную репликацию, хотя IRF-3, NF-Кб и активатор белка-1 (AP-1) может быть активирована RVFV7. . Таким образом, НЗ является отличная мишень для дальнейшего ослабления MP-12, а также расширить хост врожденного иммунного ответа путем отмены ИФН-бета подавление функции. ЗдесьМы опишем протокол для создания рекомбинантных MP-12 кодировке мутировал АПЛ, и представляют собой пример метода скрининга для выявления АПЛ мутанты отсутствуют функции для подавления ИФН-бета-мРНК, синтез. В дополнение к его существенную роль в врожденного иммунитета, типа я ИФН важно для созревания дендритных клеток и индукции адаптивного иммунного ответа 12-14. Таким образом, мутанты, вызывающие АПЛ типа я ИФН еще более ослабленной, но в то же время являются более эффективными в стимулировании иммунной ответов, чем дикого типа МП-12, что делает их идеальными кандидатами для вакцинации подходов.
Protocol
1. Восстановление рекомбинантных MP-12 кодировке АПЛ мутации (ы) из плазмиды ДНК 2
- Распространение ребенка почек хомяка (ВНК) / T7-9 клетки 15, которая стабильно выразить Т7 РНК-полимеразы, в 6-см блюда в минимальных базовых средних (MEM)-альфа (Invitrogen, Cat # 32561037), содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS ), пенициллин-стрептомицина (пенициллин: 100 Ед / мл, стрептомицин: 100 мкг / мл) (Invitrogen, Cat # 15140122), и 600 мкг / мл гигромицину B (Cellgro, Кат № 30-240-CR).
* Эффективность вирусных восстановления выше в 6-см блюд, чем в 35-мм блюд. BHK/T7-9 клеток с низким уровнем прохождения обеспечивают более высокие темпы восстановления. Кроме того, другие клеточные линии ВНК, что стабильно выразить Т7 РНК-полимеразы могут быть использованы 4,5,16,17. - Когда клетки достигли 70-80% слияния, замените супернатанта культуры со свежими MEM-альфа, содержащей 10% FBS и пенициллин-стрептомицина (не содержащие гигромицину B).
* Клетки должны быть transfecteг в течение 1 часа после замены среды, чтобы избежать потери T7 выражение РНК-полимеразы. - Для восстановления RVFV, набор плазмид кодирования вирусной геномной РНК для полнометражного вирусной РНК выражение, а второй набор кодирования вирусный ген, открытые рамки считывания для вирусных экспрессии белка (рис. 1 и 2) не требуется. Приготовить смесь из следующих plasmids2 (рис. 2) в 1,5 мл трубки:
- pProT7-S (+) с мутацией (ы) в гене НЗ (2 мг): Эта плазмида кодирует антивирусные смысла (положительно смысле) во всю длину RVFV MP-12 S-сегменте окружении промоутер T7 и Вирус гепатита дельта (HDV) рибозим последовательности.
- pProT7-М (+) (2 мг): Эта плазмида кодирует антивирусные смысла (положительно смысле) во всю длину RVFV MP-12 М-сегменте окружении промоутер T7 и последовательности HDV рибозима.
- pProT7-L (+) (2 мг): Эта плазмида кодирует антивирусные смысла (положительно смысле) во всю длину RVFV MP-12 L-сегмент FLAnked от промоутера T7 и последовательности HDV рибозима.
- pT7-IRES-VN (2 мг): Эта плазмида кодирует RVFV MP-12 N открытые рамки считывания (ORF) вниз по течению от промоутера T7 и энцефаломиокардита вируса (EMCV) внутренний сайт рибосомы въезд (IRES).
- pT7-IRES-VL (1 мг): Эта плазмида кодирует RVFV MP-12 L ORF ниже по течению от промоутера T7 и EMCV IRES.
- pCAGGS-VG (1 мг): Эта плазмида кодирует RVFV MP-12 М ORF ниже по течению от куриного бета-актина промоутера.
* Добавление pT7-IRES-В.Н., pT7-IRES-VL и pCAGGS-VG не является необходимым для восстановления MP-12, но это повышает эффективность спасательных 2. Авторы опытных бедных выражения Gn / Gc с помощью pT7-IRES плазмиды, вероятно, из-за отсутствия вытекающих сканирование AUGs рибосомами. Таким образом, мы построили pCAGGS-VG для крышки зависит от Gn / Gc выражения.
- Добавить 30 мл Транзит-LT1 (Mirus, Cat # MIR2300) до 385 мл Opti-MEM (Invitrogeп, Cat # 31985070) в 1,5 мл трубки, и вихрь кратко.
- Через 5 мин инкубации при комнатной температуре, медленно добавить Opti-MEM содержащих липосомы с плазмиды смеси от 1,3 до шага, аккуратно перемешать с помощью пипетки и инкубировать в течение 15 мин при комнатной температуре.
