Intrakraniell Implantasjon med påfølgende 3D In Vivo Bioluminescent Imaging of murine Hjernesvulst

Summary

Intrakraniell implantering av GL261 celler inn C57BL / 6 mus produserer ondartet hjernesvulst at rekapitulere mange av kjennetegnene til human glioblastoma multiforme. Vi brukte GL261 cellene stabilt uttrykker luciferase å tillate oss å bruke

Abstract

Musen glioma 261 (GL261) er anerkjent som en in vivo modell som sammenfatter mange av funksjonene i human glioblastoma multiforme (GBM). Cellen linjen ble opprinnelig indusert av intrakraniale injeksjon av 3-metyl-cholantrene inn i en C57BL / 6 syngeneic mus påkjenning ^1; derfor immunologisk kompetent C57BL / 6 mus kan brukes. Mens vi bruker GL261, kan følgende protokoll brukes til implantering og overvåking av alle intrakranielle mus tumor modell. GL261 celler ble konstruert for å stabilt uttrykke ildflue luciferase (GL261-luc). Vi har også laget lysere GL261-luc2 cellelinje ved stabil transfeksjon av luc2 genet uttrykkes fra CMV arrangøren. C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr mus (albino variant av C57BL / 6) fra National Cancer Institute, Frederick, MD ble brukt til å eliminere lys demping forårsaket av svart hud og pels. Med bruk av albino C57BL / 6 mus; in vivo avbildning bruke IVIS Spectrum in vivo imaging system er mulig fra den dagen implantasjon (Caliper Life Sciences, Hopkinton, MA). Den GL261-luc og GL261-luc2 cellelinjene viste samme in vivo oppførsel som foreldrenes GL261 cellene. Noen av de delte histologiske funksjonene i humant GBMS og denne musen modellen inkluderer: tumor nekrose, pseudopalisades, neovascularization, invasjon, hypercellularity, og betennelse ^1.

Før implantasjon Dyrene ble bedøvet av en intraperitoneal injeksjon av ketamin (50 mg / kg), xylazin (5 mg / kg) og buprenorfin (0,05 mg / kg), plassert i en stereotactic apparat og et snitt ble laget med en skalpell over kraniale midtlinjen. En burrhole ble gjort 0.1mm posteriort for bregma og 2.3mm til høyre for midtlinjen. En nål ble satt inn til en dybde av 3mm og trukket 0.4mm til en dybde på 2,6 mm. To mL av GL261-luc eller GL261-luc2 celler (10 ⁷ celler / ml) var infunderes i løpet av 3 minutter. Den burrhole ble stengtmed bonewax og snittet var sutureres.

Etter stereotactic implantasjon av bioluminescent cellene er synlig fra den dagen implantasjon og svulsten kan analyseres ved hjelp av 3D-bildet rekonstruksjon funksjon i IVIS Spectrum instrument. Dyr får en subkutan injeksjon av 150μg luciferin / kg kroppsvekt 20 min før bildebehandling. Tumor byrde er kvantifisert bruker bety svulst bioluminesens over tid. Tumor-bærende mus ble observert daglig for å vurdere sykelighet og ble avlivet når ett eller flere av følgende symptomer er til stede: slapphet, manglende ambulate, sammenkrøket holdning, unnlatelse av å stelle, anoreksi resulterer i> 10% tap av vekt. Svulster var tydelig i alle dyrene på obduksjon.

Protocol

1. Cell Culture

1. Den GL26 cellelinje ble hentet fra Division of Cancer Treatment og diagnose (DCTD) National Cancer Institute (NCI), Frederick, MD. For å lette en kvantitativ måling av tumor vekst GL261 celler ble gjort bioluminescent bruker Lentiphos HT System (Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA) med Lenti-X HT Packaging Mix (Clontech Laboratories, Inc.) og FUW- GL plasmid (en generøs gave fra laboratoriet av JB Rubin, MD, PhD). Celler ble opprettholdt i Dulbecco modifiserte Eagle er Medium (DMEM) med 10% tetracyklin-free kalvefoster Serum (FCS; Clontech Laboratories, Inc.). GL261 celler ble også stabilt transfektert med genet som koder luc2 bruker pGL4.51 [luc2 / CMV / Neo] vektor (Promega Corp, Madison, WI) og FuGENE 6 Transfeksjon reagens (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) følgende vilkår fastsatt av produsenten. Den luc2 genet er en kodon optimalisert versjon av Firefly luciferase som gir en betydelig høyere lysytelse enn standard luc genet. Stabil transfectants ble valgt ut og vedlikeholdes i DMEM media som inneholder 10% FCS og 100 mikrogram / ml Geneticin (G418, Invitrogen Corp, Carlsbad, California).
2. Før implantasjon av dyrkede celler høstes av trypsinzation, vasket en gang i DMEM uten serum og resuspendert i DMEM uten serum ved en konsentrasjon på 1 x 10 ⁷ celler / ml.

2. Kirurgi Oppsett ²

1. Et sterilt miljø opprettholdes gjennom hele operasjonen, inkludert alle kirurgiske instrumenter, rekvisita, hansker, gardiner, etc..
2. Ti ukers gamle C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr (albino C57BL / 6) mus er kjøpt fra National Cancer Institute ved Frederick Dyreoppdrett Program og brukes på en snittvekt på 20 gram (NCI, Frederick, MD).
3. Dyr er bedøvet ved intraperitoneal injeksjon av xylazin (5 mg / kg), ketamin (50 mg / kg) og buprenorfin (0,05 mg / kg). Tile klype gjøres for å sikre at dyret er tilstrekkelig bedøvet før operasjonen er begynt. Movement (selv om litt) av noen del av dyret er en indikasjon på en reduksjon i nivået av anestesi. Animal er umiddelbart gitt en ytterligere 3,3 mg / kg xylazin og 26,6 mg / kg ketamin. Kroppstemperatur er opprettholdt ved hjelp av en lampe og sterile bandasjer som dekker kroppen.
4. Når dyret er skikkelig bedøvet, er de plassert på puter sengen av stereotactic headframe (Modell 900 Small Animal Stereotaxic, David Kopf Instruments) [Figur 1].
5. En liten mengde (1 / 4 inch) av Akwa Tears Ophthalmic Glidemiddel salve påføres over hornhinner.
6. Dyret er sikret i stereotactic rammen ved å åpne dyrets munn (ved å plassere pekefingeren og tommelen rundt dyrets kjeve) og skyve den øverste fortennene inn innrykk i stereotactic rammen. Klemmen er strammet for å sikre dyrets hode inn i hodesettet gjør at the hode er justert og øynene er sentrert, og pass imidlertid ikke å utøve unødig kraft på dyrets hode.
7. The O ₂ Slangen er tapet nede ved dyrets nesebor. Oksygen strømningshastighet er 0,5 l / min.
8. Den nedre rygg og hale er tapet ned til stereotactic sengen være forsiktig for ikke å kompromittere respirations.
9. Den kirurgiske innsnitt området er barbert. Povidine-Jod Vattpinne Sticks brukes til å vaske området mellom øynene å gå tilbake til området mellom ørene med jod, slik at jod ikke drypper ikke inn i dyrets øyne.
10. Cellene er forberedt for implantasjon like før operasjonen, og er periodevis blandes for å sikre at de ikke bosette seg.
11. En 10 mL, er 50 mm verdenskrig Precision Instrument (WPI), Sarasota, FL, sprøyte med 26 gauge beveled nål lastet med cellen podestoff. Hvis cellene synes å være klumpet seg sammen kan det være nødvendig å laste sprøyten.
12. De 10 mL sprøyte er deretter plassert inn i UMP3-1 UltramicroPump micro injektor (WPI, Sarasota, FL).