- Добавить смесь липосом и плазмиды в культуральной среды BHK/T7-9 клетки шагом 1,2 по капле (рис. 3).
- Инкубируйте трансфицированных клеток при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO 2 в течение 24 ч, и заменить супернатанта культуры со свежими MEM-альфа, содержащей 10% FBS и пенициллин-стрептомицина (не содержащие гигромицину B).
- Инкубируйте клетки при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO 2 в течение 4 дополнительных дней (инкубировать 5 дней всего), и собирают супернатанты культуры в 15 мл трубки.
* Цитопатический эффект (ЦПЭ) здесь наблюдается не обязательно отражает результат успешной вирусной восстановления, потому что трансфекциивызывает гибель клеток, которая появляется похож на CPE вызванных вирусной репликации РНК или вирусной синтеза белка. - Центрифуга супернатантов при 2200 мкг при 4 ° С в течение 5 мин.
* Цель этого шага заключается в гранулах до распада клеток от вирусных акций. Аэрозоль-плотные центрифуги ведро рекомендуется для повышения безопасности. - Передача супернатанты в завинчивающейся крышкой 5 cryotubes мл, и хранить проход 0 (Р0) вирус фондовом при -80 ° C для дальнейшего использования.
2. Усиление P0 вирус
- P0 образцы часто содержат недостаточное вирусного титра для последующих экспериментов 2. Усиление шаг в VeroE6 клеток, что клон африканских зеленых мартышек почек (Vero) клеток не хватает IFN-alpha/beta генов 18,19, увеличивает вирусную титра до максимального уровня. Кроме того, другим клеткам не хватает типа я ИФН ответов, таких как клетки Hec1B 20 или MEF клетки IFNAR1-нокаутных мышей 21 mighт быть использованы для этого шага. Распространение VeroE6 клеток в 10-см блюд в модифицированной минимальный Дульбеко необходимой среде (DMEM) (Invitrogen, Cat # 11965092), содержащей 10% FBS, пенициллин-стрептомицина (пенициллин: 100 Ед / мл, стрептомицин: 100 мг / мл), и инкубировать при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO 2, пока они не достигнут 80% слияния.
* Рекомбинантный MP-12 штаммов кодирования мутант НЗ часто не в состоянии повторить эффективно типа я ИФН-компетентных клеток. - Смешайте 300 мл P0 образцов с 2,7 мл DMEM с 10% FBS и пенициллин-стрептомицина. Удалить из культуральной среде VeroE6 клетки, начиная с шага 2.1 и заменить разбавленным P0 образца. Инкубировать при 37 ° С в течение 1 ч в инкубаторе с 5% CO 2.
- Удалить инокулята и добавить 10 мл DMEM с 10% FBS и пенициллин-стрептомицина к каждому блюду.
- Инкубировать при 37 ° С в течение от 3 до 4 дней, пока CPE из VeroE6 клетки становится очевидной.
* Нарушение монослоя происходит во время МП-12 инфекции, whilэлектронной рекомбинантный MP-12 не хватает НЗ, такие как rMP12-C13type (C13type) (рис. 4), не нарушает монослоя, но число погибших плавающие клетки появляются от 2 до 3 дней после заражения. - Урожай супернатант от 3 до 4 точек на дюйм, как описано в разделах 1.9) и 1,10), а также назначить образцов E6P1.
3. Титрование рекомбинантный MP-12 бляшкой анализа
- Распространение VeroE6 клеток в 6-луночных планшетах.
* Повторяющиеся анализ по образцу более надежна, чем одного анализа. - Когда VeroE6 клетки выросли на 80% слияния, готовят 10-кратным серийные разведения образцов вирусов в DMEM с 10% FBS и пенициллин-стрептомицина до 10-6 следующим образом:
- 10 мкл образца E6P1 + 990 мл DMEM с 10% FBS и пенициллин-стрептомицина (10 -2 разбавления)
- 100 мкл 10 -2 образца + 900 мл DMEM с 10% FBS и пенициллин-стрептомицина (10 -3 разбавления)
- 100мкл 10 -3 образца + 900 мл DMEM с 10% FBS и пенициллин-стрептомицина (10 -4 разбавления)
- 100 мкл образца 10 -4 + 900 мл DMEM с 10% FBS и пенициллин-стрептомицина (10-5 разведения)
- Аспирируйте среды от 6-луночный планшет с шагом 3,1 и добавьте 400 мкл каждого разведения (с шагом 3.2) в скважинах (рис. 3).
- Инкубировать при 37 ° С в течение 1 ч в инкубаторе с 5% CO 2.