3. Intrakraniell Implantasjon ²

1. Huden innsnitt er gjort ved hjelp av en størrelse 15 skalpell blad og tannet tang. Et 10-15 mm innsnitt er gjort lengderetningen fra mellom dyrets øyne, beveger seg mot dyrets ører utsette bregma (krysset av sagittal og koronale suturene på toppen av skallen). Pass på å riktig identifisere bregma for det kan lett forveksles med sinus område som er distalt for bregma [Figur 2].
2. Etter at dyret er bedøvet den mottar en intra-operasjonssåret injeksjon på 0,25% (2,5 mg / ml) bupivacaine.
3. En burrhole er gjort 0,1 mm posteriort for bregma og 2.3 mm til høyre for midtlinjen ved sakte å vri en 16 gauge 1 ½ tomme nål hånd, søker litt press nålen mens vri inntil skallen blir penetrert og hjernen er utsatt.
4. Sprøytespissen er flyttet ned på plass med Microdrive stereotactic sprøyte holderen til den berører akkurat hjernens overflate. Fra denne posisjonen, er nålen avanserte inn i hjernen til en dybde på 3 mm og holdes på plass i 3 minutter.
5. Nålen trekkes tilbake 0,4 mm til en total dybde på 2,6 mm under overflaten av hjernen, noe som skaper en liten lomme der cellene skal infunderes. Det er valgfritt på dette punktet for å ta en X-ray bilde av nålen i dyret for å sikre riktig plassering og dybde.
6. Cellen Fjæringen er infunderes over 3 minutter ved hjelp av mikro injektor satt til et volum på 2000 nL (2 mL) med en infusjonshastighet av 667 nL / minutt.
7. Nålen er igjen på plass i 2 minutter for å hindre lekkasje fra stedet til infusjon.
8. Nålen er sakte trukket helt.
9. Den burrhole er fylt med bein voks ved hjelp av en Penfield dissector.
10. Snittet er sutureres med en 4-0 (1,5 metriske) vicryl sutur gjør at ingen store hull er igjen i huden. Vicryl er en sutur materiale som oppløsess, og derfor suturer ikke må fjernes når såret er grodd.
11. Etter operasjonen dyrene er plassert i et bur under en varmelampe som er satt til høyden som kreves for å varme opp bunnen av buret til 30 ° C. Når dyrene er helt våken (som bedømmes av normal bevegelse i buret) de er tilbake til gruppen bolig. Oral ibuprofen er lagt til deres drikkevann i 5 dager postoperativt. 100 mg av barns ibuprofen (100mg/5mL) er lagt til en standard 473 ml gnager drikkeflaske. Dyr er observert daglig og avbildes og veide hver 3. dag. To uker etter implantasjon observasjon er økt til to ganger per dag. Dyr avlives når de viser tegn til fallende helse som inkluderer krum holdning, redusert mobilitet og synlige kroppen vekttap (≥ 20%). Disse symptomene er en publisert respons på svulsten og de reproduserbart vises ca 1 dag før død på grunn av svulsten.