- Во время инкубации, подготовить два 15 мл трубы для агар-наложения следующим образом:
Труба (имейте в 42 ° С водяной бане): 7 мл 1,2% благородных агар (VWR, Cat # 101170-362) в воде
Труба В (имейте в 37 ° С водяной бане): 7 мл модифицированного Eagle Средняя (MEM 2x) (Invitrogen, Cat # 11935046), содержащей 10% FBS, пенициллин-стрептомицина (пенициллин: 100 Ед / мл, стрептомицин: 100 мкг / мл), и 10% фосфатов Tryptose бульон (MP Biomedicals, Cat # 1682149). - Через 1 ч инкубации, удалить вирусныеинокулята, и сразу же добавьте 2 мл на лунку смесь 1:1 трубки и трубки B (с шагом 3,5).
* Следите за тем, чтобы добавить наложение сразу же, как высыхание скважин причины смерти неинфицированных клеток. - Инкубируйте пластин при 37 ° С в течение 3 дней в инкубаторе с 5% CO 2.
- Подготовка трубки и трубки B снова, как описано в пункте 3.5. Подготовка и 500 мкл 0,33% нейтральный раствор красного (Sigma Aldrich, Cat # N2889-100мл) на пластину, которая также хранится при температуре 37 ° С водяной бане.
- Смешайте трубки, трубки B и 500 мл (конечная конц. 0,011%) нейтральных красный раствор и добавьте 2 мл смеси в каждую лунку.
* Количество нейтрального красного решения, которые будут добавлены зависит от многих нейтральный красный раствор, и начальная оптимизация не требуется. Долгосрочное хранение 0,33% нейтрального красного решение вызывает осаждение. В таких случаях, осадок может быть полностью распущен инкубации при 55 ° С в течение 10 мин, а затем путем энергичного встряхивания. Использование осажденный нейтральной тред решение приводит к слабым окрашивания клеток, в то время снова растворяли нейтральный красный раствор пятна клетки хорошо. - Инкубируйте планшет в течение 16 часов (или на ночь) при 37 ° C в инкубаторе с 5% CO 2.
- Подсчитайте количество бляшек в колодец, который содержит от 10 до 100 бляшек на лунку. Подсчитать количество бляшкообразующих ед / мл. Например, если мы наблюдаем 28 бляшек в скважинах засевают 10 -5 разведения, 28 (# бляшек) х (1 ml/0.4 мл) х 10 5 (разбавления) = 7,0 • 10 6 бляшкообразующих единиц (БОЕ) / мл (рис. 5).
4. Скрининг АПЛ мутантов не хватает типа я ИФН подавления функции
- Распространение C57/WT MEF клеток (InvivoGen, Cat # MEF-c57wt), которые кодируют эмбриональные выделяется щелочной фосфатазы (СЕАП) гена индуцибельной от NF-Кб и ФИА-3 / 7 (рис. 6), в 12-луночных планшетах. Клетки сохраняются в DMEM с 10% FBS, пенициллин-стрептомицина (PeniciОИСДП: 100 Ед / мл, стрептомицин: 100 мкг / мл), Blasticidin S (3 мг / мл) и Zeocin (100 мкг / мл).
- Когда клетки становятся к югу от сливной (80%), клетки макет-инфицированных или инфицированных MP-12 или рекомбинантного MP-12 кодировке АПЛ мутации в множественности заражения (МВД) в размере 3 или 0.1 (см. разделы 2 и 3, количество каждый посевной должна быть 300 мкл). На 1-инфекции сообщению ч, удалите инокулята, и добавьте 1 мл на лунку DMEM с 10% FBS, пенициллин-стрептомицина (пенициллин: 100 Ед / мл, стрептомицин: 100 мкг / мл) (Blasticidin и Zeocin не добавляются в этот времени).
- В 14 ч после инфекции, собирают супернатанты культуры. Добавить 200 мкл коли-синий (InvivoGen, Cat # пред-QB1) и 50 мкл каждого образца (в трех экземплярах) до лунки 96-луночного планшета. Печать и инкубировать пластины при температуре 37 ° С в течение 1 ч.
* Оба МП-12 и рекомбинантных MP-12 не хватает АПЛ ясно вызвать хост поступательного подавления в IFN-alpha/beta компетентных клеток в том числе 293 клеток, MRC-5 клеток и мыши EMBRйони фибробласты (MEF) клеток после 14 часов после инфицирования при высоких МВД. С другой стороны, ИФН-бета-мРНК или иРНК ISG56 накапливается в изобилии от 7 до 8 часов после инфекции в тип-I IFN компетентных клеток. Таким образом, мы выбрали 14 часов после инфицирования собирать супернатанты видеть накопления SEAP индуцированных врожденных иммунных реакций. - Прочитано значения ОП при 650 нм, используя ридер (рис. 7).