Fire. In vivo 3

1. Start [levende bilde] programvare.
2. Den IVIS Imaging System er initialisert ved å klikke på [Initialiser IVIS System]-knappen nederst til høyre i kontrollpanelet.
3. Velg [Luminescent] Imaging Mode øverst til venstre side av kontrollpanelet.
4. Å fastslå den optimale tidspunktet for bildebehandling etter luciferin injeksjon en kinetisk studie er nødvendig [Figur 3]. Denne beskrivelsen er for Firefly luciferase;
   1. Injiser 10μl / g kroppsvekt av D-luciferin ildflue (15mg/ml i PBS, Caliper Life Sciences Catalog XR-1001 eller et lignende produkt fra en annen leverandør) i dyret, som beskrevet nedenfor.
   2. Vent 3 minutter, og deretter anesthetize musen ved å plassere den inn i gass anestesi kammeret (2% isofluran gass i O _2).
   3. Slå av gassen anestesi til kammeret og åpne anestesi ventil og vakuum til IVIS manifold. Umiddelbart plassere bedøvet dyretpå temperaturstyrt bildebehandling plattform, noe som gjør at musens nesebor er riktig plassert i gassen anestesi manifold. Det første bildet bør tas omtrent 5 minutter etter luciferin injeksjon. Opp til 5 dyr kan avbildes på en gang i IVIS Spectrum instrument. Hvis mindre enn 5 dyr skal avbildes, er det mulig å plugge ubrukte manifold (s) for å spare på isofluran gass.
   4. Fortsett å ta bilder hvert 3. minutt ved å opprette en sekvens for opptil en time å generere en kinetiske kurve for luciferin uttrykk.
      1. Klikk på [Sequence Setup]-knappen i kontrollpanelet.
      2. Sekvensen editoren vises.
      3. I kontrollpanelet, angir innstillingene for den første bioluminescent bildet i sekvensen.
         1. Vi anbefaler at du starter med Medium Binning.
         2. Vi anbefaler også auto-eksponering til å bestemme optimal eksponering tid.
         3. Velg [Delay] knappen i sekvensen editor ennd angi en forsinkelse på 3 minutter mellom hvert kjøp.
      4. Klikk på [Add] i sekvensen editor. Oppkjøp parametere blir deretter lagt til i tabellen.
      5. Gjenta trinn 4 for hvert bilde i sekvensen.
   5. Når kurven er etablert, kan det optimale tenkelig tidspunkt bestemmes ved å plotte signalstyrken (intensitet) versus tid. Bilde dyr ved høyeste in vivo foton telle for å få den sterkeste og mest nøyaktige signal.
5. Tidlige eksperimenter brukes intraperitoneal (ip) injeksjon av luciferin imidlertid ip injeksjoner tidvis resulterte i intermitterende resultater som viser liten eller ingen bioluminesens i svulsten. Vi hypotesen om at en og annen tilfeldig mangel på signal skyldes levering av luciferin til tarmen eller andre indre organer. Vi begynte derfor å bruke subkutan (sc) luciferin injeksjoner og så større bildebehandling reproduserbarhet [Figur 3].
6. Tjueminutter etter sc injeksjon, dyrene bedøves ved å plassere dem i et kammer med 2% isofluran gass i O ₂ inntil de reagerer.
7. Den bedøvet dyret (e) er flyttet til bildebehandling kammeret. Ophthalmic salve bør brukes for den kinetiske studien på grunn av lengden på bildebehandling. Det er ikke nødvendig for de andre bildebehandlingsprogrammer prosedyrer fordi de er korte i varighet.
8. Bildet er kjøpt til medium Binning med en 5 minutters eksponeringstid. Den automatiske Oppkjøpet alternativet kan også brukes.
9. Hvis signalet er mettet og / eller besvime på middels Binning, kan Binning eller eksponeringstid justeres.
10. Programfilene og påfølgende image kommentarer lagres i brukerens datamaskin katalog.