* Результаты согласуются с данными, полученными Северной пятно использованием зонда РНК, характерные для мыши ISG56 мРНК, которая проявляется регуляции ISG56 мРНК в отсутствие НЗ выражении (рис. 8).
* Следует отметить, что деятельность СЕАП определяется обилие белков, которые могут пострадать от хоста деятельности перевода. Относительный уровень SEAP не может быть высокой по сравнению с возросшим уровнем мРНК, потому SEAP не могут быть синтезированы еще в присутствии SEAP мРНК, если сотовая перевод supprЭссед. Северный пятно является более простой анализ и более точно оценить количество мРНК индуцированной из-за отсутствия АПЛ функции в инфицированных клетках, чем анализ репортер СЕАП. Тем не менее, система SEAP репортер происходит быстрее, чем Северное пятно и, следовательно, полезны для быстрого скрининга АПЛ мутантов потенциально отсутствует хозяин транскрипции подавление функции.
5. Представитель Результаты:
Системы обратного генетики последовательно порожденных жизнеспособных рекомбинантных MP-12 вирусов с титром выше, чем 1 х 10 6 БОЕ / мл. C13type вирус не хватает АПЛ функции образуются большие бляшки мутной, в то время как MP-12 сформирована ясно бляшки различных размеров 2 (рис. 5). Мок-инфицированных C57/WT MEF клеток или инфицированных MP-12 не повысит уровень СЕАП в супернатант культуры по сравнению с макетом инфицированных клетках, в то время как культура супернатанта C57/WT клетки MEF инфицированных C13type содержащихся увеличилсяУровень SEAP на 14 часа после заражения (ИНН) (рис. 7). Эти результаты согласуются с результатами, полученными при использовании Северного пятно зонда РНК, характерные для мыши ISG56 мРНК (рис. 8).
Рисунок 1. Геном структуры RVFV
RVFV имеет трехсторонний отрицательного смысла или ambisense РНК генома названный S-, M-и L-сегменте. S-сегмент кодирует N и НЗ генов в ambisense образом. N мРНК синтезируется из-вирусное смысле (отрицательного смысла) S-сегмента, в то время как АПЛ мРНК синтезируется из антивирусных смысла (положительного смысла) S-сегменте. М-сегмент кодирует одну мРНК M и синтезирует the78kD, Н • м, Gn или Gc белков вытекающей сканирования нескольких AUGs на 5'region мРНК M, а затем их совместного поступательного расщепления 22,23. L-сегмент кодирует белок L. Оба N и L белки необходимы для вирусной транскрипции и репликации, а Gn и Gc являются вирусные белки конверте. НЗ и Н • м белки неструктурных белков, которые не включены в вирусные частицы.
Рисунок 2.. Дизайн плазмидной ДНК для восстановления рекомбинантных RVFV MP-12 штамма
КДНК, кодирующей полнометражный анти-вирусных смысла, S-, M-или L-сегменте cloneddownstream промоутера T7 и вверх по течению от вируса гепатита дельта (HDV) рибозим последовательности, обозначенные как pProT7-S (+), pProT7-М (+), или pProT7-L (+), соответственно 2. Т7 РНК-полимеразы выражается в BHK/T7-9 клетки транскрибирует кодирование РНК полнометражный S-, M-или L-сегмент с точным конце генома 3 '. Открытые рамки считывания (ORF) в N или L белки клонированных под энцефаломиокардита вируса (EMCV) внутренний сайт рибосомы въезд (IRES), которые обозначены как pT7-IRES-VN или pT7-IRES-VL, соответственно, позволяют без колпачков T7 РНК стенограммы, чтобы быть признанными рибосомы в кепке-независимыхвмятина образом. М ORF клонируется под куриный б-актина промоутер pCAGGS плазмиды 24, которая обозначена как pCAGGS-VG, чтобы синтез 78kD, Н • м, Gn и Gc белки, которые образуются из разных AUGs по вытекающей сканирования 23. Оба N и L белки, необходимые для инициирования транскрипции или репликации РНК, в то время pT7-IRES-VN и pT7-IRES-ВЛ не являются необходимыми для восстановления рекомбинантных MP-12 2, вероятно, связано с предположительным вытекающей выражение Pol- II-приводом ограничено РНК-транскрипты кодирования N-ORF и L-ORF из pProT7-S (+) и pProT7-L (+), соответственно.
Рисунок 3. Восстановление RVFV MP-12 из плазмидной ДНК
Трансфекция BHK/T7-9 клеток с pProT7-S (+), pProT7-М (+), pProT7-L (+), pT7-IRES-В.Н., pT7-IRES-VL и pCAGGS-VG плазмиды (рис.1 ) создает инфекционных рекомбинантный RVFV MP-12 напряжение в супернатант культурыs. Супернатант в 5 трансфекции сообщение день собираются, и пассировать на свежий Vero E6 клеток для вирусного усиления. Как правило, более 1 х 10 6 БОЕ / мл вирус может быть восстановлен на 3 до 4 дней после инфекции. Усиливается вируса (вирус E6P1) титруют с помощью доски анализа с Vero E6 клеток и используются для анализа фенотипа и иммуногенность исследований.
Рисунок 4. S-сегмента МП-12 и rMP12-C13type
Сравнение МП-12 и rMP12-C13type (C13type) S-сегментов. По сравнению с АПЛ MP-12 штамм, НЗ ORF из C13type урезается на 69%, и такая же, естественно изолированных клон 13 штамма 2,25.
Рисунок 5. Налет тест для MP-12 (функциональные НЗ) и C13type (нефункциональные НЗ)
Монослой Веро E6 элементов в 6-луночный планшет используется для доски анализа. Через 3 дня инкубации с 0,6% агара наложения, второй наложения агара, содержащего нейтральный красный раствор добавляют. Затем, бляшки считаются по 4-й день после заражения. MP-12 формы ясно бляшки различных размеров, в то время C13type образует крупные бляшки мутной (или очагов). А с 10 до 100 бляшки должны использоваться для подсчета голосов.
Рисунок 6. Активация путь выделяется щелочной фосфатазы (СЕАП), репортер ген в клетки C57/WT MEF
Интерферон-бета-промоутер включает в себя обязательную последовательность АР-1, NF-Кб и ФИА-3. RVFV репликация активирует AP-1, NF-Кб и ФИА-3 7,11. Тем не менее, АПЛ ингибировать высвобождение репрессор комплекса с ИФН-бета-промоутер даже после связывания этих транскрипционных факторов, тем самым подавляя синтез ИФН-бета-мРНК 26. Кроме того, АПЛ секвестры TFIIH P44 и subunits8РБП способствует деградации TFIIH P62 подразделения 27, таким образом вызывая общее подавление транскрипции хост в том числе интерферона-альфа-гена и гена под ISRE промоутера. C13type или других АПЛ мутантов не хватает ИФН-бета подавление функции вызывают ИФН-бета-синтез, который, в свою очередь, активирует ИФН-альфа-промотора и интерферон-чувствительный элемент ответа (ISRE) промоутера. IRF-7 является то транскрипционно upregulated по IFN-alpha/beta стимулирование и дальнейшее upregulated на ИФН-альфа в поддержку IRF-3 28,29. В данном анализе C57/WT MEF клетки кодируют выделяется щелочной фосфатазы (СЕАП) на выходе из искусственного обязательной последовательности NF-Кб, IRF-3 и IRF-7. Таким образом, НЗ мутантов не хватает ИФН-бета подавление функции upregulate SEAP которого секреции затем измеряется.
Рисунок 7. Индукция СЕАП по C13type
C57/WT MEF клеток (InvivoGen) были макет-Инфицированным или инфицированных MP-12 или rMP12-C13type (C13type) при МВД 3 (левая панель) или 0,01 (правая панель). Культура супернатанты (50 мкл) в 14 HPI смешивали с 200 мкл коли-синий (InvivoGen) субстрата в 96 ячейках и значения ОП при 650 нм измеряли через 1 ч инкубации при температуре 37 ° С ридер. Относительное увеличение SEAP издеваться над-инфицированные клетки показано на рисунке. Данные представляют собой среднее значение + / - стандартное отклонение из трех независимых экспериментов. Супернатант культуры от C13type-инфицированные клетки показывает увеличение SEAP, предполагая отсутствие принимающих подавления транскрипции НЗ.