5. 3D Imaging ³

1. Klikk på [Imaging Wizard]-kategorien i [Sequence Setup]-vinduet på kontrollpanelet.
2. Velg [bioluminesens] bildemodus på Imaging Wizard start skjermen og clICK [Neste].
3. I "bioluminesens - DLIT" vinduet på bildebehandling veiviseren, velg [Firefly] reporter probe. Utslipp / eksitasjon av den valgte ildfluen kilden spektrum vises med de seks tilsvarende filter valgene skal anskaffes.
4. Den siste skjermen vises med standard valg som inkluderer Auto eksponering oppkjøp parametre og en av Field of View C. Standardinnstillinger fungerer veldig bra, men kan disse innstillingene endres hvis nødvendig.
5. Klikk på [Next] og sekvensen editor vinduet vil være befolket med rekkefølgen av seks spektral regioner ved 20 nm bred filtre (560 nm, 580 nm, 600nm, 620 nm, 640 nm, og 660nm). Trykk [Acquire Sequence]. Det første filteret (560 nm) vil inneholde en strukturert lys mønster ved hjelp av en laser galvanometer å etablere overflate topografi.
6. Velg [overflatetopografien] fane i verktøypaletten. Surface glatting kan brukes til å ta hensyn til eventuelle skarpe vinkler opprettet under gjenoppbyggingen. Detdefault lav glatting anbefales.
7. Klikk på [Opprett] og tomografi analyse boksen vises. Tegn en avling boks som inneholder hele dyret og klikk [Neste].
8. Terskelen verktøyet vil fremstå som en lilla maske over den valgte regionen. Masken skal automatisk settes til matche bildet av dyret. Om nødvendig, justere terskelen masken til mer hensiktsmessig passe omrisset av dyret.
9. Klikk på [Finish] og den rekonstruerte mesh vises. Gjenoppbyggingen kan deretter lagres i resultatene kategorien.
10. Etter etableringen av dyrets overflate topografi, går du videre til [DLIT 3D Rekonstruksjon] falle ned på verktøypaletten.
11. Under [Analyser]-kategorien velger alle seks bølgelengder for å utføre gjenoppbygging. Opphev bilder som ga mettet piksler eller teller under 600. La innstillingene i [parametere] kategorien som standard.
12. Under [Egenskaper]-kategorien, bør "Muscle" være oppført som standard valg forr Tissue Properties, og "Firefly" bør være oppført som kilde spekteret.
13. Klikk på [rekonstruere] under kategorien Analyser og 3D rekonstruksjon av dyrets overflate og tilsvarende rekonstruksjon av signalkilde skal vises [Figur 4].
14. Å bestemme signal plassering og intensitet, velg Voxels knappen på 3D Tools kategorien verktøypaletten.
    1. Tegn en firkant rundt alle vist voxels og den totale flux målinger er vist i bunnen av volumet kategorien.
    2. Klikk på [Center of Mass] for å identifisere signalet plasseringen av den valgte voxels. Coronal, sagittal og transaxial skiver av dyret vises og bruker [Measurement Cursor Display] avstand fra dyrets overflate til voxel sentrum kan måles.
15. Vennligst henvis til levende bilde Software brukerhåndboken for ytterligere informasjon om co-registrering av orgel atlas og andre avanserte funksjoner.

Seks. Data Analysis ³

1. Etter at bildet er ervervet og lagret, tilgang til programmet filen ved å klikke på [Browse] knappen og velge filen.
2. Bildet informasjon finnes under [Vis] → [Image Information].
3. Intensiteten på signalet kan kvantifiseres ved å velge Region Of Interest (ROI) [ROI Tools]-knappen. Pass på at bildet er analysert under [Photon]-modus ved å velge "Photon" på rullegardinmenyen øverst til venstre hjørne av bildet kontrollpanelet.
4. Velg [Measurement ROI] knappen fra "Type" drop-down listen. Velg ROI form av interesse; alternativene inkluderer sirkel, firkant, og eller Grid. Dekker alle områder av intensitet på de oppkjøpte bildet.
5. ROI Stillingen er satt ved å dra ROI formen valget til regionen som inneholder bioluminescent signal.
6. Signalet intensiteten av avkastningen beregnes ved å klikke på [Mål]-knappen. ROI etiketten viser intensitet. ROI er kan administreres og lagres USIng the Living Bilde programvare.