Рисунок 8. Северной промокните DIG-меченой РНК зонд
Дикого типа мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) клетки макет-инфицированных или инфицированных MP-12 или rMP12-C13type (C13type) при МВД 3. Тотальная РНК была собрана в 7 HPI с помощью Trizol (Invitrogen), и Северной бМного было выполнено с помощью дигоксигенин-меченой РНК зонд специфичные для мыши эндогенных ISG56 мРНК или MP-12 N мРНК / анти-вирусной смысле S-сегменте 2,30. Для изготовления зондов для мыши эндогенных ISG56 мРНК или иРНК RVFV N / анти-вирусной смысле S-сегмента, ПЦР-фрагментов усиливается грунтовки набор KpnmISG56F (GGG TGG TAC CGC TCC ACT TTC AGA GCC TTC GCA AAG CAG) и HindmISG56 (TAC AAA GCT ТАТ GGG AGA ГАА ТГК TGA TGA TGG ОСО GG) для ISG56 мРНК или KpnNF (АГТ TGG TAC CAT GGA CAA CTA TCA AGA GCT ТГК G) и HindNR (GGG CAA GCT ТТТ AGG CTG CTG TGT AAG TCT) для RVFV N мРНК / анти-вирусной смысле S-сегменте переваривали Kpn я и Hind III, и лигировали в pSPT18 плазмиды (Roche. Затем РНК проб, соединенных с дигоксигенин были синтезированы с помощью РНК-DIG Маркировка Kit (SP6/T7) (Roche, Cat # 1 175 025). уровне 28S рРНК каждого образца также показано, как загрузка контроля. дикого типа MEF клетки, инфицированные C13type индуцированных ISG56 мРНК синтез, а те, инфицированных МП-12 Не побудить его, предполагая отсутствие принимающих транскрипции подавления в C13type-инфицированных клеток. Данные согласуются с результатами, полученными при анализе SEAP на рисунке 6.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Обратной генетики системы RVFV были разработаны несколько групп, используя T7 промоутер 2,4,5 или мыши 3 или 4 человека поли-я промоутер. В этой рукописи, мы опишем протокол для получения рекомбинантных RVFV MP-12 штаммов с помощью BHK/T7-9 клетки 15, что стабильно выразить Т7 РНК-полимеразы. Эффективность вирусного восстановления варьируется в зависимости от состояния BHK/T7-9 клеток, количество плазмиды, число трансфицированных клеток и так далее. Мы всегда усиливают P0 вируса в клетках Vero E6 для получения высоких запасов вируса титр для экспериментов. Типа I IFN-компетентные клетки, такие как человеческих диплоидных легких (MRC-5) клетки могут быть использованы для усиления вирусной только тогда, когда АПЛ функция поддерживается эффективной репликации вируса, препятствуя противовирусных мероприятий, включая тип-I IFN или PKR.
Доска анализа является весьма полезным методом для титрования MP-12 и АПЛ мутантов. В качестве общей меры предосторожности длядоска анализа, камеры должны быть тут же добавил с наложением при соответствующей температуре после удаления вирусного инокулята. Кристаллический фиолетовый окрашивания не подходят для обнаружения C13type бляшек вирус, потому C13type вирус не нарушает монослоя клетки Vero E6 2. С другой стороны, нейтрального красного окрашивания может успешно обнаружить бляшки образуются на C13type вируса. Прочность ячеистого окрашивания нейтральным красным определяется относительным включение нейтрального красного красителя в живых клетках. Таким образом, вполне вероятно, что C13type-инфицированные клетки имеют сниженную активность метаболических что приводит к снижению включения нейтрального красителя красного сравнению с неинфицированных клеток, и который является слабое внимание окрашивания. Необходимое количество нейтрального красного зависит от многих нейтральных красный раствор. Длительное хранение нейтрального красного решение часто порождает осадков. Это может быть предотвращено путем тепловой растворения нейтрального красного раствора при 55 ° С в течение 10 минут, однако онавлияет на окрашивание клеток.
Важно использовать вирусы с точным вирусного титра в экспериментах. Титр в вирусных акций может быть уменьшен на средах с рН ниже 6,5 31 о чем свидетельствует желтоватый цвет фенола красного вирусных акций, длительного хранения, повторные циклов замораживания-оттаивания и так далее. Таким образом, важно использовать свежие вирусные акции по вакцинации животных или титровать акции снова непосредственно перед экспериментом.
RVFV кодировать два характеризуется неструктурных белков; НЗ и Н • м. RVFV хватает АПЛ значительно ослабленных животных в 25,32, в то время RVFV хватает Н • м до сих пор высоко вирулентных у крыс 33. Таким образом, АПЛ играет важную роль в качестве фактора вирулентности в патогенезе. НЗ представляет собой многофункциональный белок, который вызывает 1) подавление принимающих общие транскрипции 8, 2) подавление ИФН-бета-синтез мРНК 26 и 3) деградация дсРНК-Dependent протеинкиназы (PKR) 9,10. Родительского MP-12 штамм может быть дальше ослабляться введения усечения или мутаций в НЗ. С другой стороны, это также важно для поддержания иммуногенности таких мутантов MP-12. Типа I ИФН играет роль созревание дендритных клеток, что важно для дифференциации Т-клеток и В-клеток 12-14. Различные мутанты АПЛ хватает ИФН-бета подавление функции, которые поддерживают полную или частичную функции АПЛ, которые