7. Representant Resultater:

Vellykket celle implantasjon er tydelig når implantert celler kan påvises ved hjelp av IVIS spekteret på dagen for operasjonen. Både GL261-luc og GL261-luc2 celler kan påvises, vil imidlertid luc2 genet gir en høyere grad av bioluminesens [Figur 5]. Bilder tatt kort tid etter implantering kan ha uspesifikke signalering på dyrets poter og nese som bør ses bort fra som bakgrunn. Signal ligger på implantasjonsstedet er reell, og signalet vil øke med tiden [Figur 6]. Nedgangen i signal intensitet på dag 6 er reproduserbare og mest sannsynlig på grunn av tap av tumor ta av noen av de implanterte cellene. Kvantitative målinger av tumormasser er reproduserbare i at de skal stige jevnt fram til dyret til slutt bukker under for sykdommen. Imidlertid vil vekstkurver stor grad avhenge av staten implantert celler, og eller uunngåelig mindre var iability i implantasjon prosedyren. Vårt laboratorium har valgt å image implantert dyr hver tredje dag.

Figur 1. Etter at musen er ordentlig bedøvet, er det plassert i stereotactic rammen. Musen hodet er sikret ved hjelp av munnen klemmen.

Figur 2. Etter at huden er åpnet viktigste anatomiske landemerkene er identifisert blant annet inkluderer bregma, den koronale og sagittal suturer. Den burrhole er laget 2.3mm til høyre for bregma ved sakte å vri en 16 gauge 1 ½ tommers nålen med en liten mengde av trykket inntil skallen blir penetrert og hjernen er utsatt.

Figur 3. En kinetisk sammenligning av subkutan (iles/ftp_upload/3403/3403fig3_1.jpg "alt =" Figure3.1 "/>) versus intraperitoneal ( ) Luciferin injeksjon ble utført for å demonstrere nytten av en subkutan luciferin injeksjon og for å finne det optimale tidspunktet for å image etter luciferin administrasjon. Tre minutter etter at luciferin ble injisert i mus ble bedøvet, plassert i IVIS Spectrum instrumentet og avbildes hvert 3. minutt i opptil en time og hver 6 minutter etter at å generere en kinetisk kurve bioluminesens. Dette viste at et subkutant av luciferin administrasjon var overlegen en intraperitoneal injeksjon i våre hender, og at det optimale tidspunktet for å image dyrene ble ca 25 minutter etter luciferin injeksjon GL261-luc celler ble brukt.

Figur 4. Flere visninger av en 3-Dimensional reconstruction av intrakranielle implantasjon av GL261-luc2 celler co-registrert med musen skjelettet og hjernen.

Figur 5. Photon teller innhentet fra svulster som skyldes GL261-luc celler vs GL261-luc2 celler. Resultatene er et gjennomsnitt på 5 dyr.

Figur 6. Graf for GL261-luc tumor cellevekst i en albino C57BL / 6 mus. Bioluminesens ble målt hver 3 dager, og plottet som in vivo foton telle versus dager etter implantasjon. Fotografier viser bioluminesens på ulike tidspunkter. Fargen er en indikasjon på bioluminesens (pikselintensiteten) som er i forhold til tumor celle nummer (farge bar er vist til høyre). Etter at dyret bukket under for sykdommen hjernen ble dissekert og luciferin ble lagt topically å få ex vivo forestillee vist i figuren innsatte.

Discussion

Cellen podestoff er tilført på en dybde på 2,6 mm fra overflaten av hjernen etter å skape en 0,4 mm lomme. For å sikre riktig plassering og dybde på nål en X-ray kan tas ved hjelp av en C-arm eller lignende X-ray image intensiverer enhet, men dette er valgfritt. Komplikasjoner av operasjonen kan oppstå hvis dyret ikke er ordentlig bedøvet, noe som medførte at dyret kan bevege seg under celle infusjon. Dette kan føre til lekkasje av celle mix eller blødning fra nål spor. Lekkasje av celler årsakene ektopisk vekst av kreftceller. Det er også viktig å ikke punktere ventrikkelen som kan gjøres hvis burrhole gjøres medialt til 2,3 mm er beskrevet i protokollen ^fire. Riktig plassering av nålen og celle spre ble testet av infusjonen en mus med 2 mL metylenblått fargestoff og dissekere hjernevevet å kontrollere plasseringen av infunderes fargestoff.

I denne protokollen har vi brukt IVIS Spectrum in vivo imaging system og than levende bilde software (v 4.0) designet for bruk med dette instrumentet. (Caliper Life Sciences). Eventuelle sammenlignbare in vivo imaging system og bildeanalyse verktøy kan brukes til å oppnå lignende resultater. Disse systemene gir noen fordeler fremfor tradisjonelle magnetic resonance imaging (MRI) for å følge utviklingen av en eksperimentell intrakranial tumor. Den mest åpenbare er de relative kostnadene av to instrumenter - dyr MR-maskiner er langt dyrere og vanligvis krever tjenester av en dyktig MR tekniker. In vivo avbildning slik som det som ble beskrevet her kan gjøres av sluttbrukeren. Den bioluminesens data er kvantitativ, mens kvantifisering av MRI data er tidkrevende og noe unøyaktig. Videre MR bildene viser ødem og inflammasjon i tillegg til kreftceller og det kan være vanskelig å skille tumor fra behandlingseffekt. Av disse grunner å skaffe nøyaktige volumetriske målinger av voksende tumor kan være en utfordring. Bioluminesens krever ATPDerfor eneste levende kreftceller bidra til svulsten størrelse data. Til tross for dette, er det noen fordeler til MR hvis en maskin er tilgjengelig. Celler trenger ikke å være merket med en bioluminescent markør for å bli visualisert ved MRI. Evnen til å visualisere peri-tumoral ødem kan være en fordel for noen eksperimentelle protokoller. En styrke for begge teknologiene er at bruker man ikke utelukker bruk av den andre, slik at data kan hentes på veksten av svulsten samt tilstedeværelse av peri-tumoral ødem og inflammasjon fra samme dyr når begge teknologiene er tilgjengelig til forskeren.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GL261-luc2 Bioware Ultra	Caliper Life Sciences	GL261-luc2
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Invitrogen	10313039
Geneticin (G418)	GIBCO, by Life Technologies	11811-023
Fetal Calf Serum (FCS)	Invitrogen	26140079
Phospate Buffered Saline (PBS)	Invitrogen	70011044
C57BL/6-cBrd/cBrd/Cr Mice	National Cancer Institute
AKWA Tears Lubricant Opthalmic Ointment	Akorn Inc	17478-062-35
Ketaset (ketamine hydrochloride)	Wyeth Animal Health	11570775
Sedazine (xylazine hydrochloride)	Wyeth Animal Health	10031894
Small Animal Stereotaxic Instrument	Kopf Instruments	900
UltraMicroPump with SYS-Micro4 Controller	World Precision Instruments, Inc.	UMP3-1	If not available, it is possible to infuse manually
10μl syringe with 26 gauge beveled needle	World Precision Instruments, Inc.	SGE010RNS
Adison Forceps	World Precision Instruments, Inc.	500092
Penfield Dissector	Codman	65-1015
16g 1½ Precision Glide Needle	BD Biosciences	305198
Surgical Blade Handle	BD Biosciences	371030
Size 15 Blade	BD Biosciences	371315
4-0 Vicryl Suture	Ethicon Inc.	VCP496G
Bone Wax	Medline Industries	DYNJBW25
Povidine-Iodine Swab Sticks	Medline Industries	MD93901
D-Luciferin Potassium Salt	Caliper Life Sciences	122796
Forane (Isoflurane)	Baxter Internationl Inc.	1001936060
OPMI Pentero Microscope	Carl Zeiss, Inc.		Any surgical microscope will suffice
Xenogen IVIS Spectrum with optional anesthesia system	Caliper Life Sciences