полезны для анализа влияния НЗ-опосредованной ИФН-бета подавление функции на иммуногенность и безопасность вакцин-кандидатов. Известно, что клетки, инфицированные RVFV вес ZH548 напряжение активации NF-Кб, IRF-3 и AP-1 (рис. 6), в то время как интерферон бета-синтез мРНК подавлен НЗ на уровне транскрипции 7. Таким образом, МП-12, который выражает полнофункциональную АПЛ 3, ингибирует синтез NF-kB/IRF-3/7-inducible SEAP мРНК гена-репортера в transcriptional уровне, в то время как рекомбинантный MP-12 не хватает АПЛ функции, такие как C13type может индуцировать синтез мРНК SEAP (рис. 7). Для правильного понимания результате иммуногенности таких мутантов, фенотипов следует дополнительно характеризуется в клеточной системы культуры. Например, вирусная кинетика репликации должны быть проверены в тип-I IFN компетентные клетки, такие как человеческих диплоидных легких MRC-5 клеток или мышиных эмбриональных фибробластов (MEF) клеток. Функция PKR деградации может быть проверена иммуноблоттинг с антителами, специфичными к человеку или мыши PKR. ИФН-бета-мРНК индукции АПЛ мутации должны быть подтверждены Северной промокните дигоксигенин-меченой РНК зонд специфичны для человека или мыши ИФН-бета-мРНК. Хост общего подавления транскрипции может быть проверено путем анализа включение аналоговых уридина в зарождающейся мРНК. В конце концов, иммуногенность и безопасность кандидата в депутаты-12 мутанты АПЛ должна быть проверена на мышах. Как правило, 1 х 10 5 БОЕ от кандидозаТе вакцины разводят в PBS является подкожно и сывороток собраны из ретро-орбитальной синуса в день 30 (или 42) и 180-й день проверяются на наличие нейтрализующих антител уменьшения налета нейтрализации тест (Prnt 80) и общего IgG против RVFV N и Gn / Gc на IgG ELISA покрытием с очищенной рекомбинантной вирусных белков. Эффективность вакцин-кандидатов может быть проверена, бросая вызов мышей на 42 дней после иммунизации с диким типом ZH501 (например, IP, 1 х 10 3 БОЕ) на животное уровня биобезопасности (BSL) 4 объекта или расширение BSL3 + объекте в США обратном генетике подход является мощным инструментом для разработки и создания безопасной и иммуногенной живых ослабленных вакцин RVFV.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Нам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа финансировалась грантом № 5, U54 AI057156-07 через западный региональный центр повышения квалификации (WRCE), 1 AI08764301 R01-A1 от Национального института аллергии и инфекционных заболеваний, а внутреннее финансирование от Сили Центра разработки вакцин при Университете Техасского медицинского отделения.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Minimum Essential Medium (MEM)-alpha | Invitrogen | 32561037 | |
| Dulbecco’s modified minimum essential medium | Invitrogen | 11965092 | |
| Modified Eagle Medium (MEM 2x) | Invitrogen | 11935046 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | |
| Hygromycin B | Cellgro | 30-240-CR | |
| Tryptose phosphate broth | MP Biomedicals | 1682149 | |
| Noble agar | VWR international | 101170-362 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bio LLC | MIR2300 | |
| Opti-MEM | Invitrogen | 31985070 | |
| Aerosol tight lid | Eppendorf | C-2223-25 | |
| 0.33% neutral red solution | Sigma-Aldrich | N2889-100ML | |
| C57/WT MEF cells | Invitrogen | mef-c57wt | |
| Blasticidin S | Invitrogen | Ant-bl-1 | |
| Zeocin | Invitrogen | ant-zn-1 | |
| QUANTI-Blue | Invitrogen | rep-qb1 | |
| BHK/T7-9 cells15 | Gifu university, Japan | ||
| Vero E6 cells | ATCC | CRL-1586 |
References
- Bird, B. H., Ksiazek, T. G., Nichol, S. T., Maclachlan, N. J. Rift Valley fever virus. J. Am. Vet. Med. Assoc. 234, 883-893 (2009).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rescue of infectious rift valley fever virus entirely from cDNA, analysis of virus lacking the NSs gene, and expression of a foreign gene. J. Virol. 80, 2933-2940 (2006).
- Billecocq, A. RNA polymerase I-mediated expression of viral RNA for the rescue of infectious virulent and avirulent Rift Valley fever viruses. Virology. 378, 377-384 (2008).
- Habjan, M., Penski, N., Spiegel, M., Weber, F. T7 RNA polymerase-dependent and -independent systems for cDNA-based rescue of Rift Valley fever virus. J. Gen. Virol. 89, 2157-2166 (2008).
- Gerrard, S. R., Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. The NSm proteins of Rift Valley fever virus are dispensable for maturation, replication and infection. Virology. 359, 459-465 (2007).
- Billecocq, A. NSs protein of Rift Valley fever virus blocks interferon production by inhibiting host gene transcription. J. Virol. 78, 9798-9806 (2004).
- May, N. L. e TFIIH transcription factor, a target for the Rift Valley hemorrhagic fever virus. Cell. 116, 541-550 (2004).
- Ikegami, T. Rift Valley fever virus NSs protein promotes post-transcriptional downregulation of protein kinase PKR and inhibits eIF2alpha phosphorylation. PLoS Pathog. 5, e1000287-e1000287 (2009).
- Habjan, M. NSs protein of Rift valley fever virus induces the specific degradation of the double-stranded RNA-dependent protein kinase. J. Virol. 83, 4365-4375 (2009).
- Garcia-Sastre, A., Biron, C. A. Type 1 interferons and the virus-host relationship: a lesson in detente. Science. 312, 879-882 (2006).
- Bon, A. L. e Type i interferons potently enhance humoral immunity and can promote isotype switching by stimulating dendritic cells in vivo. Immunity. 14, 461-470 (2001).
- Le Bon, A., Tough, D. F. Links between innate and adaptive immunity via type I interferon. Curr. Opin. Immunol. 14, 432-436 (2002).
- Tough, D. F. Type I interferon as a link between innate and adaptive immunity through dendritic cell stimulation. Leuk. Lymphoma. 45, 257-264 (2004).
- Ito, N. Improved recovery of rabies virus from cloned cDNA using a vaccinia virus-free reverse genetics system. Microbiol. Immunol. 47, 613-617 (2003).
- Terasaki, K., Murakami, S., Lokugamage, K. G., Makino, S. Mechanism of tripartite RNA genome packaging in Rift Valley fever virus. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 804-809 (2010).
- Buchholz, U. J., Finke, S., Conzelmann, K. K. Generation of bovine respiratory syncytial virus (BRSV) from cDNA: BRSV NS2 is not essential for virus replication in tissue culture, and the human RSV leader region acts as a functional BRSV genome promoter. J. Virol. 73, 251-259 (1999).
- Diaz, M. O. Homozygous deletion of the alpha- and beta 1-interferon genes in human leukemia and derived cell lines. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 85, 5259-5263 (1988).
- Mosca, J. D., Pitha, P. M. Transcriptional and posttranscriptional regulation of exogenous human beta interferon gene in simian cells defective in interferon synthesis. Mol. Cell. Biol. 6, 2279-2283 (1986).
- Constantinescu, S. N. Expression and signaling specificity of the IFNAR chain of the type I interferon receptor complex. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92, 10487-10491 (1995).
- Kumar, K. G., Tang, W., Ravindranath, A. K., Clark, W. A., Croze, E., Fuchs, S. Y. SCF(HOS) ubiquitin ligase mediates the ligand-induced down-regulation of the interferon-alpha receptor. EMBO J. 22, 5480-5490 (2003).
- Kakach, L. T., Suzich, J. A., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: phlebovirus expression strategy and protein glycosylation. Virology. 170, 505-510 (1989).
- Kakach, L. T., Wasmoen, T. L., Collett, M. S. Rift Valley fever virus M segment: use of recombinant vaccinia viruses to study Phlebovirus gene expression. J. Virol. 62, 826-833 (1988).
- Niwa, H., Yamamura, K., Miyazaki, J. Efficient selection for high-expression transfectants with a novel eukaryotic vector. Gene. 108, 193-199 (1991).
- Muller, R. Characterization of clone 13, a naturally attenuated avirulent isolate of Rift Valley fever virus, which is altered in the small segment. Am. J. Trop. Med. Hyg. 53, 405-411 (1995).
- Le May, N. A SAP30 complex inhibits IFN-beta expression in Rift Valley fever virus infected cells. PLoS Pathog. 4, e13-e13 (2008).
- Kalveram, B., Lihoradova, O., Ikegami, T. NSs Protein of Rift Valley Fever Virus Promotes Post-Translational Downregulation of the TFIIH Subunit p62. J. Virol. 85, 6234-6243 (2011).
- Taniguchi, T., Ogasawara, K., Takaoka, A., Tanaka, N. IRF family of transcription factors as regulators of host defense. Annu. Rev. Immunol. 19, 623-655 (2001).
- Marie, I., Durbin, J. E., Levy, D. E. Differential viral induction of distinct interferon-alpha genes by positive feedback through interferon regulatory factor-7. EMBO J. 17, 6660-6669 (1998).
- Ikegami, T., Won, S., Peters, C. J., Makino, S. Rift Valley fever virus NSs mRNA is transcribed from an incoming anti-viral-sense S RNA segment. J. Virol. 79, 12106-12111 (2005).
- Mims, C. A. Rift Valley Fever virus in mice. I. General features of the infection. Br. J. Exp. Pathol. 37, 99-109 (1956).
- Bouloy, M. Genetic evidence for an interferon-antagonistic function of rift valley fever virus nonstructural protein NSs. J. Virol. 75, 1371-1377 (2001).
- Bird, B. H., Albarino, C. G., Nichol, S. T. Rift Valley fever virus lacking NSm proteins retains high virulence in vivo and may provide a model of human delayed onset neurologic disease. Virology. 362, 10-15 (2007).
